Name: Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Odkryj metodę identyfikacji zdarzeń sygnalizacyjnych w żywotnych komórkach BUNPT po interakcji z sąsiednimi komórkami apoptotycznymi. Protokół ten pozwala badać wpływ martwych komórek na żywe sąsiadki w kontekście biologii komórki, patologii i fizjologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana, w całości lub w części, przez fundusze instytucjonalne od dr José A. Arruda i Sekcji Nefrologii, University of Illinois w Chicago (do J. S. L.); oraz fundusze z Wydziału Medycyny Uniwersytetu McGill i Instytutu Badawczego Centrum Zdrowia Uniwersytetu McGill (dla J. R.)

<ol><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+versus+accessory+aspects+of+cell+death%3A+recommendations+of+the+NCCD+2015%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Essential versus accessory aspects of cell death: recommendations of the NCCD 2015.</a> Cell Death Differ. 22, 58-73 (2015).</li>
<li>Wallach, D., Kang, T. -B., Kovalenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concepts+of+tissue+injury+and+cell+death+in+inflammation%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concepts of tissue injury and cell death in inflammation: a historical perspective.</a> Nature Rev. Immunol. 14, 51-59 (2014).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: Apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHochreiter-Hufford%2C+A+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22">Cold Spring Harb. Perspect. Biol</a>. 5, a008748(2013).</li>
<li>Reddy, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+macrophages+induces+novel+signaling+events+leading+to+cytokine-independent+survival+and+inhibition+of+proliferation%3A+activation+of+Akt+and+inhibition+of+extracellular+signal-regulated+kinases+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2.</a> J. Immunol. 169, 702-713 (2002).</li>
<li>Cvetanovic, M., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+discrimination+of+apoptotic+cells%3A+repression+of+proinflammatory+macrophage+transcription+is+coupled+directly+to+specific+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition.</a> J. Immunol. 172, 880-889 (2004).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells%2C+at+all+stages+of+the+death+process%2C+trigger+characteristic+signaling+events+that+are+divergent+from+and+dominant+over+those+triggered+by+necrotic+cells%3A+implications+for+the+delayed+clearance+model+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: implications for the delayed clearance model of autoimmunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 4663-4670 (2006).</li>
<li>Cvetanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+apoptotic+cells+reveals+a+ubiquitous+and+unconventional+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity.</a> J. Biol. Chem. 281, 20055-20067 (2006).</li>
<li>Birge, R. B., Ucker, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+apoptotic+immunity%3A+the+calming+touch+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Innate apoptotic immunity: the calming touch of death.</a> Cell Death Differ. 15, 1096-1102 (2008).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+apoptotic+cells+by+epithelial+cells%3A+conserved+versus+tissue-specific+signaling+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition of apoptotic cells by epithelial cells: conserved versus tissue-specific signaling responses.</a> J. Biol. Chem. 285, 1829-1840 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition-dependent+signaling+events+in+response+to+apoptotic+targets+inhibit+epithelial+cell+viability+by+multiple+mechanisms%3A+implications+for+non-immune+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recognition-dependent signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms: implications for non-immune tissue homeostasis.</a> J. Biol. Chem. 287, 13761-13777 (2012).</li>
<li>Voll, R. E., Herrmann, M., Roth, E. A., Stach, C., Kalden, J. R., Girkontaite, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppressive+effects+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunosuppressive effects of apoptotic cells.</a> Nature. 390, 350-351 (1997).</li>
<li>Fadok, V. A., Bratton, D. L., Konowal, A., Freed, P. W., Westcott, J. Y., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+that+have+ingested+apoptotic+cells+in+vitro+inhibit+proinflammatory+cytokine+production+through+autocrine%2F+paracrine+mechanisms+involving+TGF-%CE%B2%2C+PGE2%2C+and+PAF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Investig%22%5BJournal%5D)">Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/ paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2, and PAF.</a> J. Clin. Investig. 101, 890-898 (1998).</li>
<li>Lucas, M., Stuart, L. M., Savill, J., Lacy-Hulbert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+and+innate+immune+stimuli+combine+to+regulate+macrophage+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells and innate immune stimuli combine to regulate macrophage cytokine secretion.</a> J. Immunol. 171, 2610-2615 (2003).</li>
<li>Ariel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+neutrophils+and+T+cells+sequester+chemokines+during+immune+response+resolution+through+modulation+of+CCR5+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic neutrophils and T cells sequester chemokines during immune response resolution through modulation of CCR5 expression.</a> Nature Immunol. 7 (11), 1209-1216 (2006).</li>
<li>Schwab, J. M., Chiang, N., Arita, M., Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+E1+and+protectin+D1+activate+inflammation-resolution+programmes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolvin E1 and protectin D1 activate inflammation-resolution programmes.</a> Nature. 447, 869-874 (2007).</li>
<li>Rothlin, C. V., Ghosh, S., Zuniga, E. I., Oldstone, M. B. A., Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+are+pleiotropic+inhibitors+of+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response.</a> Cell. 131, 1124-1136 (2007).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+can+activate+the+%22phoenix+rising%22+pathway+to+promote+wound+healing+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells can activate the "phoenix rising" pathway to promote wound healing and tissue regeneration.</a> Sci. Signal. 3, ra13(2010).</li>
<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15 (2010), 1007-1028 (2010).</li>
<li>Patel, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+activate+AMPK+and+inhibit+epithelial+cell+growth+without+change+in+intracellular+energy+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells activate AMPK and inhibit epithelial cell growth without change in intracellular energy stores.</a> J. Biol. Chem. 290, 22352-22369 (2015).</li>
<li>Hess, K. L., Tudor, K. -S. R. S., Johnson, J. D., Osati-Ashtiani, F., Askew, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cook-Mills+J.M.+Human+and+murine+high+endothelial+venule+cells+phagocytose+apoptotic+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cook-Mills J.M. Human and murine high endothelial venule cells phagocytose apoptotic leukocytes.</a> Exp. Cell Res. 236, 404-411 (1997).</li>
<li>Zernecke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+microRNA-126+by+apoptotic+bodies+induces+CXCL12-dependent+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection.</a> Sci. Signal. 2, ra51(2009).</li>
<li>Esmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+neutrophil+granulocytes%3A+diminished+proinflammatory+neutrophil+functions+in+the+presence+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells.</a> J. Immunol. 184, 391-400 (2010).</li>
<li>Obeid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calreticulin+exposure+dictates+the+immunogenicity+of+cancer+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death.</a> Nature Med. 13, 54-61 (2007).</li>
<li>Peter, C., Wesselborg, S., Hermann, M., Lauber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dangerous+attraction%3A+phagocyte+recruitment+and+danger+signals+of+apoptotic+and+necrotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells.</a> Apoptosis. 15, 1007-1028 (2010).</li>
<li>Sinha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+activates+the+Wnt+and+phosphatidylinositol+3-kinase+Akt+signaling+pathways+to+promote+cell+survival+in+the+absence+of+soluble+survival+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lithium activates the Wnt and phosphatidylinositol 3-kinase Akt signaling pathways to promote cell survival in the absence of soluble survival factors.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, F703-F713 (2005).</li>
<li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Wakasugi, K., Schimmel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+cytokines+released+from+a+human+aminoacyl-tRNA-synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct cytokines released from a human aminoacyl-tRNA-synthetase.</a> Science. 284, 147-151 (1999).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiamy tutaj protokół charakteryzujący wewnątrzkomórkowe zdarzenia sygnalizacyjne indukowane w żywych komórkach po ich ekspozycji na komórki poddawane apoptozie lub innym formom śmierci komórki. Protokół podkreśla wiele mechanizmów, dzięki którym ekspozycja na komórki apoptotyczne może modulować wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe w żywotnych komórkach reagujących. Mechanizmy te obejmują: interakcję (poprzez cząsteczki mostkujące lub determinanty powierzchniowe na martwej komórce lub jej zrzuconych pęcherzykach i m...

Apoptoza, czyli regulowana śmierć komórki1, przyczynia się w istotny sposób do utrzymania i rozwoju tkanek. Patrząc najprościej, apoptoza pozwala na eliminację starych, uszkodzonych lub nadmiarowych komórek bez szkody dla otaczających tkanek2,3. Udział apoptozy w homeostazie tkanek jest jednak znacznie bardziej dynamiczny i zróżnicowany. Komórki umierające w wyniku apoptozy nabywają wiele nowych aktywności, zarówno wydzielanych, jak i związanych z komórkami, które umożliwiają im wpływanie na funkcję sąsiednich żywych komórek4-10. Wcześniejsze badania koncentrowały się na zdolności komórek apoptotycznych do tłumienia stanu zapalnego11-16, ale komórki apoptotyczne modulują również szeroki zakres funkcji komórkowych, w tym tak ważne czynności, jak przeżycie4,9,10, proliferacja4,9,10, różnicowanie17, migracja18 i wzrost19. Co więcej, efekty te nie ograniczają się do profesjonalnych fagocytów, takich jak makrofagi, ale rozciągają się na praktycznie wszystkie typy komórek i linie, w tym tradycyjnie komórki niefagocytarne, takie jak komórki nabłonkowe i śródbłonka7,9,10,18-21.
Specyficzna reakcja sąsiednich żywych komórek po ekspozycji na komórki apoptotyczne zależy od wielu czynników, które odnoszą się zarówno do żywotnych komórek reagujących, jak i samych komórek apoptotycznych. Na przykład, chociaż narażenie na komórki apoptotyczne hamuje proliferację zarówno mysich makrofagów, jak i komórek nabłonka kanalików proksymalnych nerek (PTEC), te dwa typy komórek różnią się znacznie pod względem odpowiedzi na przeżycie komórek apoptotycznych4,6,9,10. Komórki apoptotyczne sprzyjają przetrwaniu makrofagów, ale indukują apoptotyczną śmierć PTEC4,6,9,10. Warto zauważyć, że odpowiedź na komórki apoptotyczne może się różnić nawet między reagującymi komórkami tej samej linii, w zależności od narządu pochodzenia komórkiodpowiadającej 10 (np. PTEC nerki w porównaniu z komórkami nabłonka sutka) lub stanu aktywacji22 (np. neutrofile). I odwrotnie, komórki apoptotyczne mogą wywoływać różne reakcje w tej samej komórce w zależności od charakteru bodźca apoptotycznego10,23 lub etapu apoptozy10,14.
Biorąc pod uwagę różnorodność i złożoność odpowiedzi na komórki apoptotyczne, należy zachować dużą ostrożność przy analizowaniu zdarzeń sygnalizacyjnych i ścieżek odpowiedzialnych za poszczególne wyniki. Po pierwsze, odpowiedzi wymagające bezpośredniej fizycznej interakcji między komórkami żywotnymi i apoptotycznymi muszą być zróżnicowane od tych wywoływanych przez rozpuszczalne mediatory uwalniane lub generowane przez komórkę apoptotyczną3,6-10. Jeśli wymagana jest interakcja fizyczna, należy przeprowadzić dalsze różnicowanie. Zdarzenia sygnalizacyjne mogą zależeć od rozpoznania komórki apoptotycznej za pośrednictwem receptora, niezależnie od późniejszego pochłonięcia, lub od wychwytu fagocytarnego, niezależnie od specyficznego receptora, który wiąże komórkę apoptotyczną3-7,9,10,19. W tym drugim przypadku odpowiedź nie jest specyficzna dla komórek apoptotycznych i może być wywołana przez dowolny materiał fagocytarny4,6.
Znaczenie tych różnic można ponownie docenić poprzez porównanie reakcji makrofagów i nerek PTEC. W przypadku obu typów komórek ekspozycja na komórki apoptotyczne zmienia aktywność kinazy Akt, która sprzyja przeżyciu. Modulacja jest zależna od interakcji fizycznej, ponieważ oddzielenie komórek reagujących i apoptotycznych przez membranę poliwęglanową o grubości 0,4 μm znosi odpowiedź4,9,10,19. Jednak odpowiedź PTEC jest zależna od receptora i niezależna od fagocytozy, podczas gdy odpowiedź makrofagów jest napędzana przez fagocytozę4,9,10,19. Wniosek ten jest wzmocniony przez fakt, że ekspozycja na kulki lateksowe, neutralny bodziec fagocytarny, nie ma wpływu na aktywność Akt w PTEC, ale naśladuje działanie komórek apoptotycznych w makrofagach4,9.
