Name: Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu ksenotransplantatu raka prostaty u myszy. Technika ta umożliwia badanie molekularnych mechanizmów rozwoju guza pierwotnego oraz wczesnych faz przerzutowania, wspierając prekliniczną ocenę nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. Rogerowi Ericksonowi za wsparcie i pomoc w przygotowaniu manuskryptu. Praca ta była wspierana przez National Cancer Institute w National Institutes of Health poprzez granty o numerach RO1CA160079, RO1CA138642, UO1CA184966 i projekt finansowany przez VA numer 1P1 BX001604.

Protokoły dla wszystkich procedur z udziałem zwierząt muszą być sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Przestrzegać urzędowo zatwierdzonych procedur dotyczących opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Iniekcja dogruczołowa gruczołu krokowego wymaga operacji na otwartej jamie brzusznej, a zwierzęta powinny być trzymane w środowisku wolnym od patogenów z wyznaczoną salą operacyjną, w której podczas całego zabiegu stosuje się odpowiednie chirurgiczne techniki aseptyki.
1. Przygotowanie komórek do implantacji
UWAGA: W zależności od potrzeb badawczych, można użyć dowolnej linii komórkowej raka prostaty. Linie komórkowe są hodowane zgodnie z instrukcjami dostawcy.
<ol>
	<li>Dla linii komórkowej PC3M-Luc-C6, która stabilnie wyraża gen lucyferazy świetlika, hoduj komórki w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1x aminokwasami endogennymi, 1x Fleomycyną D1 i 1mM pirogronianem sodu. Utrzymuj komórki w inkubatorze z nawilżoną atmosferą składającą się w 95% z powietrza i 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Komórki PC3M-Luc-C6 zostały pozyskane z głównego zakładu UCSF.</li>
	<li>Zbieraj komórki przez trypsynizację. Płytki hodowlane należy raz przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodać 2 ml 0,05% trypsyny do 10 cm naczynia i inkubować przez 3-5 minut w inkubatorze z nawilżoną atmosferą 95% powietrza i 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą.
	<ol>
		<li>Aby uniknąć zbrylania się, nie mieszaj komórek, uderzając lub potrząsając naczyniem w oczekiwaniu, aż komórki się oderwą. Zebrać komórki w 5 ml kompletnej pożywki i wirować przez 5 minut w temperaturze 200 x g. Umyj osad komórkowy PBS, aby usunąć trypsynę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlicz żywe komórki za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek w PBS z 10 μl 0,4% (wag./v) roztworu błękitu trypanowego. Załaduj mieszaninę do hemocytometru lub szkiełka z komorą zliczającą i policz komórki natychmiast pod mikroskopem lub odczytaj szkiełko komory w liczniku komórek.
	<ol>
		<li>Przygotować zawiesinę komórek zawierającą 2,5 x 105 komórek w pożywce o objętości 10 μl. Wymieszać zawiesinę komórkową z 10 μl ekstraktu z błony podstawnej przypominającego błonę zewnątrzkomórkową i umieścić komórki na lodzie. Dodać lucyferynę do zawiesiny komórkowej (1:200 μl; stężenie podstawowe 30 mg/ml) przed wstrzyknięciem myszom. 
		UWAGA: Pozwala to na natychmiastowe obrazowanie biologiczne zwierząt w celu sprawdzenia spójności wstrzyknięć komórek między różnymi grupami eksperymentalnymi. Wstrzyknij komórki tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w ciągu 30 minut po trypsynizacji, ponieważ żywotność komórek gwałtownie spada po oderwaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
	<li>Wykonuj operację w uporządkowanym, zdezynfekowanym obszarze, który sprzyja aseptyce.</li>
	<li>Przed zabiegiem zdezynfekuj ladę/stół laboratoryjny roztworem wybielacza. 
	UWAGA: Spożywanie alkoholu jest odradzane ze względu na długi czas kontaktu wymagany do zadziałania (15 min).</li>
	<li>Używaj sterylnych obłożeń, czyść wchłanialne podpaski lub ręczniki i wymieniaj te materiały po każdej sesji chirurgicznej. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed użyciem. Preferowane metody to autoklaw parowy, sterylizator z kulkami szklanymi, sterylizacja gazowym tlenkiem etylenu lub nadtlenkiem wodoru.</li>
	<li>Do przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego należy użyć aseptycznego mikroskopu preparacyjnego lub doświadczonych badaczy można go wykonać bez mikroskopu.</li>
</ol>
3. Implantacja komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Użyj samców myszy Balb/c lub NOD/SCID w wieku 6-8 tygodni z obniżoną odpornością. 
	UWAGA: Trudniej jest operować na mniejszych zwierzętach, a większe zwierzęta mają zwykle wolniejszą kinetykę wzrostu guza i przerzutów.</li>
	<li>Wstrzyknij przedoperacyjne leki przeciwbólowe zgodnie z instrukcjami placówki dla zwierząt. Na przykład można stosować buprenorfinę podawaną dootrzewnowo w dawce 0,1 mg/kg masy ciała.</li>
	<li>Znieczulaj zwierzęta, umieszczając je w komorze izofluranu z 1-3% izofluranem w tlenie i poczekaj, aż zwierzęta zostaną w pełni znieczulone. Upewnij się, że w tym momencie nie ma odruchu napięcia mięśniowego u nóg. Używaj odpowiedniego smaru do maści weterynaryjnych do okulistyki, aby zapobiec ślepocie z powodu kseroftalmii podczas znieczulenia ogólnego. 
	UWAGA: Znieczulić zwierzęta metodą preferowaną przez badacza, np. w przypadku sodu pentobarbitalowego podaje się 0,05 mg na gram masy ciała dootrzewnowo lub roztwór ketaminy/ksylazyny (stężenie: 17,16 mg/ml) w dawce 65 mg/kg masy ciała stosuje się podskórnie. Inhalacja izofluranem jest preferowaną metodą znieczulenia. Maść do oczu należy nakładać delikatnie, bez pocierania rogówki.</li>
	<li>Wyjąć zwierzę z komory izofluranu i umieścić je w aparacie stożkowym nosowym z ciągłym przepływem 1-2% izofluranu w tlenie, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełnej narkozie przed kontynuowaniem.
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem zabiegu usuń sierść myszy przez golenie lub użyj kremu do depilacji. 
		UWAGA: Podczas operacji lepiej byłoby umieścić mysz na sterylnej poduszce grzewczej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej. Oczyść dolną część brzucha 10% w/w roztworem jodu powidonu, a następnie 70% wacikami etanolowymi.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy podnieś obszar skóry 2 mm powyżej gruczołu napletkowego, około 1-2 cm powyżej osłonki penisa i około 2-3 cm poniżej dolnej części klatki piersiowej.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 1 cm, najpierw przez skórę skalpelem, a następnie przez warstwę mięśniową nożyczkami (ryc. 1).</li>
	<li>Zlokalizuj pęcherz moczowy w jamie ciała. Jest to żółto-jasnobrązowy narząd kulisty, znajdujący się bezpośrednio pod nacięciem (ryc. 1).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy chwyć pęcherz moczowy i unieś go w górę, a następnie w dół z jamy ciała w kierunku osłonki penisa. Spowoduje to odsłonięcie dwóch pęcherzyków nasiennych, które są parą białych narządów przypominających woreczki i wyraźnie się różnią.</li>
	<li>Trzymając bawełniany wacik w każdej ręce, uzewnętrznij pęcherzyki nasienne, jeden po drugim, wyciągnij je z jamy ciała i połóż je twarzą w dół na zewnętrznej powierzchni brzucha z pęcherzem pośrodku (ryc. 2).</li>
	<li>Za pomocą bawełnianych wacików delikatnie odchyl pęcherzyki nasienne do tyłu w miejscu wprowadzenia w pobliżu szyi pęcherza moczowego, w kierunku osłonki prącia, tak aby dwa grzbietowe płaty prostaty były wyraźnie widoczne. Użyj mokrych bawełnianych wacików, aby uniknąć uszkodzenia tkanek (ryc. 3).</li>
	<li>Wstrząsnąć zawiesiną komórek za pomocą mikropipety przed włożeniem do strzykawki.</li>
	<li>Umieszczając pęcherzyki nasienne w odpowiedniej pozycji za pomocą wacika, włóż igłę strzykawki do grzbietowego płata gruczołu krokowego pod mikroskopem (ryc. 4). Powoli wstrzykiwać 20 μl zawiesiny komórkowej, aż do zidentyfikowania tworzenia się pęcherza. Wybrzuszony pęcherz wskazuje, że wstrzyknięcie jest prawidłowe.</li>
	<li>Podczas wsuwania igły należy lekko przycisnąć miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem i przytrzymać przez kilka sekund, aby zapobiec wyciekowi.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś pęcherzyki nasienne wacikami i włóż je z powrotem do jamy ciała, jeden po drugim, a następnie do pęcherza. Unikaj "kręcenia" narządów wewnętrznych podczas wykonywania tej procedury.</li>
	<li>Po umieszczeniu narządów z powrotem w jamie ciała, najpierw zszyj warstwę mięśniową w przerywany wzór za pomocą wchłanialnych chromowych szwów katgutowych 4-0, a następnie zamknij skórę niewchłanialnym nylonowym szwem chirurgicznym 4-0. Skórę można również ściągnąć i zamknąć za pomocą klamer chirurgicznych, aby całkowicie zamknąć nacięcie. 
	UWAGA: Myszy mają zwyczaj drapania i gryzienia rany, co może prowadzić do ponownego otwarcia rany, dlatego wraz ze szwami zaleca się również stosowanie kleju tkankowego. Natychmiast zobrazuj zwierzęta, aby upewnić się, że intensywność bioluminescencji jest równa we wszystkich grupach eksperymentalnych.</li>
	<li>Umieść zwierzęta z powrotem w czystych klatkach i trzymaj je pod lampą grzewczą lub poduszką grzewczą. Stale monitoruj zwierzęta, aż całkowicie wyzdrowieją ze znieczulenia i utrzymają pozycję leżącą mostka.</li>
</ol>
4. Monitorowanie zwierząt
<ol>
	<li>Monitoruj zwierzęta regularnie aż do zakończenia eksperymentu, zgodnie z protokołami instytucjonalnymi. Jeśli używasz metalowych klipsów chirurgicznych, usuń je po jednym do dwóch tygodni. Czas trwania eksperymentu zależy od konkretnej potrzeby badawczej. 
	UWAGA: Ten eksperyment był prowadzony przez 21 dni w celu zbadania pomyślnego ustanowienia wszczepionych komórek rakowych w prostacie myszy.</li>
	<li>Podawaj leki przeciwbólowe zgodnie z instrukcjami zakładu dla zwierząt. Na przykład buprenorfinę podawaną dootrzewnowo w dawce 0,1 mg/kg masy ciała można stosować w czasie zabiegu z drugą dawką po 6 godzinach i dodatkowymi dawkami co 8-12 godzin w razie potrzeby.</li>
	<li>Monitoruj masę ciała zwierząt, spożycie pokarmu, kolor i teksturę skóry, aktywność i częstotliwość oddawania moczu i kału. Poddaj zwierzęta eutanazji natychmiast, jeśli nastąpi znaczna utrata masy ciała większa niż 15%.
	<ol>
		<li>W przypadku eutanazji należy dostarczyć CO2 ze zbiornika ciśnieniowego do niezatłoczonej klatki z natężeniem przepływu, aby przemieścić 10-30% objętości komory lub klatki na minutę, umożliwiając powolne wnikanie CO2 do komory, tak aby utrata przytomności i całkowita narkotyzacja nastąpiły przed śmiercią.</li>
		<li>Utrzymać przepływ CO2 przez co najmniej jedną minutę po zatrzymaniu oddechu i pozostawić zwierzęta w komorze na wystarczająco długo, aby śmierć nastąpiła przed zastosowaniem metody fizycznej.</li>
		<li>Przeprowadzić dekapitację, zwichnięcie szyjki macicy lub jakąkolwiek inną metodę fizyczną zatwierdzoną przez IACUC po chemicznej eutanazji zwierząt. 
		UWAGA: Znacznie zmniejszona masa ciała często wskazuje na stan letargu. Zwierzęta z nowotworami powinny być w dobrym zdrowiu, z wyjątkiem obecności guzów do końca eksperymentu. Eutanazja powinna być zgodna z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji i musi być wymieniona w zatwierdzonym protokole IACUC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Nieinwazyjne bioobrazowanie zwierząt
<ol>
	<li>Monitoruj zwierzęta co tydzień za pomocą nieinwazyjnej techniki obrazowania, aby śledzić kolonizację komórek rakowych, wzrost guza i wszelkie odległe przerzuty. 
	UWAGA: Metody obrazowania, takie jak obrazowanie GFP, obrazowanie lucyferazy, promieniowanie rentgenowskie lub mikrotomografia komputerowa 3D (uCT) itp., mogą być stosowane w zależności od konkretnej potrzeby badawczej12-15.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Andrieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+confers+resistance+to+androgen+ablation+and+chemotherapy+in+prostate+cancer+cells+through+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 confers resistance to androgen ablation and chemotherapy in prostate cancer cells through eIF4E.</a> Oncogene. 29 (13), 1883-1896 (2010).</li>
<li>Fusi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+options+in+hormone-refractory+metastatic+prostate+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">Treatment options in hormone-refractory metastatic prostate carcinoma.</a> Tumori. 90 (6), 535-546 (2004).</li>
<li>Hughes, C., Murphy, A., Martin, C., Sheils, O., O'Leary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathology+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathology of prostate cancer.</a> J Clin Pathol. 58 (7), 673-684 (2005).</li>
<li>Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+murine+model+of+human+prostate+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (79), e50873(2013).</li>
<li>Pettaway, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+highly+metastatic+variants+of+different+human+prostatic+carcinomas+using+orthotopic+implantation+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selection of highly metastatic variants of different human prostatic carcinomas using orthotopic implantation in nude mice.</a> Clin Cancer Res. 2 (9), 1627-1636 (1996).</li>
<li>Rembrink, K., Romijn, J. C., van der Kwast, T. H., Rubben, H., Schroder, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+of+human+prostate+cancer+cell+lines%3A+a+clinically+relevant+animal+model+for+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation of human prostate cancer cell lines: a clinically relevant animal model for metastatic prostate cancer.</a> Prostate. 31 (3), 168-174 (1997).</li>
<li>Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+epidermal+growth+factor+receptor+signaling+in+tumor+cells+and+tumor-associated+endothelial+cells+for+therapy+of+androgen-independent+human+prostate+cancer+growing+in+the+bone+of+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Blockade of epidermal growth factor receptor signaling in tumor cells and tumor-associated endothelial cells for therapy of androgen-independent human prostate cancer growing in the bone of nude mice.</a> Clin Cancer Res. 9 (3), 1200-1210 (2003).</li>
<li>Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+platelet-derived+growth+factor+receptor+on+endothelial+cells+of+multidrug-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Targeting platelet-derived growth factor receptor on endothelial cells of multidrug-resistant prostate cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 98 (11), 783-793 (2006).</li>
<li>Park, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SRC+family+kinases+inhibits+growth+and+lymph+node+metastases+of+prostate+cancer+in+an+orthotopic+nude+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting SRC family kinases inhibits growth and lymph node metastases of prostate cancer in an orthotopic nude mouse model.</a> Cancer Res. 68 (9), 3323-3333 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFAP-110+is+overexpressed+in+prostate+cancer+and+contributes+to+tumorigenic+growth+by+regulating+focal+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">AFAP-110 is overexpressed in prostate cancer and contributes to tumorigenic growth by regulating focal contacts.</a> J Clin Invest. 117 (10), 2962-2973 (2007).</li>
<li>Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+mouse+models+of+human+prostate+cancer+and+their+utility+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery.</a> Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14, Unit 14.15(2010).</li>
<li>Johnson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+live+animal+micro-CT+allows+for+quantitative+analysis+of+tumor-induced+bone+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Longitudinal live animal micro-CT allows for quantitative analysis of tumor-induced bone destruction.</a> Bone. 48 (1), 141-151 (2011).</li>
<li>Steinbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo%2C+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin Exp Metastasis. 20 (2), 135-141 (2003).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+orthotopic+bone+metastasis+model+of+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer.</a> Cancer Res. 59 (4), 781-786 (1999).</li>
<li>Stephenson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+model+for+human+prostate+cancer+using+orthotopic+implantation+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 84 (12), 951-957 (1992).</li>
<li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+metastatic+mouse+models+for+anticancer+drug+discovery+and+evaluation%3A+a+bridge+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+New+Drugs%22%5BJournal%5D)">Orthotopic metastatic mouse models for anticancer drug discovery and evaluation: a bridge to the clinic.</a> Invest New Drugs. 17 (4), 343-359 (1999).</li>
<li>Wang, X., An, Z., Geller, J., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-malignancy+orthotopic+nude+mouse+model+of+human+prostate+cancer+LNCaP%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-malignancy orthotopic nude mouse model of human prostate cancer LNCaP.</a> Prostate. 39 (3), 182-186 (1999).</li>
<li>An, Z., Wang, X., Geller, J., Moossa, A. R., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+orthotopic+implantation+allows+high+lung+and+lymph+node+metastatic+expression+of+human+prostate+carcinoma+cell+line+PC-3+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Surgical orthotopic implantation allows high lung and lymph node metastatic expression of human prostate carcinoma cell line PC-3 in nude mice.</a> Prostate. 34 (3), 169-174 (1998).</li>
<li>Kim, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+c-Met+expression+by+an+adenovirus+expressing+a+c-Met+ribozyme+inhibits+tumorigenic+growth+and+lymph+node+metastases+of+PC3-LN4+prostate+tumor+cells+in+an+orthotopic+nude+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Reduced c-Met expression by an adenovirus expressing a c-Met ribozyme inhibits tumorigenic growth and lymph node metastases of PC3-LN4 prostate tumor cells in an orthotopic nude mouse model.</a> Clin Cancer Res. 9 (14), 5161-5170 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Niniejszy manuskrypt opisuje szczegółową procedurę tworzenia mysiego modelu ludzkiego ortotopowego ksenoprzeszczepu raka prostaty. Model ten został ustalony przez bezpośrednie wszczepienie ludzkiej linii komórkowej raka prostaty PC3M-Luc-C6 do grzbietowych płatów gruczołu krokowego myszy z obniżoną odpornością. Pozwolono nowotworom rozwinąć się w trakcie eksperymentu. Podczas eksperymentu wzrost guza był monitorowany co tydzień za pomocą nieinwazyjnego systemu obrazowania bioluminescencyjnego.
<p class="jove_content"...

