Name: Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metody analityczne i ekotoksykologiczne do oceny skuteczności usuwania estrogenów z ścieków. Techniki LC-MS/MS i testy in vitro pomagają wybrać najlepsze technologie ochrony ekosystemów wodnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekty przedstawione w tym artykule zostały sfinansowane przez Severn Trent Water i Brunel University London. Autorzy pragną podziękować Alanowi Henshawowi i Johnowi Churchleyowi za udzielenie pomocy terenowej i laboratoryjnej. T.J.C. dziękuje Heinz Endowments za wsparcie. M.R.M. dziękuje Instytutowi Steinbrennera za stypendium doktoranckie Steinbrennera oraz Carnegie Mellon University za stypendium prezydenckie.

<ol><li>Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-science+of+endocrine+disrupting+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals.</a> Toxicol. Lett. 211, (2012).</li>
<li>Rodgers-Gray, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+juvenile+roach+%28Rutilus+rutilus%29+to+treated+sewage+effluent+induces+dose-dependent+and+persistent+disruption+in+gonadal+duct+development%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development.</a> Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).</li>
<li>Jobling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sexual+maturation+and+gamete+production+in+wild+roach+%28Rutilus+rutilus%29+living+in+rivers+that+receive+treated+sewage+effluents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+reprod%22%5BJournal%5D)">Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents.</a> Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).</li>
<li>Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+vitellogenin%2C+a+biomarker+for+exposure+to+oestrogenic+chemicals%2C+in+a+wide+variety+of+cyprinid+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%2C+Biochem.+Syst.+Environ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish.</a> J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).</li>
<li>Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+sexual+disruption+in+wild+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Widespread sexual disruption in wild fish.</a> Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).</li>
<li>Jobling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted+exposures+to+steroid+estrogens+in+U.K.+rivers+correlate+with+widespread+sexual+disruption+in+wild+fish+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations.</a> Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).</li>
<li>Baynes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+treatment+of+wastewater+reduces+endocrine+disruption+in+wild+fish+-+a+comparative+study+of+tertiary+and+advanced+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).</li>
<li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+surfactants+and+some+of+their+degradation+products+assessed+using+a+recombinant+yeast+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).</li>
<li>Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disrupting+activities+in+sewage+effluent+and+river+water+determined+by+chemical+analysis+and+in+vitro+assay+in+the+context+of+granular+activated+carbon+upgrade%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade.</a> Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+determination+of+steroid+oestrogens+in+waters+using+chromatography+and+mass+spectrometry+%282008%29+Methods+for+the+Examination+of+Waters+and+Associated+Materials%22">The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials</a>. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).</li>
<li>Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+in+vitro%2Fin+vivo+estrogenic+potencies+of+17beta-estradiol%2C+estrone%2C+17alpha-ethynylestradiol+and+of+17beta-estradiol%2C+estrone%2C+17alpha-ethynylestradiol+and+nonylphenol%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol.</a> Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).</li>
<li>Mills, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+ecotoxicity+of+17%CE%B1-ethinylestradiol+using+TAML%2Fperoxide+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment.</a> Sci. Rep. 5, 10511(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+14962%3A2006+Water+quality+-+Guidance+on+the+scope+and+selection+of+fish+sampling+methods%22">EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods</a>. , British Standards Institute. London, UK. (2006).</li>
<li>Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+tropical+fish+food+can+alter+baseline+vitellogenin+concentrations+in+male+fathead+minnow+%28Pimephales+promelas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas).</a> Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).</li>
<li>Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histological+description+of+intersexuality+in+the+roach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">A histological description of intersexuality in the roach.</a> J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).</li>
<li>Dascenzo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+natural+estrogen+conjugates+in+municipal+sewage+transport+and+treatment+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities.</a> Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).</li>
<li>Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+natural+and+synthetic+steroid+estrogens+and+their+conjugates+in+aqueous+matrices+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).</li>
<li>Metcalfe, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+potency+of+chemicals+detected+in+sewage+treatment+plant+effluents+as+determined+by+in+vivo+assays+with+Japanese+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes).</a> Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).</li>
<li>Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozonation+and+activated+carbon+treatment+of+sewage+effluents%3A+Removal+of+endocrine+activity+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity.</a> Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).</li>
<li>Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted-no-effect+concentrations+for+the+steroid+estrogens+estrone%2C+17%CE%B2-estradiol%2C+estriol%2C+and+17%CE%B1-ethinylestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).</li>
<li>Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+hazardous+chemicals+in+wastewater+treatment+works+effluents%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents.</a> Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).</li>
<li>Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+advanced+treatments+of+wastewater+effluents+on+estrogenic+and+reproductive+health+impacts+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).</li>
<li>Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+effluent+toxicity+assessment+at+a+wastewater+treatment+plant+upgraded+with+a+full-scale+post-ozonation+using+aquatic+key+species%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species.</a> Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAML+oxidant+activators%3A+a+new+approach+to+the+activation+of+hydrogen+peroxide+for+environmentally+significant+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems.</a> Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+Ligands+for+Oxidizing+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Designing Ligands for Oxidizing Complexes.</a> Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).</li>
<li>Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Assays+as+Developmental+Toxicity+Indicators+in+The+Design+of+TAML+Oxidation+Catalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts.</a> Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).</li>
<li>Murk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+estrogenic+potency+in+wastewater+and+surface+water+with+three+in+vitro+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays.</a> Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).</li>
<li>Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>Kolle, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+house+validation+of+recombinant+yeast+estrogen+and+androgen+receptor+agonist+and+antagonist+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays.</a> Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).</li>
<li>Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transient+expression+assay+for+detecting+environmental+oestrogens+in+zebrafish+and+medaka+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos.</a> BMC Biotechnology. 12, 32(2012).</li>
<li>Brian, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+prediction+of+the+response+of+freshwater+fish+to+a+mixture+of+estrogenic+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals.</a> Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).</li>
<li>Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oczyszczalnie ścieków są główną drogą zanieczyszczenia wód powierzchniowych EDC. Ocena skuteczności usuwania aktywności hormonalnej konwencjonalnych, zaawansowanych lub nowo pojawiających się procesów leczenia wymaga zastosowania różnych testów chemicznych i biologicznych. Analiza chemiczna z wykorzystaniem analizy nieukierunkowanej i ukierunkowanej dostarcza danych jakościowych lub ilościowych na temat skuteczności usuwania poszczególnych składników, a tym samym umożliwia dokonanie oceny w odniesieniu do środowiskowych norm jakości lub przewidywanych stężeń niepowodujących zmian w analizowanych związkach lub mieszaninach związków.
