Synteza biokoniugatów białkowych za pomocą chemii cysteiny-maleimidu

Ogólnym celem syntezy biokoniugatów białkowych za pomocą chemii cysteinowo-maleimidowej jest zapewnienie specyficzności w miejscu modyfikacji białka. To z kolei wpływa na aktywność powstałego biokoniugatu, na przykład koniugatów przeciwciał z lekiem. Jeśli interesujesz się strukturą lub funkcją białka i prowadzisz badania w dziedzinie nanomedycyny, mikroskopii fluorescencyjnej lub chemii systemów, ta technika pomoże Ci odpowiedzieć na Twoje pytania.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo specyficzna i daje wysokie plony w większej liczbie warunków. Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść 12 miligramów liofilizowanego cytochromu C w sześciu mililitrach 20-milimolowego buforu fosforanowego. Odpipetować 16 mikrolitrów świeżo przygotowanego jednomolowego roztworu DTT do roztworu białkowego w celu zmniejszenia cytochromu C. Po wymieszaniu roztworu przefiltruj go przez 0,22 mikrona filtr strzykawkowy PBDF o niskiej wiązalności białka przed wstrzyknięciem na jakiekolwiek podłoże chromotograficzne.

Następnie należy oczyścić zredukowany surowy roztwór cytochromu C za pomocą szybkiej chromatografii płynnej białek lub FPLC. Po zrównoważeniu silnej kationowej dziwnej kolumny, załaduj jeden mililitr roztworu do pętli iniekcyjnej instrumentu. Następnie rozpocznij metodę gradientową od 328 dla 450 milimolowego chlorku sodu, w pięciu objętościach kolumn.

Monitoruj kanały 280 i 410 nanometrów detektora UV viz i zbierz największy pik. Teraz zwiększ stężenie soli do jednego mola dla dwóch objętości kolumny, aby zebrać cytochrom C ISO2. Po przepłukaniu kolumny należy ponownie zrównoważyć z dwiema kolumnami objętości 20-milimolowego buforu fosforanowego przed wstrzyknięciem następnej surowej podwielokrotności. W tym momencie rozpuść 0,9 miligrama odpowiedniego kompleksu maleimidu rutenu w 600 mikrolitrach acetonitrylu.

Przygotuj 10-milimolowy roztwór TCEP, rozpuszczając 2,87 miligrama TCEP w jednym mililitrze ultra czystej wody. Wymieszaj 11,4 mililitra ultra czystej wody, trzy mililitry 100-milimolowego roztworu podstawowego fosforanu-EDTA w 50-mililitrowej plastikowej tubce. Następnie dodaj 0,15 mikromola oczyszczonego cytochromu C do roztworu fosforanu-EDTA.

Dodać 7,5 mikrolitra roztworu podstawowego TCEP do roztworu białkowego. I pozostaw mieszanie na pięć minut, aby zredukować białko, które mogło ulec zmeryzacji w wyniku utleniania cysteiny. Następnie dodać 600 mikrolitrów roztworu kompleksu maleimidu rutenu do zredukowanego buforowanego roztworu cytochromu C i pozostawić mieszaninę reakcyjną mieszając w ciemności w temperaturze pokojowej na 24 godziny.

Kolejność dodawania ma ogromne znaczenie. Bardzo ważne jest, aby najpierw dodać białko, następnie środek redukujący, a na końcu maliemide. Następnego dnia należy zagęścić mieszaninę reakcyjną przez odwirowanie przy użyciu filtra spinowego o masie cząsteczkowej 3,5 kilodaltonu.

Powtórzyć wirowanie dwa do trzech razy ze świeżym 20-milimolowym buforem fosforanowym, aż filtrat będzie klarowny. W celu oczyszczenia na bazie niklu umyj jeden mililitr kolumny chromatograficznej z mobilizowanym powinowactwem do metalu trzema mililitrami ultra czystej wody, trzema mililitrami 100-milimolowego roztworu octanu niklu i sześcioma mililitrami ultra czystej wody. Następnie podłącz kolumnę obciążoną niklem do FPLC między pętlą wtryskową a detektorem UV

Następnie zrównoważyć kolumnę z trzema objętościami kolumny 20 milimolowego buforu fosforanu i 0,5 molowego chlorku sodu przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę. Po przefiltrowaniu przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,22 mikrona, załaduj 100 mikrolitrów surowej mieszaniny reakcyjnej do pętli iniekcyjnej przyrządu. Przemyć kolumnę buforem o objętości trzech kolumn w celu wymycia nieprzereagowanego cytochromu C. Następnie wymyć biokoniugat cytochromu C za pomocą gradientu imidazolowego od zera do 125 milimolów w trzech objętościach kolumny.

