Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Ogólnym celem opisanego tutaj zestawu testów, obejmującego chemię analityczną oraz metody in vitro i in vivo, jest określenie skuteczności rozwijanych i nowoczesnych technologii oczyszczania ścieków w usuwaniu zanieczyszczeń estrogennych. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu inżynierii środowiska, na przykład przy wyborze najskuteczniejszych procesów oczyszczania ścieków w zależności od potencjału estrogennego ścieków. Główną zaletą tych technik jest ich czułość na bardzo niskie stężenia związków aktywnych, co pozwala wskazać najlepsze technologie ochrony życia wodnego.

Procedury zostaną zaprezentowane przez pracownika postdoktorskiego, dr. Chrisa Greena, doktorantkę Angelę Pinzon, pracownika naukowego dr Alice Baynes oraz starszego technika badawczego Nicolę Beresford. Proces SPE wymaga ścisłego przestrzegania zasad czystości i porządku w celu uniknięcia kontaminacji próbek. Wszystkie probówki, krany i frity należy uprzednio oczyścić metanolem.

Przed analizą próbek należy podłączyć linie transferowe do kolektora ekstrakcyjnego i przepłukać cały system wodą dejonizowaną. Aby rozpocząć analizę próbek, w pierwszej kolejności należy założyć jednorazowe wkładki zaworowe, a następnie zamocować wkłady SPE styren-divinylbenzenowe. Następnie do każdego zbiornika należy nalać pipetą 5 mL octanu etylu w celu kondycjonowania wkładów.

Podczas tego kroku upewnij się, że SPE jest szczelnie zamknięte. Następnie uruchom pompę próżniową, aby uzyskać szybkość przepływu 10 mm/min. Zanim wkłady wyschną, wprowadź 5 mL metanolu, a następnie 5 mL wody.

Bardzo ważne jest, aby wkłady SPE nie wyschły. Gdy woda zostanie w większości przepuszczona, należy wyłączyć pompę i dopełnić zbiorniki każdego wkładu wodą. Następnie należy połączyć zbiorniki wkładów ze szklanymi butelkami na próbki za pomocą rurek PTFE o średnicy 1/8 cala.

Następnie przełącz próżnię na szybkość przepływu poniżej 10 ml/min i pozwól całej próbce przejść przez wkład. Następnie dokładnie osusz wклады SPE, aż zawartość wkładu zmieni kolor. W tym celu użyj próżni lub strumienia gazu.

Teraz należy włożyć czyste, suche szklane fiolki do probek o pojemności 10 mililitrów do statywu i umieścić statyw wewnątrz manifoldu do ekstrakcji. Należy upewnić się, że każdy wkład znajduje się nad fiolką. Napełnić zbiorniki na próbkę dwukrotnie po cztery mililitry, co daje łącznie osiem mililitrów dichlorometanu, włączyć pompę próżniową i pozwolić cieczy przepłynąć przez SPE do fiolek do probek.

Następnie należy użyć koncentratora, aby zredukować objętość we wszystkich probówkach zbiorczych do 1 ml. Przenieś każdą próbkę do fiolki do autopróbnika i dalej zagęszcz je do 100 µL, używając urządzenia do odparowywania azotem. Kolejnym etapem procesu jest zastosowanie GPC w celu usunięcia interferencji makromolekularnych.

W pierwszej kolejności wstrzyknij 95 µL ekstraktu z elowanej próbki do układu HPLC wyposażonego w kolumnę GPC. Skoncentruj ekstrakt GPC do objętości 200 µL za pomocą koncentratora oraz urządzenia do odparowywania strumieniem azotu, a następnie dopełnij go heksanem do dwóch ml. Następnie zamocuj jednorazowe wkładki zaworowe, kartridże amino purple oraz zbiorniki na kartridże do manifoldu SPE oraz szklane fiolki zbierające o pojemności 10 ml.

Następnie wprowadź dwa mililitry heksanu do każdego kartridża w celu ich kondycjonowania, a następnie odrzuć rozpuszczalnik. Potem wprowadź ekstrakt z próbki GPC do zbiornika i przessij go przez kolumnę. Odstaw naczynie z zebranym ekstraktem, a w statywie umieść nową fiolkę do zebrania roztworu płuczącego.

Następnie przepuść przez wkład dwa mililitry 30% obj. octanu etylu i heksanu. Potem dodaj kolejne dwa mililitry octanu etylu i heksanu, odrzuć zebrane frakcje roztworu płuczącego i umieść probówkę zbiorczą o pojemności 10 mililitrów z powrotem w statywie. Teraz wlej do zbiornika dwa mililitry 50% obj. octanu etylu i acetonu i uruchom pompę przy niskiej prędkości przepływu, poniżej dwóch mililitrów na minutę.

Po przesączeniu cieczy do zbiornika należy dodać kolejne 2 mL 50% octanu etylu. Następnie, za pomocą koncentratora, należy zredukować objętość ekstraktu do 1 mL. Po tym próbkę należy przenieść do mniejszej szklanej fiolki i za pomocą urządzenia do odparowywania strumieniem azotu odparować ekstrakt niemal do suchości. Należy dodać 100 µL metanolu, dobrze wymieszać próbkę i przenieść ją do fiolki autopróbnika z wkładką 0,3 mL.

Następnie przeprowadź analizę ekstraktu metodą LC-MS/MS. Dzień przed rozpoczęciem testu przygotuj świeżą pożywkę i zaszczep ją z dysku tenax szczepu HER użytego w badaniu. Następnego dnia przygotuj się do testu, sporządzając seryjne rozcieńczenia chemikaliów testowych lub ekstraktów ścieków o objętości 100 µL, a następnie krzywą wzorcową E2 w etanolu.

Teraz przenieś aliquoty o objętości 10 µL do opisanej, sterylnej płytki 96-dołkowej. Następnie pozostaw płytkę bez przykrycia, aby odparował etanol. W kolejnym kroku przygotuj 50 mL pożywki wzrostowej z dodatkiem 0,5 mL roztworu CPRG.

Z 24-godzinnej hodowli drożdżowej zmierz mętność przy 620 nanometrach, aby oszacować gęstość komórek. Następnie dodaj 40 milionów komórek drożdży do 50 mililitrów podłoża assay. Przenieś zaszczepione podłoże assay do sterylnego korytka i za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 200 mikrolitrów podłoża do każdej studzienki płytki assay.

Załóż pokrywkę płytki do analizy, uszczelnij krawędzie taśmą i intensywnie wstrząsaj płytką przez dwie minuty, używając wytrząsarki do płytek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 32 Celsius w naturalnie wentylowanej komorze grzewczej. Po trzech dniach inkubacji ponownie wstrząśnij płytką, a następnie pozostaw drożdże do osadzenia na około jedną godzinę.

Na koniec zmierz absorbancję światła próbek przy 540 i 620 nanometrach. Próbki wody z konwencjonalnej oczyszczalni ścieków z aktywnym procesem osadowym przeanalizowano za pomocą LCMS z elektrorznawiem jonów ujemnych; stwierdzono obecność etynyloestradiolu w stężeniu przekraczającym przewidywany poziom braku efektu. Dzięki zastosowaniu zaawansowanego oczyszczania wody, takiego jak granulowany węgiel aktywny (GAC), możliwe było znaczne obniżenie poziomów etynyloestradiolu.

Wszystkie ekstrakty ze ścieków analizowano z użyciem znakowanego izotopowo standardu wewnętrznego (czerwony pik) w celu umożliwienia kwantyfikacji. Test przesiewowy z użyciem drożdży na obecność estrogenów wykazał wyraźną wrażliwość na standard estradiol, lecz nie wykazał żadnej odpowiedzi w przypadku etanolu, który pełnił rolę próbki blank. Komórki w teście przesiewowym z drożdżami reagowały wyraźnie na ścieki z procesu osadów czynnych, podczas gdy ścieki oczyszczone za pomocą GAC wywołały osłabioną odpowiedź, choć nadal pozostawały bardziej biologicznie aktywne niż próbka blank.

Dzięki zastosowaniu tej nowatorskiej technologii oczyszczania ścieków, zarówno stężenie etynyloestradiolu, zaznaczone kolorem niebieskim, jak i aktywność estrogenna, zaznaczona kolorem zielonym, zostały znacząco zredukowane poprzez łączną obróbkę nadtlenkiem wodoru i TAML. Oczyszczalnie ścieków są głównym źródłem zanieczyszczenia wód powierzchniowych substancjami estrogennymi. Nowe metody procesów uzdatniania wody w celu poprawy jakości tych ścieków wymagają pogłębionych badań aktywności estrogennej.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć zestaw testów chemicznych i ekotoksykologicznych, niezbędnych do pomiaru aktywności estrogennej w próbkach wody. Niezwykle ważne jest zapewnienie minimalizacji zanieczyszczeń próbek i ekstraktów poprzez ich staranne obchodzenie. Na przykład powszechnie stosowane tworzywa sztuczne zawierają związki estrogenne, dlatego niezbędne jest zastosowanie kontroli negatywnych w celu sprawdzenia zanieczyszczeń chemicznych oraz kontroli pozytywnych, aby upewnić się, że metoda ekstrakcji zadziałała i uzyskano dobrą odzyskowalność dodanych estrogenów.