Powstawanie produktów przemian w wyniku niepełnej mineralizacji substancji po oczyszczeniu oraz obecności nieznanych składników biologicznie czynnych w ściekach ogranicza przydatność samych badań chemicznych. Połączenie testów biologicznych in vivo i in vitro w połączeniu z badaniami przesiewowymi chemii analitycznej stanowi użyteczny zestaw narzędzi do określenia skuteczności usuwania EDC za pomocą nowych procesów oczyszczania ścieków. Testy te, w połączeniu z tradycyjnymi parametrami jakości wody oraz innymi toksykologicznymi i mikrobiologicznymi punktami końcowymi, pozwalają na krytyczną ocenę obecnych i powstających technologii oczyszczania ścieków.
Ważne jest, aby pamiętać, że badania przesiewowe estrogenów na bazie drożdży (np. TAK) nie są jedynymi testami in vitro w celu określenia siły estrogenowej chemikaliów i ścieków. Opracowano również szereg stabilnie transfekowanych testów opartych na komórkach ssaków, na przykład ER-CALUX27 i hERα-HeLa-990328 odpowiednio z ludzkimi komórkami raka piersi lub komórkami guza szyjki macicy. Test YES porównano z podobnymi testami opartymi na komórkach ssaków i stwierdzono, że ma porównywalnie wysoki poziom odtwarzalności, prawdziwie dodatnie i prawdziwie ujemne wskaźniki identyfikacji estrogenowej29, chociaż czasami uważa się, że jest nieco mniej czuły27. Jedną z zalet testów reporterowych opartych na drożdżach jest to, że w laboratoriach bez znaczącego doświadczenia z hodowlą komórek ssaków TAK można łatwiej przyjąć, ponieważ wymaga to mniej rygorystycznych środków kontroli biologicznej i sterylnych technik (w razie potrzeby TAK można wykonać na stole laboratoryjnym). Testy oparte na komórkach ludzkich wymagają również inkubatorów i luminometrów CO2 w porównaniu ze standardowymi inkubatorami i czytnikami mikropłytek stosowanymi w YES. Dwa testy reporterowe estrogenów na bazie drożdży (TAK, Saccharomyces cerevisiae i A-YES, Arxula adeninivorans) są obecnie poddawane międzylaboratoryjnym testom w celu walidacji ISO 19040 "Jakość wody - Oznaczanie potencjału estrogenowego wody i ścieków", podkreślając zainteresowanie przemysłu tymi technikami.
Istnieje szereg ograniczeń opisanych metod, do których zalicza się potencjalne zanieczyszczenie próbek podczas pobierania próbek, przechowywania i analizy próbek substancjami estrogenowymi pochodzącymi ze środowiska terenowego lub laboratoryjnego lub zanieczyszczeniem ludzi (np . plastyfikatorami, środkami powierzchniowo czynnymi, produktami higieny osobistej). Ten rodzaj zanieczyszczenia w teście YES (lub innych testach reporterowych opartych na komórkach) podniesie tło i wpłynie na zastosowanie testu. Próbki wody lub rozpuszczalniki przechowywane w plastikowych butelkach mogą łatwo powodować fałszywe alarmy. Wyniki fałszywie ujemne są również niepokojące, ponieważ zarówno test LCMS/MS, jak i test TAK wymagają SPE skoncentrowania estrogenów do wykrywalnych poziomów. Matryca, wybór sorbentu SPE i rozpuszczalnika elucyjnego może mieć wpływ na wydajność ekstrakcji i rodzaje eluowanych związków. Użycie wkładów C18 SPE do ekstrakcji w warunkach opisanych w tym protokole może generować ujemne odchylenie, ponieważ wysoce polarne i zasadowe związki byłyby słabo zatrzymywane przez sorbent. Ponadto protokół ten wymaga odtworzenia eluentu ELUENT YES z metanolu do etanolu poprzez odparowanie do sucha w azocie, co powoduje utratę lotnych związków. W rezultacie, protokół może dostarczyć niedoszacowanej aktywności estrogenowej badanych próbek. Ograniczenia te są szczególnie ważne przy rozważaniu testu YES, ponieważ nieznane lub nieoczekiwane związki mogą zostać pominięte, ponieważ nie zostały wyekstrahowane lub zostały utracone w wyniku parowania. Ponadto technika LCMS/MS wykorzystuje znakowane wzorce wewnętrzne w celu skorygowania odzysku; Podejście to nie może być stosowane w teście YES.
Do istotnych ograniczeń badań ścieków in vivo należą wysokie koszty i czas potrzebny na ocenę w porównaniu z metodami in vitro . Obecnie stosowanie testów na zarodkach ryb w celu wykrycia aktywności estrogenowej jest ograniczone. Odniesiono jednak pewne sukcesy w produkcji reagujących na estrogeny transgenicznych świecących zarodków ryb30, które mogą mieć przyszłe zastosowania. Strzebla grubogłowa (stosowana w tym protokole) jest powszechnym gatunkiem laboratoryjnym, a indukcja VTG u samców ryb jest dobrze udokumentowanym biomarkerem ekspozycji na estrogeny i wymierną miarą estrogenności ścieków22 lub innych związków lub mieszanin estrogenowych31. Wytyczne OECD dotyczące badań substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego zostały zwalidowane przy użyciu dorosłej strzebli grubogłowych, japońskiej medaki i danio pręgowanego32,33, przy czym VTG jest czułym biomarkerem ekspozycji na estrogen u wszystkich trzech gatunków. Jednak indukcja VTG nie koreluje bezpośrednio z upośledzeniem rozrodczości, a tym samym z ekologicznymi konsekwencjami narażenia na ścieki, jak widać u poważnie interpłciowych płoci3. Z drugiej strony płocie nie są klasycznym "gatunkiem laboratoryjnym" do badań ekotoksykologicznych ze względu na duże rozmiary, długi czas pokolenia (2-3 lata do osiągnięcia dojrzałości płciowej), styl rozrodu; Tarło grupowe (lęg) odbywa się raz w roku, a trudność w odróżnieniu samców od samic (poza okresem tarła). Jednak ten normalnie gonochorystyczny gatunek został bardzo dobrze przebadany w Wielkiej Brytanii, ze względu na odkrycie, że za estrogenowymi ściekami samce ryb wykazywały zaburzenia endokrynologiczne (np. obecność specyficznej dla samicy witellogeniny we krwi) i histopatologii (ovotestes - rozwijające się jaja w jądrach i/lub żeńskich przewodach rozrodczych)5,6. W związku z tym, jako przyszłe zastosowanie tych protokołów, karaluch (lub podobne gatunki) może być użytecznym dzikim gatunkiem wskaźnikowym, aby pokazać, czy w rzekach otrzymujących zaawansowane oczyszczanie ścieków obserwuje się rzeczywistą poprawę jakości ścieków (i zmniejszoną estrogenność). Mogą być również stosowane w systemach typu end-of-pipe do monitorowania technologicznie ulepszonych ścieków z instalacji pilotażowych7. Rozważając, które gatunki wykorzystać w ocenach ścieków in vivo , istnieje kompromis między stosunkowo szybkimi i kontrolowanymi testami z wykorzystaniem gatunków laboratoryjnych a dłuższymi badaniami terenowymi, ale bardziej istotnymi dla środowiska, z wykorzystaniem gatunków rodzimych. Takie oceny in vivo są jednak kosztowne i powinny być traktowane jedynie jako ostateczny zestaw badań po ocenach z wykorzystaniem analizy chemicznej i testów in vitro .
Krytyczne kroki w ramach opisanych protokołów obejmują przygotowanie i obchodzenie się z próbkami i wyrobami szklanymi (tj. butelki i sprzęt do pobierania próbek powinny być wstępnie poddane działaniu odpowiedniego środka do czyszczenia powierzchni czynnej) w celu uniknięcia zanieczyszczenia próbek zanieczyszczeniami środowiskowymi, w tym ograniczenie kontaktu próbek z tworzywami sztucznymi i innymi materiałami, które mogą powodować wyniki fałszywie dodatnie. Jest to równie ważne przy projektowaniu i budowie akwariów i systemów ekspozycji ryb. Idealnie byłoby, gdyby akwaria (zasoby mieszkalne i podczas ekspozycji) były zbudowane z materiałów o niskiej adsorpcji32 przy minimalnym ryzyku zanieczyszczenia. Stal nierdzewna może być stosowana do zbiorników na ścieki lub wodę. Natomiast zbiorniki o szklanej konstrukcji są preferowane do akwariów (ponieważ zapewnia to również łatwą obserwację ryb). Należy unikać stosowania rur lub przewodów z tworzywa sztucznego niskiej jakości32, PVC34 i ABS można stosować, jeśli są "odpowiednio przyprawione", tj. pozostawione do wypłukania wszelkich zanieczyszczeń z bieżącej wody rozcieńczającej przez co najmniej 12 godzin przed użyciem. Rurki silikonowe klasy medycznej są z powodzeniem stosowane w naszym zakładzie do dostarczania pomp perystaltycznych chemikaliów i ścieków / wody rozcieńczającej do zbiorników. Oprócz uwzględnienia zanieczyszczenia estrogenowego w budowie i prowadzeniu systemu wodnego, ważne jest również, aby pomyśleć o diecie ryb; Stwierdzono, że wiele odpowiednich pokarmów dla ryb jest estrogennych dla ryb. Dlatego ważne jest, aby testować wszelkie pokarmy pod kątem aktywności (np. w badaniu przesiewowym estrogenów drożdży, patrz Beresford i wsp.14) przed zastosowaniem ich w tego typu badaniach.
Rozwiązywanie problemów z opisanymi protokołami analizy chemicznej lub testów YES jest uproszczone, jeśli próbki zapewniające jakość, w tym wiele ślepych prób podróżnych, laboratoryjnych i rozpuszczalnikowych, są analizowane wraz z kontrolami dodatnimi i próbkami rzeczywistymi w celu wyeliminowania wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. W testach in vivo należy również zawsze stosować kontrolę dodatnią (np. EE2) i ujemną (tylko woda rozcieńczona) w celu potwierdzenia czułości oczekiwanego biomarkera biologicznego lub punktu końcowego (tj. VTG lub histopatologii) i umożliwienia wykrycia wszelkich nieoczekiwanych zanieczyszczeń (np. z zestawu doświadczalnego, diety lub wód rozcieńczających). Wszelkie modyfikacje w protokole powinny zostać zatwierdzone przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek badania.
Przewiduje się, że w związku ze ściślejszymi regulacjami dotyczącymi związków estrogenowych przedostających się do środowiska przez ścieki z oczyszczalni ścieków, konieczne będzie opracowanie bardziej skutecznych technologii oczyszczania ścieków. Zestaw testów opisanych w tym manuskrypcie uzupełnia ekotoksykologiczne i chemiczne testy oceniające zwykle stosowane do zrzutów ścieków z oczyszczalni ścieków. W związku z tym przyszłe zastosowanie tego typu holistycznego zestawu testów powinno umożliwić twórcom technologii oczyszczania ścieków i operatorom zakładów wdrażanie najbardziej bezpiecznych ekologicznie projektów, biorąc pod uwagę najlepsze metody usuwania zarówno określonych regulowanych estrogenowych substancji chemicznych, jak i ogólnej aktywności biologicznej.

