Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Ogólnym celem tych eksperymentów jest określenie roli makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach nowotworowych przy użyciu syngenaicznego modelu raka piersi. Metoda ta może odpowiedzieć na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie immunologii nowotworów i przerzutów nowotworowych, takich jak to, dlaczego płuca są jednym z najczęstszych celów przerzutów raka hepatogennego. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje ona bardzo dobrze sprawdzony model raka piersi z bardzo specyficzną metodą mikrofagów pęcherzyków płucnych.

Tę procedurę zademonstruje Surya Kumari Vadrevu, pracownik naukowy w moim laboratorium. W dniu wstrzyknięcia komórek nowotworowych najpierw umieść ogoloną, znieczuloną mysz na podkładce chirurgicznej. Następnie odessać jeden raz od 10 do piątej komórki nowotworowej w 100 mikrolitrach PBS do pięciomililitrowej strzykawki insulinowej o temperaturze zerowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 29.

Następnie użyj kciuka i palca wskazującego, aby podnieść skórę w pobliżu drugiego i trzeciego sutka i włóż igłę pod skórę do poduszeczki tłuszczowej sutka tuż poniżej trzeciego sutka. Powoli wstrzyknąć podskórnie komórki, aby utworzyły pęcherzyk pod skórą, a następnie przywrócić zwierzę do klatki pod nadzorem, aż w pełni wyzdrowieje. Cztery do pięciu dni po inokulacji, aby zmierzyć guzy, zbadaj palpagt miejsce guza i użyj suwmiarki, aby użyć zarówno największej, jak i najmniejszej średnicy guza w celu określenia objętości guza.

Aby zobrazować wstrzyknięte komórki 41GFP, umieść znieczuloną mysz na ruchomym stoliku wewnątrz imagera i zobrazuj miejsce guza za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem powietrza laminer, sześć dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, należy wirować liposomy, aby równomiernie rozprowadzić cząstki, i zassać 60 mikrolitrów zawiesiny do sterylnej końcówki pipety. Umieść końcówkę w pobliżu nozdrza znieczulonego zwierzęcia zaszczepionego nowotworem i powoli wypuść pięć mikrolitrów roztworu liposomowego, umożliwiając myszy wdychanie kropli.

Bardzo ważne jest, aby podawać roztwór liposomu powoli, utrzymując odpowiedni poziom znieczulenia, aby zwierzę mogło regularnie oddychać podczas porodu. Po podaniu całych 60 mikrolitrów pozwól myszy w pełni wyzdrowieć i wróć do klatki. Aby policzyć i ocenić przerzuty na powierzchni płuc, umieść płuca pod mikroskopem preparacyjnym i ustaw ostrość obiektywu, aż uzyskasz wyraźny widok powierzchni płuc.

Następnie ręcznie policz metastesy po przedniej i tylnej stronie obu płuc i zobrazuj guzy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Po policzeniu i zobrazowaniu przerzutów użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby zmielić płuco i przenieść kawałki tkanki do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej trzy mililitry buforu do wytrawiania. Przetrzyj fragmenty na obracającej się wytrząsarce w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, a następnie poddaj tratowanie zawiesiny, aby zdysocjować tkankę.

Następnie przefiltruj zawiesinę tkankową przez sitko o średnicy 40 mikronów, aby usunąć wszelkie grudki, w razie potrzeby przeciskając większe kawałki przez sitko za pomocą tłoka strzykawki. Po uzyskaniu zawiesiny jednokomórkowej należy zebrać komórki przez odwirowanie i poddać je lizie krwinek czerwonych za pomocą buforu ACK przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj granulkę dwa razy w ośmiu mililitrach RPMI.

Po drugim odwirowaniu zawieszamy komórki w trzech mililitrach kompletnego podłoża RPMI w celu zliczenia i ponownie odwirowujemy komórki. Teraz rozcieńczyć komórki do 10 do 6 komórek na 100 mikrolitrów stężenia buforu FAX i przenieść 100 mikrolitrów elocytów komórek do indywidualnych studzienek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Zbierz komórki na dnie studzienek przez odwirowanie, a następnie odwróć płytkę, aby bufor mógł spłynąć.

Zablokuj komórki 100 mikrolitrami bloku CD16 CD32 FC na 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie odwiruj płytkę. Następnie odwróć płytkę, aby usunąć supernatant, jak właśnie pokazano, i dodaj interesujący koktajl przeciwciał do odpowiednich studzienek. Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza rozpuść komórki przez odwirowanie, a następnie przepłucz 200 mikrolitrami buforu do faksu.

Następnie ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach świeżego PBS i zabarwić próbki barwnikiem żywotności przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyj komórki w kolejnych 200 mikrolitrach PBS i utrwal próbki w 100 mikrolitrach jednego procenta paraformaldehydu do przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Bezpośrednio przed ich analizą należy przenieść zawiesiny komórek do probówek do cytometrii przepływowej z polipropylenu.

Wstrzyknięcie komórek nowotworowych 4T1GFP do poduszeczki tłuszczowej sutka prowadzi do powstania guzów myszy, które przypominają przerzutowe rozprzestrzenianie się ludzkiego raka piersi, o czym świadczą szybko tworzące się przerzuty obserwowane w płucach. Stabilna transfekcja komórek 4T1 za pomocą GFP ułatwia śledzenie przerzutów komórek nowotworowych i ilościowe określenie obciążenia przerzutami. Rutynowa hastologia, w połączeniu z cyfrowymi algorytmami patomorfologicznymi, stanowi również dobre narzędzie do ilościowego określania i weryfikacji przerzutów.

Co więcej, wielobarwna analiza cyklometryczna przepływowa pozwala na scharakteryzowanie nawet rzadkich populacji komórek, takich jak makrofagi pęcherzykowe CD11b ujemne, CD11c F80 dodatnie. Zubożenie biklotrenianu można potwierdzić przez brak tych komórek CD11c F480 dodatnich w zdysocjowanych płucach zwierząt leczonych liposomem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzykiwać komórki nowotworowe do poduszeczki tłuszczowej sutka, monitorować wzrost guza i przerzuty oraz zubożać makrofagi pęcherzykowe i przygotowywać komórki płuc do analizy cyklometrii przepływowej.