Produkcja i dostarczanie leków Zastosowania nanocząstek jedwabiu

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie nanocząstek jedwabiu z odwróconego wodnego roztworu jedwabiu, a następnie wykorzystanie tych nanocząstek jedwabiu do zastosowań związanych z dostarczaniem leków. W tej metodzie wykorzystano nano-wytrącanie do wygenerowania cząstek na bazie jedwabiu, które można wykorzystać do szerokiego zakresu zastosowań, takich jak dostarczanie leków. Główną zaletą tej techniki jest prostota i powtarzalność w celu uzyskania jednolitych nanocząstek jedwabiu, które są stabilne i mają wąski rozkład boczny.

Aby rozpocząć tę procedurę, zagotuj dwa litry wody destylowanej. Następnie ostrożnie dodaj 4,24 grama węglanu sodu. Następnie za pomocą nożyczek pokrój pięć gramów suszonych kokonów na kawałki o wymiarach pięć milimetrów na pięć milimetrów.

Dodaj kawałki kokonu do roztworu węglanu sodu i gotuj przez 60 minut, aby usunąć gumę z włókien jedwabiu, od czasu do czasu mieszając. Po zakończeniu gotowania usuń odgumowany jedwab. Myć jednym litrem wody destylowanej przez 20 minut, trzy razy.

Następnie ściśnij wyprany jedwab, aby usunąć nadmiar płynu, rozwiąż jedwab ręcznie i umieść go w dygestorium do wyschnięcia na noc na powietrzu. Po zakończeniu suszenia szczelnie zapakuj pięć gramów suszonych na powietrzu włókien jedwabiu na dno 50-mililitrowej zlewki. Następnie przygotuj świeży 9,3-molowy roztwór bromku litu.

Rozpuść jedwab w bromku litu, dodając cztery mililitry bromku litu na gram jedwabiu. Przykryj zlewkę folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu. Pozostaw jedwab do rozpuszczenia na cztery godziny w temperaturze 60 stopni Celsjusza, od czasu do czasu mieszając.

Po całkowitym rozpuszczeniu zwilż kasetę dializacyjną w wodzie na pięć minut. Następnie przenieś 15 mililitrów roztworu bromku jedwabiu i litu do kasety dializatora. Użyj igły i strzykawki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Dializować w jednym litrze wody destylowanej. Zmień wodę po jednej, trzech i sześciu godzinach. Następnego ranka i wieczoru należy zalać zlewkę nową wodą, a po raz ostatni rankiem trzeciego dnia.

Po zakończeniu dializy pobrać roztwór jedwabiu z kasety i odwirować pod ciśnieniem 9 500 g przez 20 minut w temperaturze pięciu stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant i powtórzyć wirowanie jeszcze dwukrotnie. Następnie wyjąć, wysuszyć i określić całkowitą suchą masę i stężenie roztworu jedwabiu, jak opisano w protokole tekstowym.

Następnie dodaj kroplami do acetonu roztwór jedwabiu o stężeniu 5% wagowym na objętość, utrzymując stężenie acetonu objętościowo powyżej 75. Całkowicie napełnij probówki, aby upewnić się, że nie zapadną się podczas wirowania. Odwirować osad pod ciśnieniem 48 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń granulkę szpatułką i dodaj 20 mililitrów wody destylowanej. Użyj końcówek pipet, aby usunąć granulkę ze szpatułki i wirować ją przez 20 sekund. Następnie poddaj sonikację osadu za pomocą sondy ultradźwiękowej o amplitudzie 30% przez 30 sekund, dwa razy.

Po zakończeniu sonikacji należy uzupełnić probówkę wirówkową do pojemności wodą destylowaną. Powtórzyć wirowanie i ponowne zawieszenie jeszcze co najmniej dwa razy. Następnie przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości.