Obawy dotyczące negatywnego wpływu związków zaburzających gospodarkę hormonalną na zdrowie reprodukcyjne dzikich zwierząt skłoniły Unię Europejską do umieszczenia dwóch substancji estrogenowych (estradiolu i etynyloestradiolu) na "liście obserwacyjnej" zgodnie z Ramową Dyrektywą Wodną (WFD). EDC obejmuje różne klasy chemiczne, w tym naturalne i syntetyczne estrogeny steroidowe, leki, pestycydy i chemikalia przemysłowe oraz składniki produktów konsumenckich o znanym negatywnym wpływie na dziką przyrodę. Niektóre z tych związków mogą potencjalnie wpływać na zdrowie człowieka1.
Badania wykazały, że ścieki z oczyszczalni ścieków są estrogenne dla ryb2, a w konsekwencji wiele wód, do których odprowadzane są również ścieki estrogenne dla ryb3. Po raz pierwszy wykazano to w krajowych badaniach w Wielkiej Brytanii, które wykazały zwiększone stężenie witellogeniny (żeńskiego specyficznego prekursora białka żółtka4) we krwi dzikich samców ryb i wysokie rozpowszechnienie interpłciowości (rozwój jaj i/lub żeńskich przewodów rozrodczych w jądrach samców ryb) u normalnie gonochorystycznych gatunków ryb5,6.
Konwencjonalne oczyszczanie ścieków to zazwyczaj trzyetapowy proces składający się z wstępnego przesiewu, po którym następuje pierwotne i wtórne oczyszczanie, które usuwa zarówno rozpuszczoną, jak i zawieszoną materię organiczną. Skuteczność usuwania poszczególnych EDC zależy od właściwości fizykochemicznych substancji oraz od skuteczności zastosowanego procesu oczyszczania. Dla wielu osób usunięcie EDC poprzez adsorpcję i degradację biologiczną może być znaczące, ale niepełne. Obróbka trzeciego stopnia, taka jak filtracja piaskowa, może być skuteczna w zwiększaniu usuwania EDC7, podczas gdy zaawansowane oczyszczanie z wykorzystaniem zaawansowanego utleniania (na przykład ozonu) lub węgla aktywnego może być skuteczne w osiągnięciu prawie całkowitego usunięcia7.
Ocena każdej nowej technologii oczyszczania ścieków musi określić skuteczność proponowanego procesu usuwania EDC. Zestaw testów, w tym ukierunkowana analiza chemiczna wraz z badaniami ekotoksykologicznymi, wykorzystującymi testy biologiczne in vivo i in vitro, dostarcza kompleksowych danych do tego celu. Chociaż jest to bardzo przydatne do celów regulacyjnych, ukierunkowana analiza chemiczna może dostarczyć jedynie danych na temat monitorowanych związków (i określonych metabolitów). Testy biologiczne dodatkowo umożliwiają "wykrycie" niepożądanych skutków metabolitów i produktów ubocznych przemiany ścieków wytwarzanych przez oczyszczanie, które w przeciwnym razie nie zostałyby wykryte8,9. W artykule opisano zastosowanie zestawu laboratoryjnych testów chemicznych i ekotoksyczności do oceny skuteczności szeregu zaawansowanych i powstających procesów oczyszczania ścieków w usuwaniu estrogenowej siły ścieków surowych i oczyszczonych oraz wód odbiorczych.

<table><tbody><tr><td>Myjka płytkowa Wellwash Versa</td><td>Thermo Scientific</td><td>5165010</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax 340PC</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td>INB 400</td><td>37 &#176; Inkubacja C wymagana do oznaczania karpi</td></tr><tr><td>Fisherbrand whirlimixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13214789</td><td></td></tr><tr><td>Kostkarka do lodu</td><td>Scotsman</td><td>AF80</td><td></td></tr><tr><td>12-kanałowa cyfrowa pipeta wielokanałowa F1</td><td>Thermo Scientific Zestawy</td><td>4661070</td><td></td></tr><tr><td>ELISA</td> Thermo Scientific <td>Biosense Laboratories</td><td>V01018401-096 (Strzebla grubogłowy) V01003402-096 (Karp)</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofug, 0,5 ml</td><td>Alpha labs</td><td>LW2372</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrofuge, 1,5 ml</td><td>Alpha labs</td><td>LW2375</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy, 95-98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Procesor tkanek</td><td>Leica Biosystems</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik wosku</td><td>Thermo Scientific Raymond Lamb</td><td>E66HC</td><td></td></tr><tr><td>Metalowa forma do zatapiania</td><td>Leica Biosystems</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Thermo Scientific Shandon</td><td>3120063</td><td></td></tr><tr><td>Zimna płyta (EG1150 C)</td><td>Leica Biosystems</td><td>14038838037</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewane kleszcze (EG F)</td><td>Leica Biosystems</td><td>14038835824</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja parafinowa Flotacja&nbsp; kąpiel</td><td>Elektrotermiczna</td><td>MH8517</td><td></td></tr><tr><td>Stół do suszenia szkiełek</td><td>Elektrotermiczny</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny barwnik Stainmate</td><td>Thermo Scientific Shandon</td><td>E103/S10L</td><td></td></tr><tr><td>Kasety, Histosette II, biopsja</td><td>Simport</td><td>M493</td><td></td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>Thermo Scientific Raymond Lamb</td><td>W1</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-202</td><td></td></tr><tr><td>IMS (mieszanka etanolowa), IDA99</td><td>Tennants</td><td>ID440</td><td></td></tr><tr><td>Polisynowe szkiełka adhezyjne</td><td>Thermo Scientific Gerhard Menzel</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, 22x50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>Histomount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-103</td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin Harris GURR</td><td>VWR</td><td>351945S</td><td></td></tr><tr><td>Eosin, 1%, wodny</td><td>Pyramid Inovation</td><td>S20007-E</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka na prowadnice Fisherbrand</td> Ostrza mikrotomu <td>Fisher Scientific</td><td>11701486</td><td></td></tr><tr><td>, MB35</td><td>Thermo Scientific Shandon</td><td>3050835</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s rozwiązanie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Komora sitowa drożdżowa</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przepływowa</td><td>Labcaire Systems Ltd</td><td>SC12R</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator chłodzony</td><td>LMS Inkubator chłodzony</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Memmert</td><td>INB 400</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Grant</td><td>PSU-10i</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand whirlimixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>13214789</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka płytkowa</td><td>Heidolph Titramax 100</td><td>544-11200-00</td><td></td></tr><tr><td>12-kanałowa cyfrowa pipeta wielokanałowa F1</td><td>Thermo Scientific Finnpipette</td><td>4661070</td><td></td></tr><tr><td>12-kanałowa pipeta, elektroniczna</td><td>Sartorius</td><td>735441</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe</td> <td>mikropłytki płaskodenneMP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt</td><td>76-232-05 260860 82.1581.001</td><td>Odkryliśmy, że wszystkie te płytki wielodołkowe wytwarzają wodę o niskiej zawartości tła</td></tr> klasy <tr><td>HPLC</td><td>Rathburn</td><td>RH1020</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Hayman Kimia</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny fosforan potasu jednozasadowy</td><td>bezwodny Sigma-Aldrich</td><td>P-5655</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2939</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu, granulki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1767</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu, bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307718</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8912</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-6034</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2786</td><td></td></tr><tr><td>L-Argenina, chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6969</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5308</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8566</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-7403</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizyna, chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8662</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenyloalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5482</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-Glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8415</td><td></td></tr><tr><td>L-Walina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0513</td><td></td></tr><tr><td>L-Seryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina, chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>Pirydoksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5669</td><td></td></tr><tr><td>Kwas D-Pantotenowy, sól hemiwapniowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5155</td><td></td></tr><tr><td>Inozytol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza bezwodna; mieszane anomery</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4534</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8441</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II), bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1297</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofenol-&#946;-D galaktopyranozyd (CPRG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2025</td><td></td></tr><tr><td>17 &beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-8875</td><td></td></tr><tr><td>Steroids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór amoniaku</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azotan miedzi(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d4-17&#946;-estradiol</td><td>CDN Izotopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d4-estron</td><td>CDN Izotopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d4-17&#945;-etynylo-estradiol</td><td>CDN Izotopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17&#946;-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17&#945;-etynylo-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heksan</td><td>Rathburn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Styren diwinylo-benzen wkład (Isolute ENV+) wkład do ekstrakcji do fazy stałej (200 mg/6 ml)</td><td>Biotage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolute aminopropylowy wkład ekstrakcyjny do fazy stałej (500 mg/6 ml)</td><td>Biotage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Badanie ryb</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pomarańczowo-biały silikonowy przewód kolektora 0,63 otwór PK 6</td><td>Łączniki proste Watson Marlow</td><td>982.0063.000</td><td></td></tr><tr><td>do otworu 0,5/0,8 PK 20</td><td>Watson Marlow</td><td>999.2008.000</td><td></td></tr><tr><td>rurka silikonowa 0,8 otwór 15 m</td><td>Watson Marlow</td><td>913.A008.016</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowa pompa persytaltyczna serii 200</td><td>Watson Marlow</td><td>205CA</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa x 15 m (zbiorniki dozujące)</td><td>Rurka silikonowa VWR</td><td>SFM1-3250</td><td></td></tr><tr><td>x 15 m (duża do dopływu/odpływu)</td><td>VWR</td><td>SFM1-5450</td><td></td></tr><tr><td>2,5 l szklany winchester pk 4</td><td>Fisher Scienctific</td><td>BTF-505-050B</td><td></td></tr> mieszadło <tr><td>magnetyczne 51 x 8 mm pk 10</td><td>Fisher Scienctific</td><td>FB55595&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian (MS222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>17&alfa;-etynyloestradiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4876-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Hayman Kimia</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>SPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/8 cala Rurki PTFE "słomki" oznaczone kolorem PK 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57276</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe wkładki do rozdzielacza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57059</td><td></td></tr><tr><td>rurki filtracyjne bez fryt 6 ml pk 30</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57242</td><td></td></tr><tr><td>adaptery rezerwowe PK 12</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57020-U</td><td></td></tr><tr><td>obciążnik ze stali nierdzewnej do rozdzielacza pk 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57278</td><td></td></tr><tr><td>męski wtyk Luer do rozdzielacza pk 12</td><td>Kolektor próżniowy Sigma Aldrich</td><td>504351</td><td></td></tr><tr><td>SPE</td> Kurki odcinające <td>Sigma Aldrich</td><td>57265</td><td></td></tr><tr><td>do rozdzielacza odciągowego (supelco) PK 12</td><td>Waters</td><td>WAT054806</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50&nbsp;</td><td>Wody</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>Metanol klasy HPLC 2,5 l</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane 7 ml z pokrywkami (58 x 17 mm) PK 399</td><td>Fisher Scientific</td><td>TUL-520-031K</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td>próżniowa Hayman Kimia</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>, e.g., pompa próżniowa serii VP</td><td>Camlab</td><td>1136915</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