Po wyluceniu biokoniugatu cytochromu C z kolumny, przemyć 250 milimolowym buforem imidazolowym przez pięć objętości kolumny. Następnie ponownie zrównoważyć kolumnę 20 milimolowym buforem chlorku sodu z fosforanem 0,5 molowym. Następnie wyciągnij frakcje biosprzężone.

I zagęścić przez odwirowanie przy użyciu filtra spinowego o masie cząsteczkowej 3,5 kilodaltonu. Po odwirowaniu załadować skoncentrowany biokoniugat do kaset dializacyjnych o masie cząsteczkowej 3,5 kilodaltonu, odciąć i dializować w ultra czystej wodzie przez noc. Następnego dnia oznaczyć stężenie czystego stężonego roztworu biokoniugatu za pomocą spektroskopii UV-Vis.

Przy użyciu tej samej wartości absorpcji molowej co cytochrom C ISO1 przy 410 nanometrach. Pozostały biokoniugat przechowywać w postaci 25 mikrolitrowych porcji w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. W przypadku elektroforezy żelowej należy przygotować 10 mikrolitrów każdej próbki białka, którą należy przeprowadzić, rozcieńczając biokoniugat wstępnie zmieszanym buforem dodecylowosiarczanu litu do końcowego stężenia około 20 mikrogramów na studzienkę.

Następnie podgrzewaj próbki do 70 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po pozostawieniu próbek do ostygnięcia do temperatury pokojowej, ostrożnie załaduj je na wstępnie odtworzony żel 12% bis tris, jeden milimetr 10 dołków, używając długich końcówek pipet, aby pomóc w ładowaniu. Załaduj wstępnie wybarwiony marker masy cząsteczkowej 10 białka do środkowej studzienki żelu, aby ułatwić analizę.

Teraz uruchom żel pod napięciem 200 woltów przez 35 minut. Po zakończeniu biegu zabarwij żel komercyjnym niebieskim roztworem Coomassie przez dwie godziny. Po usunięciu roztworu Coomassie blue myj żel ultra czystą wodą przez 48 godzin.

Wzrost masy przy braku nieprzereagowanego białka w wielotofowym widmie masowym biokoniugatu cytochromu C wykazał udane równoważne połączenie kompleksu maleimidu rutenu z cytochromem C. A następnie oczyszczenie biokoniugatu. Wydajność biokoniugatu cytochromu C wynosi na ogół od 15 do 27%I można ją obliczyć na podstawie widma UV-Vis. Biokoniugat polega na przyłączeniu maleimidu do białka jeden do jednego.

Czego można się wywnioskować, porównując widmo biokoniugatu z przewidywanym spektrum dodawania jeden do jednego materiałów wyjściowych. Ponadto pojawienie się nowego piku na chromatogramie podczas oczyszczania potwierdza syntezę nowego gatunku. Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ostrożnie obchodzić się z roztworami białkowymi w rękawiczkach, aby zapobiec przedostawaniu się białka do próbek. Procedura ta może być stosowana do koniugacji innych maleimidów z białkami zawierającymi cysteinę. Aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy białko błonowe znajduje się w żywej błonie pierwotniakowej.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biomolekularnością, aby lepiej zrozumieć funkcję i lokalizację białek w ograniczeniach opartych na wisle. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać chemię maleimidu cysteiny w celu oznaczania biomakrocząsteczek z wysoką wydajnością. Nie zapominaj, że praca z chemikaliami badawczymi o nieznanych właściwościach może być niezwykle niebezpieczna.

I że podczas wykonywania tej procedury należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej.