Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Ogólnym celem przedstawionego tutaj zestawu testów, w tym chemii analitycznej oraz metod in vitro i in vivo, jest określenie skuteczności pojawiających się i nowatorskich technologii oczyszczania ścieków w celu usunięcia zanieczyszczeń estrogenowych. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w inżynierii środowiska, na przykład przy wyborze najbardziej efektywnych procesów oczyszczania ścieków w ruchomej sile estrogenowej ścieków. Główną zaletą tych technik jest to, że są one wrażliwe na bardzo niskie stężenia związków aktywnych, co świadczy o najlepszych technologiach ochrony organizmów wodnych.

Procedury zostaną zademonstrowane przez doktora habilitowanego, dr Chrisa Greena, doktorantkę, Angelę Pinzon, pracownika naukowego, dr Alice Baynes i starszego technika badawczego, Nicolę Beresford. Proces SPE wymaga szczególnej dbałości o czystość i porządek, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbki. Wstępnie oczyść wszystkie rurki, krany i frytki metanolem.

Przed uruchomieniem próbek należy podłączyć przewody przesyłowe do kolektora ekstrakcyjnego i przepłukać cały system wodą dejonizowaną. Aby uruchomić próbki, najpierw przymocuj jednorazowe wkładki zaworów, a następnie załóż wkłady SPE ze styrenu diwinylobenzenu. Następnie odpipetuj pięć mililitrów octanu etylu do każdego zbiornika, aby kondycjonować wkłady.

Na tym etapie upewnij się, że SPE jest zapieczętowany. Następnie włącz pompę próżniową na natężenie przepływu 10 milimetrów na minutę. Zanim wkłady wyschną, załaduj pięć mililitrów metanolu, a następnie pięć mililitrów wody.

Bardzo ważne jest, aby wkłady SPE nie wysychały. Po tym, jak woda w większości się wchłonie, wyłącz pompę i uzupełnij wodą każdy zbiornik wkładu. Następnie podłącz rurki PTFE 1/8 cala między zbiornikami wkładu a szklanymi butelkami na próbki.

Teraz przełącz próżnię na natężenie przepływu poniżej 10 mililitrów na minutę i pozwól całej próbce przejść przez wkład. Następnie dokładnie wysusz wkłady SPE, aż zawartość wkładu zmieni kolor. Użyj odkurzacza lub strumienia gazu.

Teraz załaduj czyste, suche, 10-mililitrowe szklane fiolki do zbierania do stojaka i umieść stojak w kolektorze ekstrakcyjnym. Sprawdzić, czy każda wkładka znajduje się nad fiolką. Załaduj zbiorniki na próbki dwoma razy cztery mililitry, co daje w sumie osiem mililitrów dichlorometanu, włącz pompę próżniową i pozwól, aby ciecz przeszła przez SPE i trafiła do fiolek zbiorczych.

Następnie użyj koncentratora, aby zmniejszyć objętość we wszystkich fiolkach zbiorczych do jednego mililitra. Przenieś każdą próbkę do fiolki automatycznego podajnika próbek i zagęść ją do 100 mikrolitrów za pomocą sprzętu do oddmuchiwania azotu. Kolejnym etapem procesu jest użycie GPC do usunięcia zakłóceń makromolekularnych.

Najpierw wstrzyknij 95 mikrolitrów ekstraktu z próbki do HPLC wyposażonego w GPC. Skoncentruj ekstrakt GPC do 200 mikrolitrów za pomocą koncentratora i aparatu do oddmuchiwania azotu, a następnie napełnij go do dwóch mililitrów heksanem. Następnie przymocuj jednorazowe wkładki zaworów, wkłady aminofioletowe i zbiorniki wkładów do kolektora SPE i przez 10-mililitrowe szklane fiolki do zbierania.

Teraz załaduj dwa mililitry heksanu do każdego wkładu, aby je kondycjonować i wyrzucić rozpuszczalnik. Następnie załaduj ekstrakt próbki GPC do zbiornika i zassaj go. Odłóż kolekcję ekstraktu na bok i umieść fiolkę w stojaku, aby zebrać popłuczynę.

Następnie przepuść przez wkład dwa mililitry octanu etylu i heksanu o 30 procentach objętości. Następnie dodaj jeszcze dwa mililitry octanu etylu i heksanu, a następnie wyrzuć zebrane roztwory myjące i włóż 10-mililitrową fiolkę do stojaka. Teraz dodaj do zbiornika dwa mililitry octanu etylu i acetonu o 50 procentach objętości i acetonu i uruchom pompę przy niskim natężeniu przepływu, poniżej dwóch mililitrów na minutę.

Po przeciągnięciu się cieczy dodaj kolejne dwa mililitry 50-procentowego octanu etylu do zbiornika. Teraz użyj koncentratora, aby zmniejszyć objętość ekstraktu do jednego mililitra. Następnie przenieś próbkę do mniejszej szklanej fiolki i użyj sprzętu do oddmuchiwania azotu, aby odparować ekstrakt do początków, aby dodać 100 mikrolitrów metanolu, dobrze wymieszać próbkę i przenieść ją do fiolki automatycznego podajnika próbek z wkładką o pojemności 0,3 mililitra.

Następnie należy przeprowadzić analizę ekstraktu metodą LC-MS/MS. Dzień przed rozpoczęciem testu przygotuj świeżą pożywkę wzrostową i zaszczep ją dokiem tenax używanego szczepu HER. Następnego dnia należy przygotować się do oznaczenia, wykonując 100 mikrolitrów seryjnych urojeń badanych substancji chemicznych lub ekstraktów ściekowych, a następnie krzywą wzorcową E2 w etanolu.

Teraz przenieś 10 mikrolitrów porcji na oznakowaną sterylną płytkę 96-dołkową. Następnie pozostaw płytkę odkrytą, aby odparować etanol. Następnie przygotuj 50 mililitrów pożywki wzrostowej z 0,5 mililitra roztworu CPRG.

Z 24-godzinnej hodowli drożdży zmierz zmętnienie na 620 nanometrach, aby oszacować gęstość komórek. Następnie dodaj 40 milionów komórek drożdży do 50 mililitrów pożywki testowej. Przenieś zaszczepioną pożywkę testową do sterylnego koryta i użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 200 mikrolitrów pożywki do każdej studzienki płytki testowej.

Załóż pokrywę płytki testowej, uszczelnij krawędzie taśmą i energicznie potrząsaj płytką testową przez dwie minuty za pomocą wytrząsarki do płytek. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 32 stopni Celsjusza w naturalnie wentylowanej komorze grzewczej. Po trzech dniach inkubacji powtórz wstrząs, a następnie pozwól drożdżom osiąść na około godzinę.

Na koniec zmierz absorbenty światła w próbkach przy 540 i 620 nanometrach. Próbki wody z konwencjonalnego planu oczyszczania ścieków w celu aktywacji procesu osadu analizowano za pomocą elektronatrysku jonów ujemnych LCMS, etynyloestradiol był obecny w stężeniu powyżej przewidywanego poziomu braku efektów. Dzięki zastosowaniu zaawansowanego uzdatniania wody, takiego jak granulowany węgiel aktywny lub GAC, możliwe było znaczne obniżenie poziomu etynyloestradiolu.

Wszystkie ekstrakty ściekowe analizowano za pomocą izotopowo znakowanego wzorca wewnętrznego, czerwonego piku, aby umożliwić kwantyfikację. Test przesiewowy drożdży do estrogenu był wyraźnie wrażliwy na standardowy estradiol, ale nie wybrał żadnej odpowiedzi na etanol, który jest zasadniczo ślepą próbą. Komórki sitowe drożdży wyraźnie reagowały na ścieki z procesu osadu czynnego, podczas gdy ścieki poddane działaniu GAC powodowały zmniejszoną odpowiedź, ale nadal były bardziej aktywne biologicznie niż ślepa próba.

Dzięki tej nowatorskiej technologii oczyszczania ścieków, zarówno stężenie etanolu estradiolu, pokazane na niebiesko, jak i aktywność estrogenowa, pokazane na zielono, zostały znacznie zmniejszone przez skojarzone oczyszczanie nadtlenkiem wodoru i TAML. Oczyszczalnie ścieków są głównym źródłem zanieczyszczenia wód powierzchniowych substancjami estrogenowymi. Nowe sposoby procesów uzdatniania wody w celu poprawy tych ścieków wymagają dogłębnych badań aktywności estrogenowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć baterię testów chemicznych i ekotoksykologicznych, potrzebnych do pomiaru aktywności estrogenowej w próbkach wody. Niezwykle ważne jest, aby upewnić się, że zanieczyszczenie próbek i ekstraktów jest zminimalizowane dzięki ostrożnemu obchodzeniu się z próbkami i ekstraktami. Na przykład powszechnie stosowane tworzywa sztuczne zawierają związki estrogenowe, dlatego konieczne jest uwzględnienie kontroli ujemnych w celu sprawdzenia zanieczyszczenia chemicznego oraz kontroli pozytywnych w celu sprawdzenia, czy metoda ekstrakcji zadziałała i czy następuje dobry odzysk wzbogaconych estrogenów.