Name: Rejestrowanie oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj metodę rejestracji oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego (PPN) przy użyciu patch clamp. Technika ta pozwala badać właściwości wewnętrzne błony komórkowej i mechanizmy utrzymania częstotliwości pobudzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez główne obiekty Center for Translational Neuroscience, wspierane przez NIH, przyznając GM103425 P20 i P30 GM110702 dr Garcia-Rill. Prace te były również wspierane przez granty z FONCYT-Agencia Nacional de Promociòn Cientìfica y Tecnològica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 i UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (do dr Urbano).

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Arkansas dla Nauk Medycznych (numer protokołu #3593) i były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego A
	<ol>
		<li>Dodać 700 ml wody destylowanej do czystej zlewki o pojemności 1 l przed dodaniem chemikaliów.</li>
		<li>Ciągle mieszając objętość 500 ml, dodać 136,75 g NaCl, 6,99 g KCl, 2,89 gMgSO4 i 2,83 g NaH2PO4.</li>
		<li>Dodaj więcej wody destylowanej, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 117 mM NaCl, 4,69 mM KCl, 1,2 mMMgSO4 i 1,18 mM NaH2PO4.</li>
		<li>Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego B
	<ol>
		<li>Dodaj 700 ml wody destylowanej do czystej zlewki o pojemności 1 l przed dodaniem chemikaliów.</li>
		<li>Ciągle mieszając objętość 500 ml, dodać 41,45 g D-glukozy i 41,84 g NaHCO3.</li>
		<li>Dodaj więcej wody destylowanej, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 11,5 mM D-glukozy i 24,9 mMNaHCO3.</li>
		<li>Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.</li>
		<li>Przed każdym doświadczeniem zmieszać 50 ml bulionu A z 50 ml bulionu B i doprowadzić do 1 l wodą destylowaną w celu uzyskania końcowego stężenia roztworu CSF i pozostawić w temperaturze pokojowej, ciągle natleniając go karbogenem (95%O2 - 5% mieszaniny CO2 ) przez co najmniej 30 minut. Przygotować końcowe stężenie aCSF tylko na początku każdego doświadczenia i wyrzucić na koniec dnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego z sacharozą (Sacharoza-aCSF)
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego C
	<ol>
		<li>Dodać 700 ml wody destylowanej do czystej zlewki o pojemności 1 l przed dodaniem chemikaliów.</li>
		<li>Ciągle mieszając 500 ml wody destylowanej, dodać 240 g sacharozy, 6,55 g NaHCO3, 0,671 g KCl, 4,88 g MgCl2, 0,22 g CaCl2 i 0,21 g kwasu askorbinowego.</li>
		<li>Dodaj więcej wody destylowanej, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 701,1 mM sacharozy, 78 mM NaHCO3, 9 mM KCl, 24 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2 i 1,2 mM kwasu askorbinowego.</li>
		<li>Roztwór podstawowy C przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
		<li>Przed każdym doświadczeniem zmieszać 300 ml 50 ml bulionu C z 600 ml wody destylowanej w celu otrzymania roztworu sacharozy-aCSF o końcowym stężeniu i pozostawić w temperaturze pokojowej, ciągle natłaczając go karbogenem (mieszanina 95%O2 - 5%CO2) przez co najmniej 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie plastra
<ol>
	<li>Umieścić czystą zlewkę ze 100 ml roztworu sacharozy-aCSF w lodzie, natleniając go karbogenem i ustalić pH na 7,4 za pomocą pH-metru, dodając kilka kropli 0,1 M roztworu NaOH (gdy pH < 7,4) lub 0,1 M roztworu HCl (gdy pH > 7,4).</li>
	<li>Napełnij komorę tnącą wibratomu sacharozą-aCSF i natlenić ją. Włączyć układ chłodniczy na bazie glicerolu sprzężony z komorą tnącą i odczekać 15 minut, aby ostygł do 0 - 4 °C.</li>
	<li>Znieczulenie szczeniąt szczurów (w wieku od 9 do 12 lat od dorosłych szczurów Sprague-Dawley w ciąży w czasie) ketaminą (70 mg/kg, i.p.; przy użyciu < 50 μl końcowej objętości). Kiedy szczeniak jest spokojny, sprawdź dokładnie, czy nie ma odruchu szczypania ogona.</li>
	<li>Ścięte szczenięta.
	<ol>
		<li>Przetnij skórę głowy wzdłużnie od przodu do tyłu za pomocą ostrza skalpela ze stali węglowej i pociągnij skórę na boki za pomocą kleszczy. Przetnij kość pokrywającą mózg, przesuwając nożyczki na boki i całkowicie ją usuń, aby odsłonić mózg.</li>
		<li>Następnie szybko usuń mózg za pomocą szpatułki (początkowo umieszczonej pod opuszką węchową, aby delikatnie wypchnąć mózg z najbardziej rostralnych w kierunku najbardziej ogonowych). Delikatnie wepchnij mózg do chłodzonego lodem, natlenionego sacharozy i sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (sacharoza-aCSF).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj cięcie przystrzałkowe na prawej półkuli (usuwając około jednej trzeciej półkuli) i przyklej przyciętą stronę mózgu do metalowego dysku, który zostanie magnetycznie przymocowany do komory tnącej wibrokrajalnicy, aby wyciąć strzałkowe odcinki 400 μm zawierające jądro szypułkowe (PPN). Trzymaj plastry PPN w temperaturze RT przez 45 minut przed nagraniami patch-clamp dla całych komórek.</li>
</ol>
4. Nagrania Oscylacje pasma gamma w warstwach PPN
<ol>
	<li>Przygotowanie wewnątrzkomórkowego roztworu glukonianu potasu (roztwór o wysokiej zawartości K+)
	<ol>
		<li>Umieścić w lodzie czystą zlewkę z 10 ml wody destylowanej. Ciągle mieszając dodaj: K+-glukonian, 90,68 mg fosfokreatyny di Tris soli, 47,66 mg HEPES, 1,5 mg EGTA, 40,58 mg Mg2+-ATP i 4 mg Na+2-GTP.</li>