Związki zaburzające gospodarkę hormonalną stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Etynyloestradiol (EE2) i estron (E1) zostały niedawno wpisane na listę obserwacyjną zanieczyszczeń środowiska w ramach Europejskiej Ramowej Dyrektywy Wodnej. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Dużą część siły estrogenowej ścieków z oczyszczalni ścieków (WWTP) można przypisać odprowadzaniu estrogenów steroidowych, w tym estradiolu (E2), EE2 i E1, z powodu niepełnego usunięcia tych substancji w oczyszczalni. Ocena skuteczności procesów oczyszczania ścieków wymaga ilościowego oznaczenia poszczególnych substancji, najczęściej podejmowanego przy użyciu metod analizy chemicznej. Do najczęściej stosowanych metod należy chromatografia gazowa ze spektrometrią mas (GCMS/MS) lub chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LCMS/MS) z wykorzystaniem monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM). Chociaż jest to bardzo przydatne do celów regulacyjnych, ukierunkowana analiza chemiczna może dostarczyć jedynie danych na temat monitorowanych związków (i określonych metabolitów). Metody ekotoksykologiczne dodatkowo zapewniają, że wszelkie wytworzone produkty uboczne lub nieznane związki estrogenowe są również oceniane poprzez pomiar ich aktywności biologicznej. Dostępnych jest wiele testów biologicznych in vitro, w tym Yeast Estrogen Screen (YES), do pomiaru aktywności estrogenowej próbek ścieków. Analiza chemiczna w połączeniu z testami biologicznymi in vivo i in vitro stanowi użyteczny zestaw narzędzi do oceny skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do estrogenowych związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego. W artykule wykorzystano zestaw testów chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny konwencjonalnych, zaawansowanych i powstających procesów oczyszczania ścieków w badaniach laboratoryjnych i terenowych.

Próby zrozumienia wpływu ulepszeń procesów oczyszczania ścieków lub określenia najbardziej odpowiedniej technologii modernizacji urządzeń w ramach trzeciego stopnia oczyszczania w istniejących oczyszczalniach ścieków (WWTP) w odniesieniu do skuteczności usuwania aktywności zaburzającej gospodarkę hormonalną w odprowadzanych ściekach, wymagają nie tylko pomiaru kluczowych komponentów chemicznych wpływających do zakładu, ale także analizy produktów rozkładu, które również mogą wykazywać aktywność zaburzającą gospodarkę hormonalną. W ściekach bytowych najbardziej estrogennymi substancjami są hormony steroidowe: estron (E1), 17β-estradiol (E2) oraz 17α-etynyloestradiol (EE2)5,8. Estrogeny steroidowe są wydalane z organizmu głównie w postaci mieszaniny nieaktywnych koniugatów16,17. Koniugaty te ulegają w znacznym stopniu dekonjugacji w systemie kanalizacyjnym pod wpływem aktywności bakteryjnej, a dalsza degradacja zachodzi w oczyszczalni ścieków. Dekoniugowane steroidy są usuwane ze strumienia ścieków poprzez adsorpcję do osadu lub ulegają biodegradacji podczas oczyszczania wtórnego, co prowadzi najpierw do powstania produktów transformacji, a w konsekwencji może dojść do całkowitej mineralizacji pierwotnego aktywnego komponentu. Analiza chemiczna wszystkich poszczególnych związków w strumieniu ścieków byłaby trudna, czasochłonna i kosztowna, a ponadto nie objęłaby nieznanych komponentów aktywnych obecnych w próbce. Ponadto suma wkładu estrogennego każdego komponentu dostarczyłaby jedynie informacji o skumulowanej sile estrogennej analizowanych związków w próbce. Stanowi to ryzyko w sytuacjach, gdy procesy transformacji generują nieznane substancje estrogenne lub gdy dopływ ma pochodzenie przemysłowe. Połączenie analizy chemicznej z ekotoksykologicznymi testami biologicznymi in vivo i in vitro stanowi rozwiązanie problemu obecności nieznanych komponentów estrogennych w mieszaninach, takich jak oczyszczone ścieki. Testy in vitro, takie jak Yeast Estrogen Screen (YES), były szeroko stosowane do określania aktywności estrogennej ścieków i pomagania w identyfikacji aktywnych komponentów w oczyszczonych próbkach8,18,19. Niemniej jednak różnice między badaniami in vivo a in vitro mogą być znaczące11, a kompleksowa ocena nowych procesów pod kątem usuwania potencjału zaburzania gospodarki hormonalnej wymaga zastosowania zestawu testów chemicznych i ekotoksykologicznych.
Określenie, czy poszczególne oczyszczalnie lub procesy usuwają związki aktywne ze strumienia ścieków, można przeprowadzić za pomocą analizy chemicznej, której poprzedza ekstrakcja próbek, zagęszczanie oraz oczyszczanie ekstraktu przed analizą, najczęściej realizowaną przy użyciu metod LCMS(/MS) lub GCMS(/MS). Dane uzyskane z analizy chemicznej mogą być wykorzystane do oceny zgodności z poszczególnymi przewidywanymi stężeniami braku efektu (PNEC)20 lub normami jakości środowiska (EQS)21 dla konkretnych związków, dlatego metody te są kluczowe dla danych dotyczących zgodności regulacyjnej. Ponadto celowane lub niecelowane metody analizy chemicznej pozwalają na identyfikację i oznaczanie ilościowe poszczególnych związków lub izomerów w przeciwieństwie do metod biologicznych, które dają odpowiedź całkowitą. Metody analizy chemicznej umożliwiają zatem ocenę konkretnych związków w celu sprostania wyzwaniom związanym z oczyszczaniem ścieków w odniesieniu do poszczególnych oczyszczalni. Badania wykazały, że konwencjonalne oczyszczanie ścieków (np. oczyszczalnie z osadem czynnym) może być wysoce skuteczne w usuwaniu naturalnych hormonów steroidowych, choć usuwanie syntetycznego hormonu EE2 wykazuje zazwyczaj mniejszą efektywność. Badania terenowe z zastosowaniem zaawansowanych metod oczyszczania, wykorzystujących techniki takie jak ozonowanie, granulowany węgiel aktywny (GAC) i membrany, wykazały – choć przy wysokich kosztach – że mogą one służyć jako rozwiązanie końcowe (end-of-pipe) w celu usunięcia EE2 poniżej przewidywanych poziomów efektu oraz poniżej granic wykrywalności. Rysunek 3 przedstawia usuwanie EE2 przy użyciu GAC w komunalnej oczyszczalni ścieków w skali pilotowej. Badania przeprowadzone w skali pilotowej w komunalnych oczyszczalniach ścieków z zastosowaniem końcowego oczyszczania GAC wykazują również redukcję potencjału estrogennego po zastosowaniu GAC, zmierzoną za pomocą testu Yeast Estrogen Screen (YES), co przedstawiono na Rysunku 4.
<img alt="Rysunek 3" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig3.jpg" /> 
Rysunek 3. Przykładowe dane terenowe pokazujące usuwanie etynyloestradiolu po zaawansowanym oczyszczaniu trzecim stopniu. (A) Próbki są pobierane z oczyszczalni ścieków (WWTP) po konwencjonalnym oczyszczaniu (oczyszczalnia z osadem czynnym) zgodnie z procedurami opisanymi dla konserwacji próbek. (B) Próbki są ekstrahowane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej, a następnie oczyszczane w celu usunięcia substancji zakłócających przy użyciu SPE w fazie normalnej oraz chromatografii żelowej. (C) Oczyszczony, zagęszczony ekstrakt zostaje odparowany do małej objętości i analizowany za pomocą LCMS/MS z jonizacją elektrospray w trybie ujemnym w trybie MRM. Wyniki są obliczane z zastosowaniem standaryzacji wewnętrznej przy użyciu izotopowo znakowanych standardów wewnętrznych. W przedstawionym przykładzie EE2 występuje w końcowym ścieku z ASP w stężeniu powyżej przewidywanego poziomu braku efektu (PNEC) wynoszącego 0,1 ng/L i jest usuwany za pomocą GAC oraz ozonu (O3) do poziomu stężenia bezpiecznego dla środowiska. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig4.jpg" /> 
Rycina 4. Zdjęcie płytki testowej Yeast Estrogen Screen (YES) (A) wykazującej zmianę koloru z żółtego na czerwony, co wiąże się z aktywnością estrogenową próbek. Wykresy sporządzone na podstawie płytki testowej YES przedstawiające skorygowaną absorbancję (540 nm) wzorca estradiolu (B) oraz próbek ścieków oczyszczonych w procesie osadu czynnego (ASP) i za pomocą granulowanego węgla aktywnego (GAC) (C). Każda próbka została przebadana w dublecie. Ścieki ASP i GAC zostały poddane ekstrakcji i zagęszczeniu przy użyciu metod SPE opisanych w sekcji 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ozonowanie jest również skuteczną metodą usuwania estrogenów steroidowych i aktywności estrogennej z oczyszczonych w sposób konwencjonalny ścieków w oczyszczalniach. Ozon jest w stanie utlenić szeroki zakres zanieczyszczeń organicznych oraz rozpuszczonej materii organicznej w próbkach ścieków, zapewniając jednocześnie właściwości dezynfekcyjne. Skuteczność ozonowania zależy od charakterystyki wody, takiej jak pH, ilość materii organicznej oraz zastosowana dawka ozonu. Estrogeny, które są słabo usuwane w procesach konwencjonalnego oczyszczania, mogą zostać usunięte ze ścieków przy dawkach od 0,8 do 2 mg O3/mg DOC. Ozon jest selektywnym utleniaczem, który reaguje z centrami bogatymi w elektrony (nienasycone wiązania węgiel-węgiel, związki aromatyczne, w tym alkohole aromatyczne), co sprawia, że ozon znajduje zastosowanie w rozkładzie wielu EDC. Jednakże eliminacja poszczególnych związków nie musi prowadzić do całkowitej mineralizacji związku wyjściowego. Substancje organiczne po ozonowaniu mogą ulec przekształceniu, generując produkty pośrednie lub produkty uboczne utleniania, które obejmują szereg polarnych związków o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak aldehydy, ketony, kwasy karboksylowe, kwasy ketonowe i związki bromowane. Przykładami są bromiany, formaldehyd, acetaldehyd i kwasy karboksylowe. Za pomocą testów biologicznych in vivo i in vitro wykazano, że choć ozon utlenia niektóre substancje chemiczne tylko częściowo, powstałe główne produkty transformacji wykazują niższą potencję estrogenną, a zatem zastosowanie ozonu w odpowiedniej dawce prowadzi do wysokiego stopnia usunięcia aktywności estrogennej.
Jedną z głównych korzyści z dodatkowego oczyszczania ścieków jest ograniczenie feminizacji samców ryb w odbiornikach wód; jest to niekorzystny efekt, który może prowadzić do obniżenia płodności3. Badania in vivo z wykorzystaniem ryb (np. płoci lub głowicy) narażonych na działanie ścieków wykazują obecność żeńskich komórek zarodkowych lub oocytów w jądrach samców (np. jak pokazano na Ryc. 5). Interseksualizm lub obecność VTG u samców nie występuje lub jest znacząco ograniczona u ryb po zaawansowanym oczyszczaniu, takim jak GAC7 lub ozonowanie22. Badania te wykazują, że produkty transformacji powstające podczas ozonowania nie mają działania estrogennego, jednak nie odnosi się to do toksyczności wytworzonego effluentu. Kwestia ta została omówiona w innych badaniach, na przykład w pracy Magdeburg et al.23, która wykazuje, że produkty uboczne utleniania ozonem są toksyczne dla pstrąga tęczowego, ale toksyczność tę można usunąć poprzez następującą po ozonowaniu filtrację piaskową.
<img alt="Rysunek 5" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig5.jpg" /> 
Rysunek 5. Fotomikrografie prawidłowych gonad samca (A) oraz gonad interseksualnych (B, C) u dorosłych płoci (Rutilus rutilus) eksponowanych na ścieki w ocenie terenowej. Fotomikrograf A przedstawia przekrój histologiczny prawidłowego jądra samca. Fotomikrografy B i C przedstawiają przekroje histologiczne samca ryby o cechach interseksualnych po sześciomiesięcznej ekspozycji na odcieki z oczyszczalni ścieków z osadem czynnym. Strzałki wskazują oocyty obecne w tkance jądra. Pasek skali na każdym fotomikrografie odpowiada 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wysoki koszt oczyszczania końcowego (end-of-pipe) z wykorzystaniem ozonu, węgla aktywnego GAC lub technologii membranowych wymusza opracowanie alternatywnych, tańszych i zrównoważonych metod usuwania substancji zaburzających gospodarkę hormonalną (EDC). Co więcej, metody adsorpcji i separacji jedynie przenoszą EDC z jednej fazy do drugiej, zamiast eliminować je poprzez degradację. Opracowano aktywatory TAML, które katalizują utlenianie organicznych mikrozanieczyszczeń w ściekach za pomocą nadtlenku wodoru12,24-26. Aktywatory TAML z H2O2 skutecznie degradują EE2 oraz inne estrogeny steroidowe w czystej wodzie laboratoryjnej, a także w odciekach z miejskich oczyszczalni ścieków i w próbkach moczu wzbogaconych o analizowane związki12. Badania laboratoryjne wykazują, że proces TAML/H2O2 zapewnia wysoki stopień usuwania estrogenów steroidowych, w tym EE2, znacząco redukuje aktywność estrogenną mierzoną in vitro za pomocą bioanalizy YES oraz istotnie ogranicza feminizację ryb in vivo mierzoną za pomocą bioanalizy VTG (Rycina 1 oraz Rycina 6).
<img alt="Rycina 6" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig6.jpg" /> 
Rycina 6. Średnie stężenie EE2 i aktywność estrogenna w wodzie w zbiornikach traktowanych i nietraktowanych (A) oraz witellogenina w osoczu samców ryb w stanie bazowym i po ekspozycji (B). A) Stężenie EE2 (ng/L, ciemnoniebieskie słupki) zmierzono za pomocą LCMS/MS, a aktywność estrogenną (ekwiwalent EE2 ng/L, ciemnozielone słupki) za pomocą testu in vitro Yeast Estrogen Screen (YES). B) Stężenie witellogeniny w osoczu (ng/ml, jasnoniebieskie słupki) u samców golowaców zostało zmierzone za pomocą ilościowego testu immunoenzymatycznego (ELISA). Wyniki analizy chemicznej EE2 raportowane jako &#60; 0,03 ng/L EE2 (t.j. poniżej granicy wykrywalności (LOD)) traktowano jako połowę LOD (t.j. 0,015 ng/L EE2) do obliczeń średnich, błędu standardowego i analizy statystycznej. Wartości EE2 i aktywności estrogennej stanowią średnie stężenia zmierzone w próbkach pobranych w ciągu 21-dniowej ekspozycji. Poziom VTG w osoczu zmierzono przed ekspozycją (stan bazowy) oraz po 21 dniach ekspozycji. Schemat traktowania obejmował: kontrolę negatywną (sama woda do rozcieńczania), EE2+H2O2+TAML, EE2+H2O2 oraz sam EE2. Słupki błędu na wykresie A reprezentują błąd standardowy średniej, a słupki błędu na wykresie B reprezentują odchylenie standardowe. Litery nad słupkami na wykresie B oznaczają podobieństwo statystyczne. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Mills et al.12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in ...

Ogólnym celem opisanego tutaj zestawu testów, obejmującego chemię analityczną oraz metody in vitro i in vivo, jest określenie skuteczności rozwijanych i nowoczesnych technologii oczyszczania ścieków w usuwaniu zanieczyszczeń estrogennych. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu inżynierii środowiska, na przykład przy wyborze najskuteczniejszych procesów oczyszczania ścieków w zależności od potencjału estrogennego ścieków. Główną zaletą tych technik jest ich czułość na bardzo niskie stężenia związków aktywnych, co pozwala wskazać najlepsze technologie ochrony życia wodnego.Procedury zostaną zaprezentowane przez pracownika postdoktorskiego, dr. Chrisa Greena, doktorantkę Angelę Pinzon, pracownika naukowego dr Alice Baynes oraz starszego technika badawczego Nicolę Beresford. Proces SPE wymaga ścisłego przestrzegania zasad czystości i porządku w celu uniknięcia kontaminacji próbek. Wszystkie probówki, krany i frity należy uprzednio oczyścić metanolem.Przed analizą próbek należy podłączyć linie transferowe do kolektora ekstrakcyjnego i przepłukać cały system wodą dejonizowaną. Aby rozpocząć analizę próbek, w pierwszej kolejności należy założyć jednorazowe wkładki zaworowe, a następnie zamocować wkłady SPE styren-divinylbenzenowe. Następnie do każdego zbiornika należy nalać pipetą 5 mL octanu etylu w celu kondycjonowania wkładów.Podczas tego kroku upewnij się, że SPE jest szczelnie zamknięte. Następnie uruchom pompę próżniową, aby uzyskać szybkość przepływu 10 mm/min. Zanim wkłady wyschną, wprowadź 5 mL metanolu, a następnie 5 mL wody.Bardzo ważne jest, aby wkłady SPE nie wyschły. Gdy woda zostanie w większości przepuszczona, należy wyłączyć pompę i dopełnić zbiorniki każdego wkładu wodą. Następnie należy połączyć zbiorniki wkładów ze szklanymi butelkami na próbki za pomocą rurek PTFE o średnicy 1/8 cala.Następnie przełącz próżnię na szybkość przepływu poniżej 10 ml/min i pozwól całej próbce przejść przez wkład. Następnie dokładnie osusz wклады SPE, aż zawartość wkładu zmieni kolor. W tym celu użyj próżni lub strumienia gazu.Teraz należy włożyć czyste, suche szklane fiolki do probek o pojemności 10 mililitrów do statywu i umieścić statyw wewnątrz manifoldu do ekstrakcji. Należy upewnić się, że każdy wkład znajduje się nad fiolką. Napełnić zbiorniki na próbkę dwukrotnie po cztery mililitry, co daje łącznie osiem mililitrów dichlorometanu, włączyć pompę próżniową i pozwolić cieczy przepłynąć przez SPE do fiolek do probek.Następnie należy użyć koncentratora, aby zredukować objętość we wszystkich probówkach zbiorczych do 1 ml. Przenieś każdą próbkę do fiolki do autopróbnika i dalej zagęszcz je do 100 µL, używając urządzenia do odparowywania azotem. Kolejnym etapem procesu jest zastosowanie GPC w celu usunięcia interferencji makromolekularnych.W pierwszej kolejności wstrzyknij 95 µL ekstraktu z elowanej próbki do układu HPLC wyposażonego w kolumnę GPC. Skoncentruj ekstrakt GPC do objętości 200 µL za pomocą koncentratora oraz urządzenia do odparowywania strumieniem azotu, a następnie dopełnij go heksanem do dwóch ml. Następnie zamocuj jednorazowe wkładki zaworowe, kartridże amino purple oraz zbiorniki na kartridże do manifoldu SPE oraz szklane fiolki zbierające o pojemności 10 ml.Następnie wprowadź dwa mililitry heksanu do każdego kartridża w celu ich kondycjonowania, a następnie odrzuć rozpuszczalnik. Potem wprowadź ekstrakt z próbki GPC do zbiornika i przessij go przez kolumnę. Odstaw naczynie z zebranym ekstraktem, a w statywie umieść nową fiolkę do zebrania roztworu płuczącego.Następnie przepuść przez wkład dwa mililitry 30% obj. octanu etylu i heksanu. Potem dodaj kolejne dwa mililitry octanu etylu i heksanu, odrzuć zebrane frakcje roztworu płuczącego i umieść probówkę zbiorczą o pojemności 10 mililitrów z powrotem w statywie. Teraz wlej do zbiornika dwa mililitry 50% obj. octanu etylu i acetonu i uruchom pompę przy niskiej prędkości przepływu, poniżej dwóch mililitrów na minutę.Po przesączeniu cieczy do zbiornika należy dodać kolejne 2 mL 50% octanu etylu. Następnie, za pomocą koncentratora, należy zredukować objętość ekstraktu do 1 mL. Po tym próbkę należy przenieść do mniejszej szklanej fiolki i za pomocą urządzenia do odparowywania strumieniem azotu odparować ekstrakt niemal do suchości. Należy dodać 100 µL metanolu, dobrze wymieszać próbkę i przenieść ją do fiolki autopróbnika z wkładką 0,3 mL.Następnie przeprowadź analizę ekstraktu metodą LC-MS/MS. Dzień przed rozpoczęciem testu przygotuj świeżą pożywkę i zaszczep ją z dysku tenax szczepu HER użytego w badaniu. Następnego dnia przygotuj się do testu, sporządzając seryjne rozcieńczenia chemikaliów testowych lub ekstraktów ścieków o objętości 100 µL, a następnie krzywą wzorcową E2 w etanolu.Teraz przenieś aliquoty o objętości 10 µL do opisanej, sterylnej płytki 96-dołkowej. Następnie pozostaw płytkę bez przykrycia, aby odparował etanol. W kolejnym kroku przygotuj 50 mL pożywki wzrostowej z dodatkiem 0,5 mL roztworu CPRG.Z 24-godzinnej hodowli drożdżowej zmierz mętność przy 620 nanometrach, aby oszacować gęstość komórek. Następnie dodaj 40 milionów komórek drożdży do 50 mililitrów podłoża assay. Przenieś zaszczepione podłoże assay do sterylnego korytka i za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 200 mikrolitrów podłoża do każdej studzienki płytki assay.Załóż pokrywkę płytki do analizy, uszczelnij krawędzie taśmą i intensywnie wstrząsaj płytką przez dwie minuty, używając wytrząsarki do płytek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 32 Celsius w naturalnie wentylowanej komorze grzewczej. Po trzech dniach inkubacji ponownie wstrząśnij płytką, a następnie pozostaw drożdże do osadzenia na około jedną godzinę.Na koniec zmierz absorbancję światła próbek przy 540 i 620 nanometrach. Próbki wody z konwencjonalnej oczyszczalni ścieków z aktywnym procesem osadowym przeanalizowano za pomocą LCMS z elektrorznawiem jonów ujemnych; stwierdzono obecność etynyloestradiolu w stężeniu przekraczającym przewidywany poziom braku efektu. Dzięki zastosowaniu zaawansowanego oczyszczania wody, takiego jak granulowany węgiel aktywny (GAC), możliwe było znaczne obniżenie poziomów etynyloestradiolu.Wszystkie ekstrakty ze ścieków analizowano z użyciem znakowanego izotopowo standardu wewnętrznego (czerwony pik) w celu umożliwienia kwantyfikacji. Test przesiewowy z użyciem drożdży na obecność estrogenów wykazał wyraźną wrażliwość na standard estradiol, lecz nie wykazał żadnej odpowiedzi w przypadku etanolu, który pełnił rolę próbki blank. Komórki w teście przesiewowym z drożdżami reagowały wyraźnie na ścieki z procesu osadów czynnych, podczas gdy ścieki oczyszczone za pomocą GAC wywołały osłabioną odpowiedź, choć nadal pozostawały bardziej biologicznie aktywne niż próbka blank.Dzięki zastosowaniu tej nowatorskiej technologii oczyszczania ścieków, zarówno stężenie etynyloestradiolu, zaznaczone kolorem niebieskim, jak i aktywność estrogenna, zaznaczona kolorem zielonym, zostały znacząco zredukowane poprzez łączną obróbkę nadtlenkiem wodoru i TAML. Oczyszczalnie ścieków są głównym źródłem zanieczyszczenia wód powierzchniowych substancjami estrogennymi. Nowe metody procesów uzdatniania wody w celu poprawy jakości tych ścieków wymagają pogłębionych badań aktywności estrogennej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć zestaw testów chemicznych i ekotoksykologicznych, niezbędnych do pomiaru aktywności estrogennej w próbkach wody. Niezwykle ważne jest zapewnienie minimalizacji zanieczyszczeń próbek i ekstraktów poprzez ich staranne obchodzenie. Na przykład powszechnie stosowane tworzywa sztuczne zawierają związki estrogenne, dlatego niezbędne jest zastosowanie kontroli negatywnych w celu sprawdzenia zanieczyszczeń chemicznych oraz kontroli pozytywnych, aby upewnić się, że metoda ekstrakcji zadziałała i uzyskano dobrą odzyskowalność dodanych estrogenów.