Rozpocząć od przygotowania roztworu doksorubicyny zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wymieszaj dwa mililitry roztworu doksorubicyny o stężeniu 0,2 mikromola na mililitr z 200 mikrolitrami nanocząstek jedwabiu w stężeniu 10, 30 lub 50 miligramów na mililitr w dwumililitrowej probówce. Zawiesinę jedwab-doksorubicyna inkubować w temperaturze pokojowej przez noc na mieszalniku obrotowym.

Po zakończeniu ładowania lekiem odwirować zawiesinę pod ciśnieniem 194 000 g przez 30 minut. Umyj nanocząstki jedwabiu obciążone doksorubicyną wodą destylowaną i powtórz wirowanie dwukrotnie. Następnie wyciągnij supernatant i zanotuj całkowitą objętość.

Odpipetować 200 mikrolitrów supernatantu do czarnej płytki do mikromiareczkowania. Za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych ustaw długość fali wzbudzenia na 485 nanometrów, a długość fali emisji na 590 nanometrów i zapisz wartości fluorescencji. Po wyhodowaniu i wysianiu komórek MDA-MB-231 dodaj swobodnie dyfuzyjną doksorubicynę, nanocząstki jedwabiu i nanocząstki jedwabiu załadowane doksorubicyną do odpowiedniej 96-dołkowej płytki.

Następnie dodaj MTT po 72 godzinach, aby określić żywotność komórek i połowę maksymalnego stężenia hamującego. Inkubować przez pięć godzin. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie opróżnij studzienki pipetą.

Dodać 100 mikrolitrów dimetylosulfotlenku, aby rozpuścić formazan. Za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji zmierz absorbancję przy 560 nanometrach. Zbierz te dane do trzech niezależnych eksperymentów.

W tej procedurze nanocząstki jedwabiu są wytwarzane z kokonów Bombyx mori. Doksorubicyna jest stosowana jako klinicznie istotny modelowy lek chemataputyczny do badań obciążenia lekiem i cytotoksyczności in vitro. Reprezentatywne wyniki skuteczności kapsułkowania doksorubicyny dla 2, 6 i 10 miligramów nanocząstek jedwabiu można zobaczyć tutaj.

Zdolność nanocząstek jedwabiu załadowanych lekiem do dostarczania doksorubicyny, a następnie zabijania komórek rakowych, ocenia się in vitro z ludzkimi komórkami MDA-MB-231 raka piersi. Przy równoważnych dawkach leku wynoszących 0,1 mikrograma, swobodnie dyfuzyjna doksorubicyna i cząsteczki jedwabiu obciążone doksorubicyną powodują znaczne zmniejszenie żywotności komórek. Swobodnie dyfuzyjna doksorubicyna wykazuje większą cytotoksyczność niż naładowane nanocząstki jedwabiu ze względu na różnice w wychwytywaniu komórek.

Pomiary ilościowe są potwierdzone jakościowym obrazowaniem skaningowo-mikroskopowym i elektronowym. Kultury kontrolne wykazują większą gęstość komórkową i dominujący fenotyp mezenchymalny. Podobne wyniki zaobserwowano w kulturach wystawionych na działanie nanocząstek jedwabiu.

Kultury wystawione na działanie doksorubicyny wykazują wyraźnie odmienny fenotyp, z szeroką i rozproszoną morfologią. Narażenie na swobodnie dyfuzyjną doksorubicynę lub nanocząstki jedwabiu obciążone doksorubicyną powoduje znaczne zmniejszenie liczby komórek. Tak więc jeden mistrz dostarcza rozwiązanie z jedwabiu, które może zostać dostarczone w ciągu trzech dni.

A nanocząsteczkę jedwabiu można wyprodukować w ciągu jednego dnia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu wirówki odpornej na aceton, aby zapewnić nanoprecypitację i obróbkę próbki. Ponadto upewnij się, że rurka wirówkowa jest całkowicie napełniona, aby nie zapadła się podczas wirowania.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyprodukować roztwór jedwabiu poddany inżynierii wstecznej i wykorzystać go do wygenerowania jednolitej nanocząstki jedwabiu o wąskim rozkładzie boków.