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka (9%) wśród mężczyzn w Stanach Zjednoczonych, obok raka płuc i oskrzeli (28%)1. Według najnowszych danych szacuje się, że w 2015 r. wystąpi 220 800 nowo zdiagnozowanych przypadków raka gruczołu krokowego i 27 540 zgonów1. Pięcioletni względny wskaźnik przeżycia we wczesnym stadium raka prostaty wynosi >99%, podczas gdy w przypadku zaawansowanej choroby przerzutowej wynosi tylko 28%1. Głównym wyzwaniem w leczeniu zaawansowanej choroby przerzutowej jest brak zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skłonności tej choroby do przerzutów do innych narządów, zwłaszcza do kości, która jest częstym miejscem występowania raka gruczołu krokowego. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba zbadania składu molekularnego tych guzów gruczołu krokowego w celu opracowania skutecznych schematów terapeutycznych zapobiegających progresji do zaawansowanej choroby przerzutowej2,3.
Guzy prostaty wykazują wysoką biologiczną heterogeniczność bez dobrze zdefiniowanej ścieżki progresji. Przerzuty często występują bez wcześniejszych oznak inwazyjności guza4. Ta kliniczna niejednorodność przypisuje się różnorodności molekularnej raka prostaty. Zrozumienie składu molekularnego tych śmiertelnych nowotworów jest kluczem do zaprojektowania lepszych strategii diagnostycznych i terapeutycznych dla tej choroby. W związku z tym badania nad rakiem prostaty koncentrują się obecnie na zrozumieniu i zapobieganiu przerzutom.
Przedkliniczne modele myszy in vivo oferują różnorodne opcje pozwalające zrozumieć molekularne mechanizmy progresji raka prostaty do zaawansowanej choroby przerzutowej. Ponadto modele te są ważne dla przedklinicznej oceny nowych strategii terapeutycznych przeciwko tej chorobie. Do najczęściej stosowanych modeli zwierzęcych należą transgeniczne modele myszy, iniekcja do żyły ogonowej, implantacja wewnątrzsercowa i ludzkie ortotopowe modele myszy. Badania transgeniczne są czasochłonne, a korelacja rozwoju raka prostaty u myszy z rozwojem człowieka wykazałazmienność11. W spontanicznych modelach myszy z przerzutami komórki są wstrzykiwane bezpośrednio do krążenia i chociaż mają szybki czas realizacji, nie można ich wykorzystać do badania guza pierwotnego lub początkowych etapów kaskadyprzerzutowej 5. Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów mają ograniczenie do rozwoju zmian przerzutowych do kości, które są częstym miejscem przerzutów raka prostaty. Niemniej jednak mysi model ludzkiego ortotopowego ksenoprzeszczepu raka prostaty jest dobrze scharakteryzowany i szeroko stosowany do badania zdarzeń molekularnych rozwoju guza pierwotnego, wzajemnych oddziaływań między guzem a mikrośrodowiskiem narządów, początkowej fazy choroby przerzutowej i stosowania leków eksperymentalnych do interwencji terapeutycznej6,7,8-11.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa PC3 raka prostaty&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne podłoże (MEM)&nbsp;</td><td>GIBCO,Life Technology</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO,Life Technology</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO,Life Technology</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen,Life Technology</td><td>R250-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>GIBCO,Technologia życia</td><td>25300-54</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp;</td>Strzykawki insulinowe z zaciskiem <td></td><td></td><td>ksenogenowym</td></tr><tr><td>(300 &mikro; l, 28.5 g)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309300</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Charles River Laboratories, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waciki nasączone</td><td>alkoholem MEDEquip Depot</td><td>326895 BD</td><td></td></tr><tr><td>PVP Jodine Prep Pad</td><td>MEDEquip Depot</td><td>C12400PDI</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgiczny szew chromowy CatGut</td><td>Demetech</td><td>CC224017F0P</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr></tbody></table>

przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

Aby badać wieloaspektową biologię raka prostaty, przedkliniczne modele in vivo oferują szereg opcji odkrywania krytycznych informacji biologicznych na temat tej choroby. Mysi model ludzkiego ortotopowego ksenoprzeszczepu raka prostaty stanowi użyteczne alternatywne podejście do zrozumienia specyficznych interakcji między genetycznie i molekularnie zmienionymi komórkami nowotworowymi, ich mikrośrodowiskiem narządowym oraz do oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Jest to dobrze scharakteryzowany model przeznaczony do badania zdarzeń molekularnych związanych z rozwojem guza pierwotnego i podsumowuje wczesne zdarzenia w kaskadzie przerzutów przed zatorowością i wejściem komórek nowotworowych do krążenia. Tym samym pozwala na wyjaśnienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw początkowej fazy choroby przerzutowej. Ponadto model ten może opisywać cele leków o znaczeniu klinicznym i jest cennym narzędziem do badania progresji raka prostaty. W tym manuskrypcie opisujemy szczegółową procedurę tworzenia mysiego modelu ludzkiego ortotopowego ksenoprzeszczepu raka prostaty.

Po ortotopowej implantacji komórek PC3M-Luc-C6 do tylnego płata prostaty, myszy poddawano cotygodniowemu obrazowaniu z wykorzystaniem systemu obrazowania bioluminescencyjnego zwierząt żywych w celu monitorowania kolonizacji komórek i wzrostu guza w trakcie eksperymentu (Rycina 5A-B). Ilościowe oznaczenie sygnału bioluminescencyjnego wykazało, że komórki PC3M-Luc-C6 pomyślnie skolonizowały płaty prostaty. Wzrost bioluminescencji wskazuje na zwiększony wzro...

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ustanowienie mysiego ortotopowego modelu ksenoprzeszczepu raka prostaty, który zapewnia przydatne podejście do badania zdarzeń molekularnych rozwoju pierwotnego guza w początkowych etapach kaskady przerzutniczej. Model ten może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące specyficznych interakcji między genetycznie i molekularnie zmienionymi komórkami nowotworowymi w mikrośrodowisku rosnącego guza. Może on również wspomóc przedkliniczną ocenę nowych podejść terapeutycznych przeciwko ludzkiemu rakowi prostaty.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z modelami przerzutowania spontanicznego jest to, że umożliwia ona badanie zdarzeń molekularnych związanych z rozwojem guza pierwotnego, a także odtworzenie początkowej fazy przerzutowania, poprzedzającej przejście i zatorowość komórek nowotworowych w krwiobiegu. Ortotopowy model raka prostaty jest jednym z najlepszych modeli przedklinicznych pozwalających zrozumieć, w jaki sposób komórki raka prostaty przerzutowują do różnych narządów. Większość pacjentów z rakiem prostaty umiera w wyniku przerzutów, dlatego model ten jest bardzo istotny dla badania molekularnych mechanizmów przerzut

pre-clinical-orthotopic-murine-model-of-human-prostate-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

W tym filmie pokazujemy procedurę podawania komórek raka prostaty do modelu mysiego do wstrzykiwania dogruczołowo prostaty. Ortotopowe modele myszy mogą być wykorzystywane do badania pochodzenia choroby i odpowiedzi na terapie lecznicze w nieinwazyjnym i klinicznie istotnym środowisku.

Wstrzyknięcie komórek rakowych do gruczołu krokowego: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty

Aby zademonstrować obrazowanie molekularne raka MR za pomocą środka kontrastowego MRI z małym peptydem specyficznym dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza w modelu raka prostaty u myszy.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikropreparacji prostaty i chirurgicznej kastracji u myszy laboratoryjnej. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki uzyskane przez te protokoły. Na koniec omawiamy zalety i wykorzystanie tych protokołów.

Mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna

Ten protokół opisuje powstawanie mysich ortotopowych guzów pęcherza moczowego u samic myszy C57BL/6J oraz monitorowanie wzrostu guza.

Mysi ortotopowy model guza pęcherza moczowego i system wykrywania guzów

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Ten protokół opisuje nowo ustaloną metodę dostarczania wirusa do mysiej prostaty. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, nadekspresję genów lub dostarczanie rekombinazy Cre, technika ta umożliwia ortotopową zmianę ekspresji genów i wdraża nowy mysi model raka prostaty.

Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów

Genetycznie modyfikowane myszy są użytecznymi modelami do badania mechanizmów raka prostaty. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji i preparowania płatów prostaty z układu moczowo-płciowego myszy, różnicowania ich na podstawie histologii oraz izolowania i hodowli pierwotnych komórek prostaty in vitro jako sferoid do dalszych analiz.

Identyfikacja, charakterystyka histologiczna i sekcja płatów prostaty myszy dla modeli hodowli sferoidalnych 3D in vitro

Tutaj prezentujemy protokół dosercowego wstrzykiwania ludzkich komórek raka prostaty w celu wygenerowania mysiego modelu ze zmianami przerzutowymi do kości.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

Poznaj metodę tworzenia ortotopowego modelu ksenotransplantatu raka prostaty u myszy. Technika ta umożliwia badanie molekularnych mechanizmów rozwoju guza pierwotnego oraz wczesnych faz przerzutowania, wspierając prekliniczną ocenę nowych terapii.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Przeglądaj więcej filmów