use-battery-chemical-ecotoxicological-methods-for-assessment-efficacy

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Przedstawiono protokół ekstrakcji i wstępnego zatężania estradiolu z próbek wody za pomocą zautomatyzowanego i zminiaturyzowanego systemu.

Prosta metoda automatycznej ekstrakcji próbek wody do fazy stałej do analizy immunologicznej małych zanieczyszczeń

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować płynowe biochipy z komórkami nabłonkowymi skrzeli pstrąga tęczowego do użycia w przenośnym czujniku impedancji podłoża elektrycznego ogniwa.  Opisano również protokół przeprowadzania szybkiego testu toksyczności wody pitnej za pomocą czujnika.

Przygotowanie i testowanie opartych na impedancji biochipów fluidycznych z ogniwami RTgill-W1 do szybkiej oceny próbek wody pitnej pod kątem toksyczności

Protokół badania przesiewowego pod kątem aktywności endokrynologicznej w organicznych ekstraktach próbek wody, w tym ścieków oczyszczonych i wód powierzchniowych (odbierających), został dostosowany przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych in vitro transaktywacji z zatrzymaniem ("zamrożenie i rozmrożenie").

Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Ten artykuł podsumowuje cechy projektu i skuteczność systemów uzdatniania, które oczyszczają wodę deszczową z miast i spływy irygacyjne z rolnictwa w celu usunięcia pestycydów i innych zanieczyszczeń związanych z toksycznością dla środowiska wodnego.

Roślinne systemy uzdatniania do usuwania zanieczyszczeń związanych z toksycznością wód powierzchniowych w rolnictwie i spływach miejskich

Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany ekran estrogenów drożdżowych do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej (PCP), które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje dwie opcje substratów kolorymetrycznych, sześciodniową inkubację w chłodzie do wykorzystania na studiach licencjackich oraz narzędzia statystyczne do analizy danych.

Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

Narażenie na toksyczne czynniki środowiskowe może poważnie wpłynąć na rozwój z długoterminowymi skutkami. Przedstawiono szczegółowe protokoły ilustrujące strategię wykorzystującą skuteczny model laboratoryjny do badania wpływu wczesnej ekspozycji embrionalnej na bisfenol A. Zapewniamy testy płodności i behawioralne w celu monitorowania skuteczności naszych testów biologicznych narażenia na toksyny.

Długoterminowe behawioralne i reprodukcyjne konsekwencje narażenia zarodków na toksyczne substancje w niskich dawkach

Przedstawiamy protokół do analizy nieukierunkowanej, wykorzystujący spektrometrię mas czasu przelotu jako doskonałe narzędzie do identyfikacji farmaceutyków w wodach. Demonstrujemy zastosowanie promieniowania UV do ich eliminacji. Przedstawiono analizę obejmującą napromienianie, izolację związków, identyfikację i modelowanie kinetyczne profili degradacji.

Identyfikacja farmaceutyków w środowisku wodnym za pomocą HPLC-ESI-Q-TOF-MS i eliminacja erytromycyny poprzez degradację indukowaną światłem

Ilościowe modelowanie zależności struktura-aktywność (QSAR) jest reprezentatywną metodą wspomaganą bioinformatyką w toksykologicznych badaniach przesiewowych. Protokół ten pokazuje, jak obliczeniowo oceniać ryzyko związane z substancjami zaburzającymi funkcjonowanie układu hormonalnego (ED) w środowisku wodnym. Wykorzystując zestaw narzędzi OECD QSAR Toolbox, protokół implementuje test in silico do analizy toksyczności substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego u ryb.

Metoda modelowania in silico w obliczeniowej toksykologii wodnej substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego: podejście oparte na oprogramowaniu z wykorzystaniem zestawu narzędzi QSAR

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. W tym miejscu opisujemy metodologie izolowania i testowania drobnoustrojów prezentujących zdolność bioremediacji i potencjalne cechy probiotyczne dla koralowców.

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Obecny jest tutaj szczegółowy protokół użycia zarodków danio pręgowanego Tg(vtg1: mCherry) do wykrywania efektów estrogenowych. Protokół obejmuje rozmnażanie ryb i leczenie zarodków, a także kładzie nacisk na wykrywanie, dokumentowanie i ocenę sygnałów fluorescencyjnych indukowanych przez związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC).

Wykorzystanie zarodków zebry danio pręgowanego TG (Vtg1:mcherry) do testowania estrogennego działania związków zaburzających gospodarkę hormonalną

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Poznaj metody analityczne i ekotoksykologiczne do oceny skuteczności usuwania estrogenów z ścieków. Techniki LC-MS/MS i testy in vitro pomagają wybrać najlepsze technologie ochrony ekosystemów wodnych.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Przeglądaj więcej filmów