Chociaż mniej zbadane, komórki umierające w wyniku nekrozy, czyli przypadkowej śmierci komórki1, również modulują funkcję pobliskich żywotnych komórek3-10,19. Podobnie jak komórki apoptotyczne, komórki martwicze wywierają swoje działanie poprzez różne mechanizmy, w szczególności wyciek treści wewnątrzkomórkowej przez pękniętą błonę komórkową3,5,6,9,24. Wiele komórek, w tym PTEC i makrofagi, posiada odrębne, niekonkurencyjne receptory dla komórek umierających w wyniku martwicy5,9. Zaangażowanie tych receptorów indukuje zdarzenia sygnalizacyjne, które często są przeciwne do tych indukowanych przez zaangażowanie receptorów dla komórek apoptotycznych4-10,19. Na przykład w PTEC komórki martwicze zwiększają fosforylację Akt, podczas gdy komórki apoptotyczne zmniejszają fosforylację9,10,19.
Tutaj opisujemy protokół identyfikacji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych nerkach PTEC poprzez pośredniczące w receptorze rozpoznawanie sąsiednich apoptotycznych PTEC9,10,19. Chociaż protokół jest specyficzny dla warunkowo unieśmiertelnionej linii komórkowej PTEC znanej jako BU. Komórki MPT9,10,19,25,26, łatwo przystosowują się do linii komórkowych, które są pochodzenia nienabłonkowego i / lub pochodzą z narządów innych niż nerka. Co ważne, wykorzystanie komórek apoptotycznych jako bodźca komórkowego stwarza pewne nieodłączne trudności eksperymentalne, które nie występują w przypadku rozpuszczalnych ligandów. Najważniejszym z nich jest to, że komórki apoptotyczne muszą być dodawane w postaci zawiesiny, a nie roztworu. Trudności te, jak również strategie ich minimalizacji lub obejścia, są omówione w protokole. Prawie wszystkie techniki opisane w protokole są proste i standardowe dla hodowli komórkowych. Zaletą tego protokołu jest zwrócenie uwagi na wiele mechanizmów, za pomocą których komórki apoptotyczne modulują transdukcję sygnału w odpowiadających komórkach. Mechanizmy te obejmują wiązanie się za pomocą determinantów powierzchniowych lub cząsteczek mostkujących ze specyficznymi receptorami w reagującej komórce, uwalnianie rozpuszczalnych mediatorów i/lub angażowanie maszynerii fagocytarnej. Komórki martwicze są uwzględniane we wszystkich eksperymentach, aby zapewnić, że wyniki są specyficzne dla sposobu śmierci komórki, a nie uogólnionej odpowiedzi na martwe komórki. Ostrożne podejście, zgodnie z zaleceniami zawartymi w tym protokole, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia stale rosnącego wpływu, jaki umierające komórki wywierają na swoich żyjących sąsiadów, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

<table><tbody><tr><td>Materiały do hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1x z [4,5 g/L] glukozą, &#671;-glutaminą i pirogronianem sodu</td><td>Mediatech (Manassas, VA)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Clone II, płodowa surowica bydlęca</td><td>GE Healthcare (Logan, UT)</td><td>SH30066.03</td><td>dodać 10% (v/v)&nbsp; do pożywki hodowlanej</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina, 100x</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>10378-016</td><td>dodać 100 jednostek/ml do pożywki hodowlanej Interferon A i B</td></tr><tr><td>&gamma;, rekombinowany u myszy, z Escherichia coli</td><td>Calbiochem, Millipore (Billerica, MA)</td><td>407303</td><td>dodać 10 jednostek/ml do pożywki</td></tr><tr><td>A Naczynia z polistyrenu polistyrenowego poddanego kulturze tkankowej Falcon, niepirogenne</td><td>Corning (Durham, NC)</td><td>353003</td><td>sterylne, </td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe do polistyrenu Falcon o średnicy 100 mm, stożkowe dno</td><td>Corning (Durham, NC)</td><td>352095</td><td>sterylne, 15 ml</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA, 0,05%, Gibco</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td>25300062</td><td>sterylne, 100 mL</td></tr><tr><td><mocny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Katalog</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Chemicals and inhibitors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine z Streptomyces sp.</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>S4400</td><td>zastosowanie w [1 &mu; g / mL] przez 3 godziny w celu wywołania apoptozy</td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), [1 mg / ml]</td><td>Milipore (Billerica, MA)</td><td>EA140</td><td>stosować przy 50 nM w celu stymulacji komórek reagujących</td></tr><tr><td>UltraPure, 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>15575-038</td><td>użyć 5 mM do odłączenia przylegających komórek</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td> <td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>91691049</td><td>do barwienia</td></tr> <tr><td>martwych komórekRoztwór paraformaldehydu, 4% w DPBS</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA)</td><td>19943</td><td>użyj 0,4% (v/v) w 1x DPBS do utrwalenia komórek</td></tr><tr>Sól fizjologiczna<td>buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS), 1x, Gibco</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>14040133</td><td>roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS), Ca2+- i Mg2+, 1x, Gibco</td><td>Life Technologies (Grand Island, NY)</td><td>14190367</td><td>roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Cytochalazyna D, 4 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO), z Zygosporium mansonii</td><td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>C8273</td><td>zastosowanie w [4 &mu; g / mL] w celu hamowania fagocytozy</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td> <td>Sigma (St. Louis, MO)</td><td>D2650</td><td>rozpuszczalnik do cytochalazyny D</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Składniki buforu do lizy komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS), 10x, pH 7,4</td><td>BioRad (Hercules, CA)</td><td>1706435</td><td>do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Pirofosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>221368</td><td>10 mM do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>D6750</td><td>0,5% w/v do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>L3771&nbsp;</td><td>0,1% w/v dla buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>G5516</td><td>10% do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>450022</td><td>25 mM do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Kompletna mini tabletka koktajlowa z inhibitorem proteazy bez EDTA</td><td>Roche Diagnostics (Indianapolis, IN)</td><td>4693159001</td><td>do buforu do lizy komórek, 1 tabletka na 10 ml buforu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>T8787</td><td>10% dla buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>11DTT00005</td><td>1 mM do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>4800263</td><td>1 mM do buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Ortowanat sodu</td><td>MP Biomedicals (Santa Ana, CA)</td><td>2159664</td><td>10 mM do buforu</td></tr> <tr><td>do lizy komórekNazwa</td><td>Firma</td><td>Katalog</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall T6000B wirówka</td><td>Du Pont (Wilmington, DE)</td><td>T6000B</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Tissuemat, kąpiel wodna</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator (sonikator), model 100</td><td>Fisher (Waltham, MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscellaneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek, Neubauer</td><td>Hawksley (Lancing, Sussex, Wielka Brytania)</td><td>AC2000</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC Zestaw do wykrywania apoptozy II</td><td>Millipore (Billerica, MA)</td><td>CBA059</td><td>do barwienia PI i Aneksyny V w celu określenia etapu apoptozy</td></tr><tr><td>Probówki mikromikromikrocntrifużowe Eppendorf, 1,5 ml</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalny nośnik Transwell, 0,4 &mu; m membrana poliwęglanowa</td><td>Corning (Corning, NY)</td><td>3413</td><td>sterylna, polistyren, poddana obróbce kultur tkankowych</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Katalog</silny></td><td><silny>Komentarze</silny></td></tr><tr><td><silny>Przeciwciała</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinaza syntazy fosfoglikogenu-3&alfa;/&beta; (GSK-3&alpha;/&beta;) (Ser21/9), przeciwciało poliklonalne</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9331</td><td>królicze przeciwciało poliklonalne</td></tr><tr><td>Antobody dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH) ( (14C10) ) Technologia</td> <td>sygnalizacji komórkowej</td><td>2118</td><td>przeciwciało monoklonalne królika</td></tr></tbody></table>

identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Komórki umierające w wyniku apoptozy, określanej również jako regulowana śmierć komórki, nabywają wiele nowych aktywności, które umożliwiają im wpływanie na funkcjonowanie sąsiednich żywych komórek. Czynności życiowe, takie jak przetrwanie, proliferacja, wzrost i różnicowanie, są jednymi z wielu funkcji komórkowych modulowanych przez komórki apoptotyczne. Zdolność do rozpoznawania i reagowania na komórki apoptotyczne wydaje się być uniwersalną cechą wszystkich komórek, niezależnie od linii lub narządu pochodzenia. Jednak różnorodność i złożoność odpowiedzi na komórki apoptotyczne wymaga zachowania dużej ostrożności w analizie zdarzeń sygnalizacyjnych i ścieżek odpowiedzialnych za każdy konkretny wynik. W szczególności należy rozróżnić wiele mechanizmów, za pomocą których komórki apoptotyczne mogą wpływać na wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe w żywotnych komórkach reagujących, w tym: rozpoznawanie komórki apoptotycznej za pośrednictwem receptora, uwalnianie rozpuszczalnych mediatorów przez komórkę apoptotyczną i / lub zaangażowanie maszynerii fagocytarnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych, które są indukowane w żywotnych komórkach reagujących po ich ekspozycji na komórki apoptotyczne. Główną zaletą protokołu jest uwaga, jaką poświęca on analizie mechanizmu, za pomocą którego komórki apoptotyczne modulują zdarzenia sygnalizacyjne w odpowiadających komórkach. Chociaż protokół jest specyficzny dla warunkowo unieśmiertelnionej linii komórek kanalików proksymalnych nerki myszy (BU. Komórki MPT), łatwo przystosowuje się do linii komórkowych, które są pochodzenia nienabłonkowego i/lub pochodzą z narządów innych niż nerka. Wykorzystanie martwych komórek jako bodźca wprowadza kilka unikalnych czynników, które mogą utrudniać wykrywanie wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych. Problemy te, a także strategie ich minimalizacji lub obejścia, są omawiane w protokole. Zastosowanie tego protokołu powinno pomóc nam w poszerzaniu wiedzy na temat szerokiego wpływu, jaki martwe lub umierające komórki wywierają na swoich żywych sąsiadów, zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Na Rysunku 1 przedstawiono schemat obrazujący harmonogram i kluczowe etapy przygotowania komórek apoptotycznych (Protokół 1) i komórek nekrotycznych (Protokół 2), a także stymulację komórek odpowiadających zawiesinami komórek apoptotycznych i nekrotycznych (Protokół 4).
Na Rysunku 2 przedstawiamy reprezentatywne wyniki ukazujące wpływ komórek apoptotycznych na fosforylację dwóch izoform kinazy s...

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja indukowanych zdarzeń sygnalizacyjnych i żywotnych komórek reagujących po ich fizycznej interakcji z pobliskimi martwymi komórkami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, patologii i fizjologii, takie jak wpływ, jaki martwe lub umierające komórki wywierają na swoich żywych sąsiadów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest prosta i niedroga oraz że można ją zastosować do badania efektów biologicznych indukowanych w żywych komórkach po ich interakcji z sąsiednimi komórkami ulegającymi apoptozie.Technikę zademonstruje Lanfei Feng, technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, po przepuszczeniu komórek BUNPT na 100-milimetrowe naczynia do hodowli tkankowych poddanych plazmie próżniowej, wyhoduj je w pożywce hodowlanej A do zbiegu i nawilżonej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przepłucz przylegającą monowarstwę komórek trzykrotnie pożywką hodowlaną B. Następnie wywołaj apoptozę, inkubując komórki w pożywce hodowlanej B, zawierającej staurosporynę, nieselektywny inhibitor kinazy białkowej, przez 3 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po 3 godzinach zbierz pożywkę zawierającą pływające komórki apoptotyczne, które oderwały się od monowarstwy. Następnie odwirować tę pożywkę przez dziesięć minut w temperaturze 500 razy G. Następnie wyrzucić supernatant, przemyć osad trzykrotnie pożywką hodowlaną B, przed dodaniem go z powrotem do przylegających komórek. Po tym etapie płukania odłącz pozostałe przylegające komórki, dodając 5 milimolowych EDTA do 1X DPBS wolnego od wapnia i magnezu.Zbierz pożywkę zawierającą oderwane komórki apoptotyczne i umieść oderwane komórki z pływającymi komórkami apoptozy w sterylnej 15-mililitrowej probówce wirówkowej z polistyrenu. Następnie umyj komórki apoptotyczne trzykrotnie przez wirowanie przez dziesięć minut w temperaturze 500 x G. Następnie ponownie zawiesz w dziesięciu mililitrach 1X DPBS bez wapnia i magnezu na mycie. Po ostatnim myciu zawiesić komórki apoptotyczne w świeżej pożywce hodowlanej B w ilości 5x10^6 komórek na mililitr, przed użyciem ich do stymulacji komórek odpowiadających.Alternatywnie, utrwal umyte komórki apoptotyczne w 0,4 paraformaldehydu w 1X DPBS przez 30 minut, a następnie umyj je trzykrotnie pożywką hodowlaną B i zawieś je w nim na 5x10^6 komórek na mililitr przed użyciem ich do stymulacji komórek reagujących. Po przeniesieniu komórek BUNPT na sterylne polistyrenowe naczynia do hodowli tkankowych poddanych plazmie próżniowej o średnicy 100 milimetrów, wyhoduj je do zbiegu i nawilżonej atmosfery 5% dwutlenku węgla w dopuszczalnych warunkach. Następnie przepłucz przylegającą monowarstwę komórek trzykrotnie 10 ml pożywki hodowlanej B na płukanie.Następnie odłącz komórki, dodając 5 mM EDTA do 1X DPBS bez wapnia i magnezu. Zebrać oderwane komórki od pożywki zawierającej EDTA i dodać zawiesinę komórek do sterylnej probówki wirówkowej z polistyrenu o pojemności 15 ml. Następnie umyj komórki trzykrotnie przez odwirowanie przez dziesięć minut w temperaturze 500 razy G i ponownie zawiesić w 10 ml DPBS bez wapnia i magnezu na przemycie.Po ostatnim praniu zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej B o mocy 5x10^6 komórek na mililitr. Następnie wywołaj nekrozę, podgrzewając komórki do 70 stopni Celsjusza przez 45 minut w łaźni wodnej, delikatnie wirując tę zawiesinę komórek co dziesięć minut. Po indukcji martwicy inkubuj komórki przez dwie godziny w nawilżonej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza i delikatnie wiruj zawiesinę komórek co 15 minut.W tej procedurze hoduj komórki BUNPT w sterylnych 100-milimetrowych naczyniach do hodowli tkankowych w dopuszczalnych warunkach, aż osiągną około 85% konfluencji. Następnie odessać pożywkę hodowlaną A i przepłukać komórki trzykrotnie 10 ml pożywki hodowlanej B na płukanie. Następnie surowica głodza komórki w pożywce hodowlanej B przez 18 do 24 godzin w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla w warunkach niedozwolonych, w celu wywołania spoczynku.Oznaczyć oddzielną miskę do hodowli tkankowej z zlewających się komórek BUNPT dla sześciu warunków eksperymentalnych dla następnej procedury. Teraz odessać pożywkę hodowlaną B z wcześniej znakowanych naczyń spoczynkowych komórek odpowiadających BUNPT. Aby przygotować 100-milimetrowe szalki w różnych warunkach, dodaj dwa ml pożywki hodowlanej B bez komórek, zawiesinę komórek apoptotycznych w ilości 5X10^6 komórek na mililitr w pożywce hodowlanej B lub zawiesinę komórek martwiczych w ilości 5X10^6 komórek na ml w pożywce hodowlanej B. Osiągnij stosunek martwych komórek do komórek odpowiadających jeden do jednego, dodając do ml martwych komórek w 5X10^6 komórek na mililitr do a zlewające się 100-milimetrowe naczynie, które zawiera 10X10^6 komórek.Delikatnie zakręć naczyniami. Następnie inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla. Po 30 minutach stymulować komórki reagujące nośnikiem lub 15 nMOL EGF, zgodnie ze wstępnym oznakowaniem szalki hodowlanej.Inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze 5% dwutlenku węgla. Następnie zmyj martwe komórki, dodając pięć milimetrów lodowatego DPBS. Zakręć naczyniem i zasysaj płyn do mycia.Powtórz pranie trzy razy. Następnie natychmiast umieść naczynia komórek reagujących na lód w celu dalszego przetwarzania. Rysunek ten pokazuje, że ekspozycja spoczynkowych osób reagujących na BUNPT na komórki apoptotyczne przez 30 minut silnie hamowała podstawową fosforylację GSK3 alfa beta.Aby zapobiec fizycznej interakcji między osobami reagującymi na BUNPT a komórkami apoptozą, osoby reagujące na BUNPT hodowano w przepuszczalnym systemie nośnym i oddzielono od celów apoptotycznych membraną poliwęglanową o grubości 0,4 mikrona. Zapobieganie fizycznej interakcji między osobami reagującymi na BUNPT a komórkami apoptozy zniosło zdolność celów apoptotycznych do hamowania fosforylacji GSK3 alfa beta. Aby ocenić rolę fagocytozy, zastosowano inhibitor cytoszkieletu Cytochalazynę D, aby zapobiec wychwytowi fagocytarów martwych komórek.Hamowanie fosforylacji GSK3 alfa beta w odpowiedzi na komórki apoptotyczne nastąpiło przy braku fagocytozy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 4-6 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, z wyłączeniem czasu potrzebnego na elektroforezę żelową i immunoblotting. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że użycie zawiesiny komórkowej w przeciwieństwie do rozpuszczalnego liganda jako bodźca stwarza kilka nieodłącznych i w dużej mierze nieuniknionych przeszkód eksperymentalnych.Korzystając z tej samej procedury, można badać inne funkcje komórki, takie jak przeżycie lub proliferacja lub wzrost komórek, w celu określenia funkcjonalnych konsekwencji zdarzeń sygnalizacyjnych, które są indukowane w żywych reagujących komórkach po ich interakcji z pobliskimi martwymi komórkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować określone zdarzenia sygnalizacyjne, które są indukowane w żywotnych komórkach reagujących po ich fizycznej interakcji z pobliskimi martwymi komórkami.

identification-intracellular-signaling-events-induced-viable-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Opracowany jest przepływ pracy wykorzystujący cytometrię przepływową lub wirowanie różnicowe do wykrywania, ilościowego oznaczania i izolowania ciał apoptotycznych z próbki apoptotycznej do wysokiej czystości.

Wykrywanie i izolacja ciał apoptotycznych do wysokiej czystości

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania apoptotycznych tymocytów i makrofagów otrzewnowych oraz analizy skuteczności efferocytozy i specyficznego blokowania apoptotycznych tymocytów za pośrednictwem inhibitorów. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w usuwaniu innych cząstek, w tym sztucznych kulek i bakterii, za pośrednictwem komórek.

Eksperymentalna analiza apoptotycznego pochłaniania tymocytów przez makrofagi

Apoptozę można scharakteryzować za pomocą analizy cytometrycznej wczesnych i późnych biomarkerów apoptozy. Linię komórkową raka szyjki macicy, SiHa, analizowano pod kątem biomarkerów apoptozy po leczeniu aktynomycyną D przy użyciu laboratoryjnego cytometru przepływowego.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów apoptotycznych w komórkach raka szyjki macicy SiHa leczonych aktynomycyną D

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

Odkryj metodę identyfikacji zdarzeń sygnalizacyjnych w żywotnych komórkach BUNPT po interakcji z sąsiednimi komórkami apoptotycznymi. Protokół ten pozwala badać wpływ martwych komórek na żywe sąsiadki w kontekście biologii komórki, patologii i fizjologii.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Przeglądaj więcej filmów