Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób hodować i rejestrować aktywność elektrofizjologiczną neuronów słuchowych na matrycach wieloelektrodowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad słuchem, takie jak charakterystyka właściwości elektrofizjologicznych neuronów słuchowych i stymulacja przez obszary elektrod. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na zewnątrzkomórkowe, nieinwazyjne, jednoczesne rejestrowanie aktywności neuronalnej dużej liczby neuronów słuchowych.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii. W rzeczywistości można je wykorzystać do wdrożenia interfejsu elektroneuronowego protez, takich jak implant ślimakowy, w celu przywrócenia słuchu u pacjentów niesłyszących. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować roztwór powlekający ECM, najpierw rozmrażając mieszankę ECM na lodzie.

Następnie rozcieńczyć mieszaninę ECM w podstawowej pożywce hodowlanej w stosunku 1 do 10 i przechowywać ją na lodzie. W przypadku nowych MEA w okapie z przepływem laminarnym zanurz je w 70% etanolu na 30 sekund. Następnie myj je wodą destylowaną przez 30 sekund.

Następnie pozostaw MEA do wyschnięcia na 30 minut. Aby pokryć MEA, należy odpipetować 50 mikrolitrów roztworu powlekającego na MEA za pomocą zimnej końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie pozostaw MEA na 30 minut do jednej godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń roztwór powlekający. Dodaj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej 10% FBS i pięcioma nanogramami na mililitr BDNF i pozostaw w temperaturze pokojowej do momentu posiewu tkanki. Następnie umieść szalkę Petriego zawierającą powlekane MEA na dużej szalce Petriego i dodaj małą szalkę Petriego zawierającą PBS do nawilżania.

W tej procedurze wysterylizuj głowę szczeniaka 70% etanolem. Następnie przetnij połączenie między skórą a czaszką wzdłuż linii strzałkowej. Następnie przetnij czaszkę strzałkowo i usuń mózg.

Następnie odetnij kości skroniowe z czaszki i umieść je na szalce Petriego zawierającej sterylny, lodowaty HBSS. Pod mikroskopem preparacyjnym wypreparuj pęcherz bębenkowy za pomocą cienkich kleszczy i odizoluj ucho wewnętrzne. Następnie usuń kość ślimaka.

Następnie usuń więzadło spiralne i SV razem, przytrzymując podstawową część zwoju spiralnego i SV kleszczami i powoli rozwijając SV od podstawy do wierzchołka. Oddziel narząd Cortiego od spiralnego zwoju w modiolus, przytrzymując podstawową część spiralnego zwoju i narząd Cortiego kleszczami i powoli rozwijając narząd Cortiego od podstawy do wierzchołka. Następnie odetnij boczne eksplantaty ze spiralnego zwoju za pomocą kleszczy lub drobnych nożyczek lub noży do mikropreparacji.

Teraz przenieś eksplantaty spiralnego zwoju i narząd Cortiego na MEA. Następnie umieść eksplantaty SG w obszarze elektrody i narządzie Cortiego w odległości około pięciu milimetrów od obszaru elektrody. Umieść eksplantaty i narząd Cortiego na MEA, unikając uszkodzenia tkanki.

Następnie ostrożnie umieść MEA w inkubatorze i kulturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Następnego dnia sprawdź wzrokowo eksplantaty pod kątem ich przyłączenia do MEA. Następnie dodawaj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i BDNF codziennie przez pięć kolejnych dni.

Szóstego dnia dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i pięć nanogramów na mililitr BDNF i hoduj tkankę przez dodatkowe 13 dni. Po zbiorczym 18 dniach hodowli przemyj kulturę MEA przygotowanym wcześniej roztworem zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej. Następnie osusz styki chipa MEA kawałkiem chusteczki i zamontuj MEA na uchwycie MEA.

Na koniec zainstaluj MEA w konfiguracji nagrywania. Następnie dodaj 300 mikrolitrów roztworu zewnątrzkomórkowego i odczekaj 10 minut, aby system się ustabilizował przed nagraniem. Teraz rejestruj spontaniczną aktywność przez dwie minuty ze wszystkich elektrod i zidentyfikuj aktywne elektrody.

Następnie zidentyfikuj elektrody reagujące na stymulację. Aby wykluczyć artefakt stymulacji, stymuluj z tej samej elektrody 10 razy. Jeśli kultura zareaguje co najmniej osiem na 10 razy, można założyć, że jest to pozytywna odpowiedź na stymulację wywołaną elektrodą.

Aby zidentyfikować szum tła, należy zastosować TTX do hodowli o stężeniu jednego mikromola, aby zablokować kanały sodowe bramkowane napięciem, a następnie nagrywać przez dwie minuty. Poniżej znajdują się ślady oryginalnych zapisów sześciu z 63 elektrod, które wykazują spontaniczną aktywność i jest to wykres rastrowy sześciu elektrod po wykryciu kolca. Każdy słupek reprezentuje jeden potencjał czynnościowy.

Ten wykres rastrowy zawiera wszystkie elektrody aktywne. Czynności są rejestrowane z 63 elektrod przez dwie minuty. Rysunek ten ilustruje, że do stymulacji hodowli z jednej elektrody użyto bodźca dwufazowego o łącznym czasie trwania 80 mikrosekund i amplitudzie 80 mikroamperów.

Ten reprezentatywny przykład śladów surowych danych pokazuje potencjały czynnościowe, wszystkie bez odpowiedzi po stymulacji. A oto hodowla spiralnych zwojów na MEA wybarwiona immunologicznie dla markera neuronalnego, TUJ, na końcu eksperymentu, aby zobrazować pokrycie neuronalne obszaru elektrody. Elektroda używana do stymulacji jest oznaczona kolorem zielonym, a elektrody reagujące są oznaczone kolorem czerwonym.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 50 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Chociaż metody te mogą zapewnić wgląd w elektrofizjologię neuronów spiralnych, można je również zastosować do innych systemów, takich jak hodowle mózgu lub rdzenia kręgowego. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom w dziedzinie materiałoznawstwa i nanotechnologii, szybkiej modyfikacji powierzchni elektrod do rejestracji i stymulacji neuronów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować i rejestrować aktywność elektrofizjologiczną, umieszczając eksplantat neuronów na układach wieloelektrodowych.