Wykorzystanie reakcji wywołanej dotykiem i testów lokomocji do oceny wydajności i funkcji mięśni u danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest ocena wydajności i funkcji mięśni danio pręgowanego za pomocą reakcji wywołanej dotykiem i testów pływania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu badań nerwowo-mięśniowych, takie jak identyfikacja upośledzonej wydajności mięśni lub wad neurodegeneracyjnych w modelach chorych danio pręgowanego. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę oceny wydajności mięśni w modelach chorych danio pręgowanego.

Aby wykonać test, umieść szalkę Petriego wypełnioną około 25 mililitrami pożywki dla zarodków na oświetlonym stoliku o kontrolowanej temperaturze ustawionej na około 28 stopni Celsjusza. Zamontuj szybką kamerę nad anteną. Uruchom oprogramowanie do nagrywania wideo i ustaw prędkość przechwytywania na 1,000 klatek na sekundę, aby zapewnić uchwycenie dużych prędkości pływania.

Umieść zarodek na środku szalki Petriego, tak aby był wyraźnie widoczny w polu widzenia. Naciśnij przycisk nagrywania, a następnie podaj bodziec mechanosensoryczny, delikatnie dotykając zarodka igłą na czubku głowy. Zatrzymaj nagrywanie, gdy zarodek wypłynie poza pole widzenia lub powróci do spoczynku.

Powtórz badanie tych samych larw głównie w celu przyzwyczajenia lub osłabienia mięśni w niektórych chorych modelach, co skutkuje zmniejszoną reakcją na bodziec dotykowy, dlatego każdy zarodek powinien być badany tylko raz. Aby określić ilościowo zachowanie podczas pływania, uruchom oprogramowanie i wybierz lokomocję pojedynczych larw za pomocą naszego modułu odejmowania tła, aby otworzyć plik wideo AVI. Wybierz narzędzie odręczne lub wielokątne z paska menu i wybierz region filmu, który obejmuje zarówno oryginalną pozycję ryby, jak i obszar, do którego płynie, z wyłączeniem sondy używanej do dostarczania bodźca mechanosensorycznego.

Kliknij Eksperymentuj na pasku menu i wybierz Wykonaj. Po wyświetleniu monitu zapisz plik analizy danych pierwotnych w formacie PHR w żądanej lokalizacji. Następnie kliknij przycisk Start, aby rozpocząć analizę.

Gdy ryba wypłynie poza pole widzenia lub klip wideo się zakończy, zakończ analizę, klikając Stop pod menu eksperymentu, a pojawi się okno wyświetlające wyniki. Przewiń w prawo od okna, aby uzyskać maksymalną wartość przyspieszenia. Wyeksportuj dane, klikając przycisk Eksportuj natychmiastowe wyniki w menu rozwijanym Wyniki.

Wybierz odpowiedni plik Raw Data Analysis i kliknij, aby otworzyć. Spowoduje to zapisanie pliku tekstowego w folderze docelowym, który można otworzyć w programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Umieść badane larwy na 48-dołkowej płytce, po jednej na każdą studzienkę.

Następnie napełnij studnie wodą tuż poniżej górnej części studni, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Przechowuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez godzinę. Umieść płytkę w komorze rejestracyjnej wyposażonej w cyfrową kamerę na podczerwień, która może wykrywać larwy w ciemności.

Rytmy okołodobowe i zewnętrzne bodźce środowiskowe mogą znacząco wpływać na zachowanie pływania danio pręgowanego. Pora dnia i warunki oświetleniowe muszą być znormalizowane, a temperatura wody musi być ściśle regulowana. Uruchom oprogramowanie i wybierz moduł śledzenia.

W obszarze Plik kliknij opcję Generuj nowy protokół i edytuj liczbę studzienek użytych w eksperymencie, która w tym przykładzie wynosi 48. Następnie kliknij Parametry i wybierz Parametry protokołu, a następnie Czas, aby ustawić czas trwania eksperymentu i okres integracji na 10 minut. Również w obszarze Parametry protokołu kliknij przycisk Opcje i upewnij się, że pole wyboru numeroskop jest zaznaczone.

Aby ustawić obszary nagrywania, podświetl całą siatkę i kliknij dwukrotnie jedną ze studni. Kliknij przycisk Rysuj obszary i narysuj wokół lewego górnego, prawego górnego i lewego dolnego dołka, a następnie kliknij Buduj. Oprogramowanie określi następnie położenie każdego dołka.

W tym momencie narysuj również pasek skali i kliknij Zastosuj do grupy. Po zakończeniu kliknij przycisk Rysuj obszary. Następnie wybierz kolor ryby, który w tym przypadku jest i przesuń pasek progu wykrywania do poziomu, w którym podświetlone są tylko ruchy ryb bez tła.

Wprowadź Progi ruchu do wykrywania bezczynności i małych, powiększonych ruchów. W tym przykładzie użyto progu braku aktywności wynoszącego sześć milimetrów na sekundę i progu serii aktywności wynoszącego 30 milimetrów na sekundę. Kliknij menu Parametry, a następnie ustawienia Light Driving i ustaw natężenie światła w komorze na 0%Zamknij drzwi komory nagrywania i rozpocznij nagrywanie wideo.

Eksperyment zostanie zakończony w ciągu 10 minut, zgodnie ze wskazaniami timera na ekranie. Po zakończeniu kliknij menu rozwijane Eksperyment i wybierz opcję Zatrzymaj. Zostanie wyświetlone okno dialogowe z wynikami.

Aby sprawdzić wyniki za pomocą programu Excel, kliknij Otwórz folder zawierający i otwórz plik, który pojawia się w folderze wynikowym. Na koniec film można odtworzyć ponownie, aby sprawdzić, czy zarejestrowane wartości lokomocji dokładnie odwzorowują ruchy pływania ryb. Można to osiągnąć, porównując ruch zaobserwowany w pliku wideo z profilem lokomocji wygenerowanym przez oprogramowanie.

Migawkowe obrazy zarodka danio pręgowanego wykonane podczas testu wywołanego dotykiem pokazują typowy ruch osobnika w ciągu pierwszych 0,2 sekundy po zastosowaniu bodźca. Tutaj rysunek przedstawia profil przyspieszenia dla pierwszych 0,2 sekundy reakcji ucieczki podczas pływania w trybie eksplozywnym u osób dzikich w porównaniu z osobnikami miopatycznymi. Zaobserwowano, że przyspieszenie osiąga szczyt w obu szczepach w tym oknie czasowym, a szczytowe maksymalne przyspieszenie jest proporcjonalne do zdolności generowania siły przez mięśnie szkieletowe.

Maksymalne wartości przyspieszenia uśredniono dla szczepów typu dzikiego i miopatycznego. Ryby miopatyczne wykazały znaczny spadek maksymalnego przyspieszenia, co wskazuje na zmniejszoną funkcję mięśni. 10-minutowe testy lokomocji zarodków zarejestrowały wzorce i typy ruchów zarówno zarodków dzikich, jak i miopatycznych oraz wygenerowały schematyczne reprezentacje ruchów pływania.

Zmapowano okresy wolnego ruchu reprezentowanego przez zielone linie i szybkiego ruchu reprezentowanego przez czerwone linie, a także okresy bezczynności reprezentowane przez czarne linie. Osobniki typu dzikiego wykazywały wysoki poziom aktywności przy stosunkowo zerowych okresach nieaktywności, w przeciwieństwie do osobników miopatycznych, które były mniej aktywne w okresie testowym. Znalazło to odzwierciedlenie w istotnych różnicach w średniej liczbie ruchów i odległości przebytej przez rybę dziką w porównaniu z rybą miopatyczną .

Po opanowaniu, test reakcji wywołanej dotykiem można przeprowadzić w ciągu 15 minut dla 15 ryb, a testy lokomocji można wykonać w około 10 minut dla maksymalnie 48 ryb. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ostrożnie obchodzić się z zarodkami, ponieważ może to wpłynąć na ich aktywność. Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak znakowanie immunologiczne lub mikroskopia elektronowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z patologią mięśni.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć wydajność mięśni we wczesnym rozwoju danio pręgowanego.