		<li>Dostosuj pH do 7,3 za pomocą KOH (100 mM w wodzie destylowanej). Dodaj wodę destylowaną, aby osiągnąć końcową objętość 20 ml. W razie potrzeby dostosuj osmolarność sacharozą (100 mM w wodzie destylowanej) do 280 - 290 mOsm. Po rozcieńczeniu końcowe stężenie każdego związku wynosi 124 mM K+-glukonianu, 10 mM fosfokreatyny di Tris soli, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 4 mM Mg2+-ATP i 0,3 mM Na+2-GTP.</li>
		<li>Podwielokrotne roztwory wewnątrzkomórkowe rozmieścić w probówkach o pojemności 1 ml i zamrozić w temperaturze -20 °C. Stosować jedną porcję na dobę i przechowywać w temperaturze 4 °C podczas eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nagrania z zaciskiem krosowym całej komórki
	<ol>
		<li>Plastry umieścić w komorze zanurzeniowej i perfaktorować (1,5 ml/min) utlenowanym (95%O2 - 5% CO2) aCSF zawierającym następujących antagonistów receptora: selektywnego antagonistę receptora NMDA kwas 2-amino-5-fosfonowalerianowy (APV, 40 μM), kompetycyjny antagonista receptora glutaminianu AMPA/Kainate 6-cyjano-7-nitrochinoksalino-2,3-dionu (CNQX, 10μM), antagonistę receptora glicyny strychninę (STR, 10 μM), swoisty antagonista receptora GABAA gabazyna (GBZ, 10 μM) i tetrodotoksyna blokująca kanał sodowy (TTX, 3μM) 
		UWAGA: W wynikach i rycinach ci antagoniści są zbiorczo określani jako blokery synaptyczne lub SB.</li>
		<li>Napełnij pipety krosowe rejestrujące (rezystancja 2-7 MΩ; wykonane ze zwykłych, dostępnych w handlu grubościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,0 mm i średnicy wewnętrznej 0,6 mm) wewnątrzkomórkowym roztworem o wysokiej zawartości K+, używając dostępnych w handlu wypełniaczy do pipet krosowych z filtrem roztworu. Włóż pipetę do uchwytu wzmacniacza. Zastosować niewielkie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml połączonej z uchwytem na pipety za pomocą silikonowej rurki podłączonej do zaworu trójdrogowego. Podłącz tylną część uchwytu pipety do patch clamp amplifier.</li>
		<li>Przesunąć pipetę rejestrującą za pomocą mikromanipulatora mechanicznego w pobliże jądra PPN za pomocą obiektywu 4X w połączeniu z interferencyjną optyką kontrastową w bliskiej podczerwieni. 
		UWAGA: Jądro PPN można zaobserwować w warstwach grzbietowych do górnej szypułki móżdżku (SCP; obserwowalny jako gruba wiązka aksonów). Pipety rejestrujące znajdowały się w PPN pars compacta, który znajduje się bezpośrednio grzbietowo do tylnego końca szypułki.</li>
		<li>Doprowadź pipetę rejestrującą do kontaktu z neuronem PPN podczas wizualizacji za pomocą 40-krotnej soczewki zanurzonej w wodzie i szybko zastosuj ujemne ssanie, aby utworzyć uszczelnienie z komórką.</li>
		<li>Użyj oprogramowania do uszczelniania zacisków napięciowych, aby monitorować rezystancję pipety podczas ujemnego ssania zgodnie z protokołem producenta.
		<ol>
			<li>Gdy ujemne ssanie jest powoli zwiększane, a wartości rezystancji odczytywane przez monitor zacisku krosowego na końcówce pipety osiągną 80 - 100 MOhm, należy szybko zmienić potencjał utrzymywania na -50 mV i zwolnić podciśnienie. Zacznij w sposób ciągły stosować ujemne ssanie, aż do pęknięcia błony neuronu i uzyskania dostępu elektrycznego w konfiguracji całej komórki.</li>
			<li>Jeśli wartości rezystancji dostępu zmierzone przez oprogramowanie do uszczelek zaciskowych wynoszą 10 MOhm lub więcej, kontynuuj stosowanie ujemnego ssania w mniejszych ilościach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Kompensacja pojemności (tj. wolnych i szybkich stanów przejściowych obserwowanych po pęknięciu membrany ogniwa) i rezystancji szeregowej w trybie cęgów napięciowych. Przełącz tryb nagrywania na cęgi prądowe i szybko skompensuj wartości mostka (np. przesuń pokrętło wzmacniacza lub kliknij menu automatycznej kompensacji za pomocą myszy komputera).
		<ol>
			<li>Stale monitoruj spoczynkowy potencjał błonowy neuronu PPN rejestrowany przy użyciu protokołu producenta. Jeśli spoczynkowy potencjał błony przesuwa się w kierunku wartości depolaryzacyjnych lub hiperpolaryzacyjnych, należy użyć niewielkich ilości prądu stałego (do 100 pA), aby utrzymać optymalną wartość końcową -50 mV. 
			UWAGA: Utrzymuj tylko neurony PPN o stabilnym spoczynkowym potencjale błonowym (RMP) -48 mV lub więcej hiperpolaryzacji (tj. RMP < -48 mV).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Profice, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophysiological+evaluation+of+the+pedunculopontine+nucleus+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Neurophysiological evaluation of the pedunculopontine nucleus in humans.</a> J. Neural. Transm (Vienna). 118 (10), 1423-1429 (2011).</li>
<li>Steriade, M., Datta, S., Pare, D., Oakson, G., Curro Dossi, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activities+in+brain-stem+cholinergic+nuclei+related+to+tonic+activation+processes+in+thalamocortical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2541-2559 (1990).</li>
<li>Steriade, M., Dossi, R. C., Pare, D., Oakson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+oscillations+%2820-40+Hz%29+in+thalamocortical+systems+and+their+potentiation+by+mesopontine+cholinergic+nuclei+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fast oscillations (20-40 Hz) in thalamocortical systems and their potentiation by mesopontine cholinergic nuclei in the cat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (10), 4396-4400 (1991).</li>
<li>Deurveilher, S., Hennevin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lesions+of+the+pedunculopontine+tegmental+nucleus+reduce+paradoxical+sleep+%28PS%29+propensity%3A+evidence+from+a+short-term+PS+deprivation+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lesions of the pedunculopontine tegmental nucleus reduce paradoxical sleep (PS) propensity: evidence from a short-term PS deprivation study in rats.</a> Eur. J. Neurosci. 13 (10), 1963-1976 (2001).</li>
<li>Steriade, M., Pare, D., Datta, S., Oakson, G., Curro Dossi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+cellular+types+in+mesopontine+cholinergic+nuclei+related+to+ponto-geniculo-occipital+waves%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Different cellular types in mesopontine cholinergic nuclei related to ponto-geniculo-occipital waves.</a> J. Neurosci. 10 (8), 2560-2579 (1990).</li>
<li>Steckler, T., Inglis, W., Winn, P., Sahgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pedunculopontine+tegmental+nucleus%3A+a+role+in+cognitive+processes%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">The pedunculopontine tegmental nucleus: a role in cognitive processes?</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 19 (3), 298-318 (1994).</li>
<li>Garcia-Rill, E., Simon, C., Smith, K., Kezunovic, N., Hyde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pedunculopontine+tegmental+nucleus%3A+from+basic+neuroscience+to+neurosurgical+applications%3A+arousal+from+slices+to+humans%3A+implications+for+DBS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm%22%5BJournal%5D)">The pedunculopontine tegmental nucleus: from basic neuroscience to neurosurgical applications: arousal from slices to humans: implications for DBS.</a> J. Neural. Transm. 118 (10), 1397-1407 (2011).</li>
<li>Mazzone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+human+pedunculopontine+nucleus%3A+a+safe+and+clinically+relevant+target+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Implantation of human pedunculopontine nucleus: a safe and clinically relevant target in Parkinson's disease.</a> Neuroreport. 16 (17), 1877-1881 (2005).</li>
<li>Simon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+band+unit+activity+and+population+responses+in+the+pedunculopontine+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Gamma band unit activity and population responses in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Neurophysiol. 104 (1), 463-474 (2010).</li>
<li>Kezunovic, N., Urbano, F. J., Simon, C., Hyde, J., Smith, K., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+behind+gamma+band+activity+in+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism behind gamma band activity in pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Eur. J. Neurosci. 34 (3), 404-415 (2011).</li>
<li>Hyde, J. R., Kezunovic, N., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+properties+of+high+speed+calcium+oscillations+in+the+pedunculopontine+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal properties of high speed calcium oscillations in the pedunculopontine nucleus.</a> J. Appl. Physiol (1985). 115 (9), 1402-1414 (2013).</li>
<li>Llinas, R. R., Leznik, E., Urbano, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+binding+via+cortical+coincidence+detection+of+specific+and+nonspecific+thalamocortical+inputs%3A+a+voltage-dependent+dye-imaging+study+in+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temporal binding via cortical coincidence detection of specific and nonspecific thalamocortical inputs: a voltage-dependent dye-imaging study in mouse brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (1), 449-454 (2002).</li>
<li>Boucetta, S., Cisse, Y., Mainville, L., Morales, M., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharge+profiles+across+the+sleep-waking+cycle+of+identified+cholinergic%2C+gabaergic%2C+and+glutamatergic+neurons+in+the+pontomesencephalic+tegmentum+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Discharge profiles across the sleep-waking cycle of identified cholinergic, gabaergic, and glutamatergic neurons in the pontomesencephalic tegmentum of the rat.</a> J. Neurosci. 34 (13), 4708-4727 (2014).</li>
<li>Datta, S., Siwek, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+patterns+of+pedunculopontine+tegmentum+neurons+across+the+sleep-wake+cycle+in+the+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell activity patterns of pedunculopontine tegmentum neurons across the sleep-wake cycle in the freely moving rats.</a> J. Neurosci. Res. 70 (4), 79-82 (2002).</li>
<li>Datta, S., Siwek, D. F., Stack, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cholinergic+and+non-cholinergic+neurons+in+the+pons+expressing+phosphorylated+cyclic+adenosine+monophosphate+response+element-binding+protein+as+a+function+of+rapid+eye+movement+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of cholinergic and non-cholinergic neurons in the pons expressing phosphorylated cyclic adenosine monophosphate response element-binding protein as a function of rapid eye movement sleep.</a> Neuroscience. 163 (1), 397-414 (2009).</li>
<li>Kayama, Y., Ohta, M., Jodo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+of+%27possibly%27+cholinergic+neurons+in+the+rat+laterodorsal+tegmental+nucleus+during+sleep+and+wakefulness%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Firing of 'possibly' cholinergic neurons in the rat laterodorsal tegmental nucleus during sleep and wakefulness.</a> Brain Res. 569 (2), 210-220 (1992).</li>
<li>Sakai, K., El Mansari, M., Jouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+by+carbachol+microinjections+of+presumptive+cholinergic+PGO-on+neurons+in+freely+moving+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition by carbachol microinjections of presumptive cholinergic PGO-on neurons in freely moving cats.</a> Brain Res. 527 (2), 213-223 (1990).</li>
<li>Lindsley, D. B., Bowden, J. W., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+upon+the+EEG+of+acute+injury+to+the+brainstem+activating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Electroenceph.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Effect upon the EEG of acute injury to the brainstem activating system.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 475-486 (1949).</li>
<li>Moruzzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sleep-waking+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ergeb.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The sleep-waking cycle.</a> Ergeb. Physiol. 64, 1-165 (1972).</li>
<li>Moruzzi, G., Magoun, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+stem+reticular+formation+and+activation+of+the+EEG%5BTitle%5D)+AND+%22Electroenceph.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Brain stem reticular formation and activation of the EEG.</a> Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1 (4), 455-473 (1949).</li>
<li>Steriade, M., Constantinescu, E., Apostol, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+alterations+of+the+cortical+transaminase+activity+and+EEG+patterns+of+sleep+and+wakefulness+induced+by+brainstem+transections%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Correlations between alterations of the cortical transaminase activity and EEG patterns of sleep and wakefulness induced by brainstem transections.</a> Brain Res. 13 (1), 177-180 (1969).</li>
<li>Ishibashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+receptor+activation+generates+gamma+band+input+to+cholinergic+and+serotonergic+arousal+system+neurons+and+drives+an+intrinsic+Ca2%2B+-dependent+resonance+in+LDT+and+PPT+cholinergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neurol%22%5BJournal%5D)">Orexin receptor activation generates gamma band input to cholinergic and serotonergic arousal system neurons and drives an intrinsic Ca2+ -dependent resonance in LDT and PPT cholinergic neurons.</a> Frontiers Neurol. 6, e120(2015).</li>
<li>Brown, R. E., Winston, S., Basheer, R., Thakkar, M. M., McCarley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+neurons+in+the+dorsolateral+pontine+REM+sleep+induction+zone+of+the+rat%3A+intrinsic+membrane+properties+and+responses+to+carbachol+and+orexins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of neurons in the dorsolateral pontine REM sleep induction zone of the rat: intrinsic membrane properties and responses to carbachol and orexins.</a> Neuroscience. 143 (3), 739-755 (2006).</li>
<li>Goetz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+the+pedunculopontine+nucleus+and+mesencephalic+reticular+formation+in+locomotion+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of the pedunculopontine nucleus and mesencephalic reticular formation in locomotion in non-human primates.</a> J. Neurosci. 36 (18), 4917-4929 (2016).</li>
<li>Fraix, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pedunculopontine+nucleus+area+oscillations+during+stance%2C+stepping+and+freezing+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pedunculopontine nucleus area oscillations during stance, stepping and freezing in Parkinson's disease.</a> PLOS ONE. 8 (12), e83919(2013).</li>
<li>Luster, B., Hyde, J., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Abstr+Soc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Abstr Soc Neurosci. 38, 257.20(2014).</li>
<li>Luster, B., D'Onofrio, S., Urbano, F. J., Garcia-Rill, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-threshold+Ca2%2B+channels+behind+gamma+band+activity+in+the+pedunculopontine+nucleus+%28PPN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-threshold Ca2+ channels behind gamma band activity in the pedunculopontine nucleus (PPN).</a> Physiol. Rep. 3 (6), e12431(2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Neurony PPN mają wewnętrzne właściwości, które pozwalają im wystrzeliwać potencjały czynnościowe o częstotliwościach pasma beta / gamma podczas nagrań in vivo od zwierząt, które nie śpią lub podczas snu REM, ale nie podczas snu wolnofalowego2,3,5,13-17. Inni autorzy wykazali, że transsekcje pnia mózgu na bardziej przednich poziomach niż PPN zmniejszyły częstotliwości gamma podczas zapisów EEG. Jednak, gdy uszkodzenia pnia mózgu znajdują się za miejscem, w którym znajduje się to jądro, bezpośrednia sty...

Jądro PPN jest anatomicznie włączone do ogonowej nakrywki śródmózgowia. PPN jest kluczowym elementem RAS1. PPN uczestniczy w utrzymaniu stanów aktywowanych behawioralnie (tj. czuwanie, sen REM)2. Stymulacja elektryczna PPN in vivo indukowała szybkie oscylacje (20 - 40 Hz) w korowym EEG3, podczas gdy obustronne zmiany PPN u szczura zmniejszały lub eliminowały sen REM4. Podczas gdy większość neuronów PPN wystrzeliwuje potencjały czynnościowe w paśmie beta/gamma (20 - 80 Hz), niektóre neurony wykazywały niskie wskaźniki spontanicznego odpalania (< 10 Hz) 5. Co więcej, PPN wydaje się być zaangażowany w inne aspekty zachowania, takie jak motywacja i uwaga6. Bezpośrednia stymulacja elektryczna jądra PPN o wysokiej częstotliwości (40 - 60 Hz)7 u zwierząt bezmózgowych może sprzyjać lokomocji. W ostatnich latach głęboka stymulacja mózgu (DBS) PPN była stosowana w leczeniu pacjentów cierpiących na zaburzenia związane z deficytami chodu, takie jak choroba Parkinsona (PD)8.
Poprzednie raporty wykazały, że prawie wszystkie neurony PPN mogą uruchamiać potencjały czynnościowe na częstotliwości pasma gamma po depolaryzacji za pomocą impulsów prądu kwadratowego9. Ze względu na drastyczną aktywację kanałów potasowych bramkowanych napięciem podczas depolaryzacji impulsów kwadratowych do lub poniżej -25 mV. W konsekwencji nie zaobserwowano silnych oscylacji gamma po zablokowaniu generowania potencjałów czynnościowych za pomocą tetrodotoksyny10. W celu ominięcia tego problemu zastosowano rampy prądu depolaryzacyjnego o długości 1 - 2 sekund. Rampy stopniowo depolaryzowały potencjał membranowy od wartości spoczynkowych do 0 mV, jednocześnie częściowo dezaktywując kanały potasowe bramkowane napięciem. Wyraźne oscylacje membrany pasma gamma były widoczne w oknie zależności od napięcia wysokoprogowych kanałów wapniowych (tj. między -25 mV a -0 mV) 10. Podsumowując, aktywność pasma gamma zaobserwowano w neuronach PPN9, a zarówno kanały wapniowe bramkowane napięciem typu P/Q, jak i N muszą być aktywowane, aby wygenerować oscylacje pasma gamma w PPN10.
Seria badań określiła lokalizację wysokoprogowych kanałów wapniowych w neuronach PPN. Wstrzykując kombinację barwników, ratiometryczne obrazowanie fluorescencyjne wykazało przejściowe stany nieustalone wapnia przez bramkowane napięciem kanały wapniowe, które są aktywowane w różnych dendrytach po depolaryzacji za pomocą ramp prądowych11.
Zasugerowano, że wewnętrzne właściwości neuronów PPN umożliwiają jednoczesną aktywację tych komórek podczas czuwania i snu REM, wywołując w ten sposób oscylacyjną aktywność neuronów o wysokiej częstotliwości między pętlami RAS i korowo-wzgórzowymi. Uważa się, że taka dalekosiężna interakcja wspiera stan mózgu zdolny do wiarygodnej oceny otaczającego nas świata w sposób ciągły12. W tym miejscu opisujemy warunki eksperymentalne niezbędne do wytworzenia i utrzymania oscylacji pasma gamma w komórkach PPN in vitro. Protokół ten nie został wcześniej opisany i pomógłby wielu grupom w badaniu wewnętrznych właściwości błony pośredniczącej w aktywności pasma gamma w innych obszarach mózgu. Co więcej, obecne działania mogą prowadzić do błędnego wniosku, że aktywność pasma gamma nie może być generowana w tych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>C12H22O11, masa cząsteczkowa = 342.30</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td>NaHCO3, masa cząsteczkowa = 84.01</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>KCl, masa cząsteczkowa = 74.55</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu Hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>MgCl2 &middot; 6H2O, masa cząsteczkowa =&nbsp; 203.30</td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>CaCl2 &middot; 2H2O, masa cząsteczkowa =147.02</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>C6H12O6, masa cząsteczkowa = 180.16</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>C6H8O6, masa cząsteczkowa =176.12</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Acros Organics</td><td>327300025</td><td>NaCl, Masa cząsteczkowa =&nbsp; 58.44</td></tr><tr><td>Glukonian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>C6H11KO7, masa cząsteczkowa =&nbsp; 234.25</td></tr><tr><td>Sól fosfokreatyny di(tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1937</td><td>C4H10N3O5P &middot; 2C4H11NO3, masa cząsteczkowa =&nbsp; 453.38</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>C8H18N2O4S, masa cząsteczkowa = 238.30</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0396</td><td>[-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, masa cząsteczkowa = 380.40</td></tr><tr><td>Sól magnezowa adenozyno-5'-trifosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&nbsp; C10H16N5O13P3 &middot; xMg2+, masa cząsteczkowa = 507.18</td></tr><tr><td>Hydrat soli sodowej 5'-trifosforanu guanozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>C10H16N5O14P3 &middot; xNa+, masa cząsteczkowa = 523.18</td></tr><tr><td>Cytrynian tetrodotoksyny</td><td>Alomone Labs</td><td>T-550</td><td>C11H17N3O8, masa cząsteczkowa = 319.27</td></tr><tr><td>&nbsp; Kwas DL-2-amino-5-fosfonowalerianowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td>&nbsp; C5H12NO5P, masa cząsteczkowa = 197.13</td></tr><tr><td>CNQX sól disodowa hydrat &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>C9H2N4Na2O4 &middot; xH2O, masa cząsteczkowa = 276.12</td></tr><tr><td>Strychnina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td>C21H22N2 O2, masa cząsteczkowa = 334.41</td></tr><tr><td>Chlorowodorek mekamylaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9020</td><td>&nbsp; C11H21N &middot; HCl, masa cząsteczkowa = 203.75</td></tr><tr><td>Gabazine (SR-95531)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S106</td><td>C15H18BrN3O3, masa cząsteczkowa = 368.23</td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Mylan</td><td>67457-001-00</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik A/D</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A Grzałka</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr><tr><td>Wkład pompy</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>Wibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>&nbsp; Leica VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Układ chłodniczy</td><td>Vibratome Instruments</td><td>900R</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskop</td><td>Mikromanipulator Nikon</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>ROE-200</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>wzmacniacz</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik A/D</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Grzałka Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>pompa</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 7519-20</td><td></td></tr> wkład do pipet <tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex 7519-85</td><td></td></tr><tr><td>Sutter</td><td> Przyrządy</td> kamery <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Q-Imaging</td><td>RET-200R-F-M-12-C</td><td></td></tr></tbody></table>

rejestrowanie oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego

Recording Gamma Band Oscillations in Pedunculopontine Nucleus Neurons

Synaptyczne czynniki odprowadzające z PPN są znane z modulowania aktywności neuronalnej kilku śródlaminarnych regionów wzgórza (np. środkowo-bocznego/parapęsowego; jądro Cl/Pf). Opisano aktywację jąder PPN lub Cl / Pf in vivo w celu wywołania pobudzenia zwierzęcia i wzrostu aktywności pasma gamma w elektroencefalogramie korowym (EEG). Mechanizmy komórkowe generowania oscylacji pasma gamma w neuronach siatkowatego układu aktywującego (RAS) są takie same, jak te, które generują oscylacje pasma gamma w innych jądrach mózgu. Podczas zapisów cęgowych prądu neuronów PPN (z wycinków przystrzałkowych od 9 do 25 jednodniowych szczurów), zastosowanie depolaryzujących kwadratowych kroków szybko aktywowało zależne od napięcia kanały potasowe, które zapobiegały depolaryzacji neuronów PPN powyżej -25 mV.
Wstrzykiwanie 1 - 2 sekundowych ramp prądu depolaryzującego stopniowo depolaryzuje wartości spoczynkowe potencjału membrany PPN w kierunku 0 mV. Jednak wstrzykiwanie depolaryzujących impulsów kwadratowych generowało oscylacje potencjału błonowego w paśmie gamma, które okazały się mieć mniejszą amplitudę w porównaniu z oscylacjami generowanymi przez rampy. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w obecności kanałów sodowych bramkowanych napięciem i blokerów szybkich receptorów synaptycznych. Wykazano, że aktywacja wysokoprogowych kanałów wapniowych zależnych od napięcia leży u podstaw aktywności oscylacyjnej pasma gamma w neuronach PPN. Opisano tutaj konkretne interwencje metodologiczne i farmakologiczne, dostarczające narzędzi niezbędnych do wywołania i podutrzymania podprogowych oscylacji pasma gamma PPN in vitro.

Początkowo oscylacje gamma wywoływano za pomocą prostokątnych impulsów prądowych. Rejestracja prądowa neuronów PPN w obecności blokerów synaptycznych i TTX była stale monitorowana, aby upewnić się, że spoczynkowy potencjał błonowy pozostawał stabilny na poziomie ~-50 mV (Rysunek 1A). Dwusekundowe prostokątne impulsy prądowe były wstrzykiwane wewnątrzkomórkowo za pomocą wzmacniacza patch clamp poprzez pipetę rejestrującą, zwiększając ich amplitudę od 20 pA do 60 pA (<stron...

Jądro szypułkonowe (PPN) znajduje się w pniu mózgu, a jego neurony są maksymalnie aktywowane podczas czuwania i szybkich ruchów gałek ocznych (REM) podczas snu mózgu. W pracy opisano eksperymentalne podejście do rejestracji in vitro podprogowych oscylacji błony pasma gamma w neuronach PPN.

Rejestrowanie oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego

Synaptic efferents from the PPN are known to modulate the neuronal activity of several intralaminar thalamic regions (e.g., the ...

Ogólnym celem niniejszej demonstracji jest opisanie metody wykrywania oscylacji wysokoprogowych i podprogowych w neuronach jądra mostkowo-rdzeniowego (pedunculopontine). Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące na przykład tego, w jaki sposób komórki utrzymują częstotliwość wyładowań. W jaki sposób populacje utrzymują swoją częstotliwość wyładowań?Wiemy, że obwody nie są w stanie utrzymać oscylacji w paśmie gamma lub w zakresie od 40 do 60 herca. W związku z tym niezbędne są wrodzone właściwości błony, aby utrzymać taką częstotliwość wyładowań. Procedurę zademonstrują Susan Mahaffey i dr Stasia D'Onofrio.Aby przygotować standardowy aCSF, należy najpierw przygotować roztwory zapasowe A i B i przechowywać je w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch tygodni. Przed każdym eksperymentem wymieszaj 50 mililitrów roztworu zapasowego A z 50 mililitrami roztworu zapasowego B. Następnie dopełnij mieszaninę wodą destylowaną do objętości jednego litra i napowietrzaj ją karbogenem w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Przenieś roztwór do zlewki w celu mieszania i dalszego napowietrzania.Po napowietrzaniu dodaj chlorek wapnia. Następnie przygotuj sucrose aCSF, sporządzając roztwór zapasowy C. Przed każdym eksperymentem wymieszaj 300 mililitrów roztworu zapasowego C z 600 mililitrami wody destylowanej i napowietrzaj go karbogenem w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Po tym czasie przelej 100 mililitrów roztworu sucrose aCSF do czystego zlewki, umieść go w lodzie i utrzymuj natlenienie za pomocą karbogenu.Następnie napełnij komorę tnącą wibratomu sacharozowym aCSF i zapewnij stałe natlenienie. Włącz system chłodzenia oparty na glicerolu, połączony z komorą tnącą, i odczekaj 15 minut, aż temperatura spadnie do około czterech stopni Celsjusza. Następnie wyjmij mózg szczeniaka, wsuwając szpatułkę pod opuszki węchowe i delikatnie wypychając go z obszaru najbardziej rostralnego w kierunku obszaru najbardziej caudalnego.Następnie umieść mózg w schłodzonym w lodzie, napowietrzonym roztworze aCSF z sacharozą. Wykonaj cięcie parasagittalne w prawej półkuli, aby usunąć około 1/3 półkuli. Następnie przyklej przyciętą stronę mózgu do metalowego dysku.Następnie przymocuj metalowy dysk do komory tnącej wibratomu i wykonaj 400 micronowe przekroje strzałkowe zawierające PPN. Przechowuj plastry PPN w temperaturze pokojowej przez 45 minut przed rejestracją metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. W tej procedurze przenieś plaster do komory zanurzeniowej, umieść na nim siatkę, aby go przytrzymać, i perfunduj z prędkością 1,5 milliliters per minute natlenionym aCSF zawierającym wybrany antagonista receptora.Aby wyizolować wewnątrzpochodne właściwości błonowe, należy zablokować szybką transmisję synaptyczną wokół komórki oraz uniemożliwić generowanie potencjałów czynnościowych, dlatego należy zastosować blokery synaptyczne oraz tetrodotoksynę (TTX). W ten sposób komórka, w której wykonuje się patch-clamp, jest jedynym źródłem tych właściwości, a nie wynikają one z wejść synaptycznych – i to właśnie badamy w niniejszym doświadczeniu: wewnątrzpochodne właściwości błonowe. Następnie należy napełnić pipetę rejestrującą wewnętrznym roztworem o wysokim stężeniu potasu.Włóż pipetę do uchwytu głowicy. Następnie, za pomocą strzykawki o objętości jednego mililitra podłączonej do uchwytu pipety, przyłóż niewielkie dodatnie ciśnienie. Korzystając z obiektywu 4x wraz z optyką kontrastu fazowego w bliskiej podczerwieni, zlokalizuj jądro PPN, które znajduje się grzbietowo względem górnego pęczka móżdżku.Powoli opuść pipetę rejestrującą do jądra PPN za pomocą mechanicznego mikromanipulatora. Następnie ustaw pipetę rejestrującą w części zwartej (pars compacta) PPN, która znajduje się bezpośrednio grzbietowo od tylnego końca pieszka. Korzystając z obiektywu imersyjnego wodnego 40x, doprowadź pipetę rejestrującą do kontaktu z neuronem PPN i szybko zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie z komórką.Użyj oprogramowania do uszczelniania w układzie voltage clamp, aby monitorować oporność pipety podczas aplikacji podciśnienia. Następnie powoli zwiększaj podciśnienie. Gdy wartość oporności pipety osiągnie od 80 do 100 megaohmów, szybko zmień potencjał podtrzymujący na 50 miliwoltów i zwolnij podciśnienie.Stosuj ciśnienie ujemne w sposób ciągły, aż do momentu przerwania błony komórkowej i uzyskania dostępu elektrycznego w konfiguracji whole-cell. Przed zassaniem rezystancja jest niska, w tym przypadku wynosi 2,5 megaomów. W miarę przykładania ssania amplituda skoku maleje aż do momentu stabilizacji.Po utworzeniu uszczelnienia należy zauważyć, że oporność wzrasta do 167 megaomów. Dzięki dodatkowemu podciśnieniu powstaje gigauszczelnienie (gigaseal). Oporność krótko wzrasta do 1,2 gigaoma przed uzyskaniem pełnego dostępu.Nieprzerwanie monitoruj potencjał spoczynkowy błony rejestrowanego neuronu PPN. Jeśli potencjał spoczynkowy przesunie się w stronę wartości depolaryzacyjnych lub hiperpolaryzacyjnych, zastosuj niewielki prąd stały, aby utrzymać optymalny potencjał na poziomie 50 millivolts. Powodem stosowania ramp prądowych jest możliwość powolnej depolaryzacji błony bez aktywacji kanałów potasowych, które mogłyby uniemożliwić dostatecznie silną depolaryzację błony, niezbędną do osiągnięcia progu aktywacji badanych kanałów wapniowych o wysokim progu.Przedstawiono tutaj reprezentatywne potencjały błonowe w odpowiedzi na depolaryzujące, dwusekundowe skokowe zmiany natężenia prądu, wstrzykiwanego do wnętrza komórki poprzez pipetę rejestrującą w obecności blokerów synaptycznych i TTX. Rycina ta przedstawia widmo mocy oscylacji błonowych wywołanych wskazanymi skokami natężenia prądu w trzech pomiarach. Częstotliwości te charakteryzowały się niską mocą i niską wartością.Rysunek ten przedstawia rampy prądowe o wartościach 200, 400 i 700 pA oraz odpowiedzi błonowe. Należy zauważyć, że błona jest wystarczająco zdepolaryzowana, aby osiągnąć 30 mV, przy których zaczynają otwierać się kanały wapniowe o wysokim progu, jak w zapisie niebieskim, oraz poziom 10 mV, przy którym amplituda ich oscylacji jest maksymalna, jak w zapisie czerwonym. Wykres ten przedstawia widmo mocy oscylacji błonowych wywołanych rampami prądowymi w trzech odpowiadających im zapisach.Częstotliwości indukowane rampą 400 pA mieściły się w zakresie beta, a indukowane rampą 700 pA w zakresie gamma. Po opanowaniu techniki, procedura ta zajmuje około godziny lub mniej. Podczas rejestracji bardzo ważne jest upewnienie się, że uzyskano szczelne połączenie oraz że kompensacja pojemności i rezystancja szeregowa są starannie monitorowane, aby mieć pewność, że podczas procedury rejestracji nie zachodzą istotne zmiany.Po wyizolowaniu tych oscylacji można przeprowadzić testy w celu ustalenia, czy są one rzeczywiście pośredniczone przez kanały wapniowe typu N lub typu P/Q. Do blokowania oscylacji zależnych od kanałów typu N można użyć konotoksyny, a do blokowania oscylacji zależnych od kanałów typu P/Q – agatoksyny. Wraz z rozwojem tej techniki znacznie łatwiejsze stało się wykazanie, że kanały wapniowe o wysokim progu są rzeczywiście niezbędne dla wewnętrznych oscylacji błonowych; przełomem w badaniach nad snem było ustalenie, że układ siateczkowaty może samodzielnie generować oscylacje z pasma gamma.

recording-gamma-band-oscillations-in-pedunculopontine-nucleus-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aktywność w układach neuronalnych często wymaga synchronicznych wyładowań potencjałów czynnościowych neuronów w obrębie konkretnej populacji. Na przykład impulsy hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) prawdopodobnie wymagają skoordynowanej aktywności między neuronami GnRH. Przedstawiamy nasze podejście metodologiczne pozwalające na niezawodne uzyskiwanie jednoczesnych rejestracji elektrofizjologicznych z rozproszonych neuronów GnRH.

Podwójne rejestracje somatyczne z neuronów wydzielających hormon uwalniający gonadotropiny (GnRH) zidentyfikowanych za pomocą zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) w skrawkach podwzgórza

Film demonstruje metodę rejestrowania oscylacji pasma gamma w neuronach PPN. Wykorzystując strzałkowy odcinek mózgu z blokerami synaptycznymi w aCSF, wykorzystuje dodatnie impulsy prądu za pośrednictwem pipety do otwierania kanałów wapniowych, indukując aktywność podprogową niezbędną do czuwania.

Rejestrowanie oscylacji pasma gamma z neuronów jądra szypułkowego w wycinku mózgu

Ten film demonstruje szczegółową procedurę przygotowania znieczulonego szczura do elektrofizjologicznych zapisów aktywności mózgu z wielu miejsc. Skóra głowy jest preparowana w celu uzyskania dostępu do czaszki, a otwory są wiercone w precyzyjnych miejscach, aby zainstalować i zabezpieczyć elektrody. Elektrody wolframowe są następnie umieszczane w docelowym miejscu w celu zarejestrowania danych.

Elektrofizjologiczne zapisy in vivo aktywności mózgu z wielu miejsc u szczurów

Ten film demonstruje procedurę indukowania lokalnych oscylacji gamma CA1 w wycinku mózgu myszy w hipokampie CA1 za pomocą symulacji tężcowych. Ta metoda jest ważna dla zrozumienia aktywności sieci neuronalnej.

Generowanie lokalnych oscylacji gamma Cornu Ammonis 1 (CA1) za pomocą stymulacji tężcowej w wycinku mózgu hipokampa

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Oscylacje są podstawowymi właściwościami sieci i są modulowane przez choroby i leki. Badanie oscylacji wycinków mózgu pozwala na scharakteryzowanie izolowanych sieci w kontrolowanych warunkach. Zapewniono protokoły przygotowania ostrych wycinków mózgu do wywoływania oscylacji γ CA1.

Generowanie lokalnych oscylacji γ CA1 przez stymulację tężcową

Tutaj prezentujemy protokół rejestrowania rytmicznych oscylacji sieci neuronalnej theta i gamma z izolowanego całego preparatu hipokampa. Opisujemy etapy eksperymentalne od ekstrakcji hipokampa do szczegółów nagrań klamry polowej, unitarnej i całokomórkowej, a także optogenetycznej stymulacji rytmu theta.

Dostrajanie w paśmie theta hipokampa in vitro: metodologie nagrywania z izolowanego obwodu septohipokampa gryzoni

W tym badaniu przedstawiono metodologię wykonywania wielomiejscowych zapisów elektrofizjologicznych in vivo ze szlaku hiperbezpośredniego w znieczuleniu uretanowym.

Ostre zapisy elektrofizjologiczne in vivo lokalnych potencjałów pola i aktywności wielocząsteczkowej ze szlaku hiperbezpośredniego u znieczulonych szczurów

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj metodę rejestracji oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego (PPN) przy użyciu patch clamp. Technika ta pozwala badać właściwości wewnętrzne błony komórkowej i mechanizmy utrzymania częstotliwości pobudzenia.

Rejestrowanie oscylacji pasma gamma w neuronach jądra szypułkowego

Przeglądaj więcej filmów