Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie żywotnych pierwotnych kardiomiocytów dorosłych myszy do hodowli i transdukcji wektora adenowirusowego. Metoda ta odpowie na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych. W szczególności możemy dostosować to, co uniemożliwia kardiomiocytom dorosłych ssaków wejście i zakończenie cyklu komórkowego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać wysoki plon żywotnych kardiomiocytów dorosłych myszy do długotrwałej hodowli. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ zabiegi ekstrakcji serca i kaniulacji są trudne, ale muszą być wykonane szybko i sprawnie. Aby usunąć serce, zacznij od potraktowania dorosłej myszy pięcioma jednostkami międzynarodowymi heparyny na gram masy ciała przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.

Odczekaj 20 minut, aby heparyna zaczęła krążyć do serca. Następnie, po podaniu znieczulenia, należy potwierdzić brak reakcji na szczypanie palców u nóg i odruchy rogówkowe oraz przykleić kończyny zwierzęcia do platformy chirurgicznej. Wysterylizuj obszar nacięcia, obficie nakładając 70 procent etynolu, a następnie osusz włosy chusteczką laboratoryjną.

Następnie za pomocą kleszczy unieś skórę tuż pod mostkiem i wykonaj boczne nacięcie przez skórę i otrzewną. Następnie, za pomocą hemostatów, delikatnie unieś klatkę piersiową przez mostek i użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby przedłużyć nacięcie w kształcie litery V w kierunku osiowym. Przetnij pierwsze żebro i przebij przeponę z każdej strony, utrzymując klatkę piersiową uniesioną wraz z hemostatykami.

Używając małych nożyczek do irysa, całkowicie przetransektuj membranę. Następnie użyj hemostatów, aby cofnąć klatkę piersiową rostralnie i szybko, ale ostrożnie przedłuż nacięcie przez klatkę piersiową w kierunku osiowym po obu stronach. Całkowicie cofnij środkową część klatki piersiowej, kładąc przyczepione hemostatyki, aby utrzymać tkankę na miejscu, i usuń osierdzie drobnymi kleszkami.

Następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie podnieść serce i przeciąć przyczepione żyły i tętnice. Umyj serce w lodowatym buforze perfuzyjnym, a następnie przenieś serce na mały kawałek siatki o grubości 215 mikronów. Dodaj lodowaty bufor perfuzyjny, aby spowolnić skurcze mięśnia sercowego, i umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym.

Za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki przytnij wszelkie dostępne tkanki niezwiązane z sercem. Następnie przeciąć aortę w pobliżu tętnicy ramienno-głowowej, uważając, aby pęcherzyki lub resztki tkanki nie dostały się do otworu. Aby dokonać kaniulacji serca, napełnij szalkę Petriego lodowatym buforem perfuzyjnym, aż roztwór wzrośnie ponad otwór kaniuli o rozmiarze 18.

Następnie, trzymając końcówkę kaniuli i aorty poniżej powierzchni bufora, osłonić aortę na kaniuli, aż końcówka igły znajdzie się dystalnie do zastawki aortalnej. Wsuń wstępnie zawiązany jedwabny szew 7-0 w dół trzonu igły do kaniulacji, aż szew znajdzie się tuż nad końcówką igły i zaciśnij węzeł cienkimi kleszkami. Umieść drugi szew tuż nad pierwszym.

Następnie powoli wciskaj strzykawkę, aż 0,5 mililitra buforu perfuzyjnego zostanie wstrzyknięte przez naczynia wieńcowe. Po wyjęciu strzykawki przymocuj kaniulę do portu wylotowego perfuzji. Pod koniec perfuzji użyj kleszczy, aby usunąć serce z kaniuli i umieść serce na pustej szalce Petriego.

Używając cienkich nożyczek do tęczówki, szybko przytnij dodatkową tkankę komorową i umyj komory na nowej szalce Petriego zawierającej bufor perfuzyjny. Po umyciu przenieś komory na suchą szalkę Petriego i umieść w sterylnym kapturze. Zbierz 7,5 mililitra buforu wytrawiającego z płaszcza grzewczego systemu perfuzyjnego i dodaj 2,8 mikrolitra jednego molowego chlorku wapnia.

Wymieszaj roztwór przez odwrócenie. A następnie dodaj dwa do trzech mililitrów buforu trawiennego uzupełnionego chlorkiem wapnia do komór. Za pomocą cienkich kleszczy szybko przetrzyj tkankę komorową, aż większość kawałków będzie mniejsza niż jeden milimetr sześcienny, a następnie dodaj pozostały bufor trawienny uzupełniony chlorkiem wapnia do zdysocjowanych tkanek.

Wymieszaj fragmenty przez delikatne mieszanie. I inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla, ciągnąc mieszanie co dwie minuty, aż zostanie uwolniona wystarczająca liczba kardiomiocytów. Następnie umieść naczynie z powrotem w okapie z przepływem laminarnym i użyj pipety do przenoszenia, aby delikatnie zdysocjować tkankę.

Zakładając sterylne rękawice, złóż siatkę o grubości 215 mikronów w stożek i przytrzymaj ją nad stożkową rurką o pojemności 50 mililitrów. Odpipetować zawiesinę tkanki na siatkę i pozwolić, aby filtrat spłynął do probówki. Następnie przemyć 7,5 mililitra wstępnie podgrzanego buforu zatrzymującego.

Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej o pojemności 15 mililitrów i pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie przez 15 minut. Następnie użyj nowej pipety transferowej, aby ostrożnie usunąć supernatant, aż nad komórkami pozostanie tylko 50 do 100 mikrolitrów roztworu. Dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanej zrównoważonej pożywki hodowlanej do komórek i wymieszaj przez delikatną inwersję.

Na koniec, po kolejnych 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej, użyj nowej pipety transferowej, aby usunąć supernatant z osadzonych komórek, aż pozostanie tylko 50 do 100 mikrolitrów pożywki. Bezpośrednio po izolacji kardiomiocyty zachowują przeważnie kształt pręcika z nienaruszonymi sarkomerami i ostrą błoną zewnętrzną w jasnym oświetleniu polem. Barwienie immunologiczne markerów sarkomerowych specyficznych dla kardiomiocytów, takich jak alfa aktynina, ujawnia wyraźny wzór pasm sarkomerowych.

Po kilku dniach w hodowli kardiomiocyty przyjmują zaokrągloną morfologię. W ciągu jednego do dwóch tygodni żywe kardiomiocyty przyczepiają się do podłoża i zaczynają się rozprzestrzeniać. Transdukcja adenowirusem, obserwowana w tych kardiomiocytach z dodatnim wynikiem GFP, może być stosowana w celu uzyskania silnej ekspresji genu w ciągu 48 do 72 godzin.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o uzyskaniu bezpiecznej kaniulacji, która jest wolna od pęcherzyków powietrza, aby skutecznie obficie nasycić naczynia wieńcowe. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie immunologiczne lub obrazowanie na żywo, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak: dlaczego kardiomiocyty dorosłych ssaków są odporne na podział komórek?

Nie zapominaj, że praca z adenowirusem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności, takich jak praca w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej.