Name: Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj technikę mikroskopii komórkowej do analizy cytokinezy w drożdżach rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe. Metoda umożliwia obserwację zdarzeń czasoprzestrzennych z minimalną toksycznością dla komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe z University of Tennessee oraz TN-SCORE, multidyscyplinarny program badawczy sponsorowany przez NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Hoduj komórki drożdży rozszczepienia wyrażające marker korpusu słupa wrzeciona Sad1-mCherry23 i łańcuch lekki regulatora miozyny typu II Rlc1-Tomato24 w płynnych pożywkach YE w temperaturze 32 °C przez 8 pokoleń. 
	UWAGA: W przypadku mutantów wrażliwych na temperaturę, hoduj komórki w temperaturze 25 °C. Hoduj komórki do połowy fazy logarytmicznej do średnicy zewnętrznej 600 0,5 cala YE. Więcej informacji na temat warunków wzrostu drożdży rozszczepialnych można znaleźć w podręczniku laboratorium drożdży rozszczepieniowych25.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę YE (lub minimalną) z 0,6% agarozy (pożywki na bazie agarozy mają mniej fluorescencyjnego tła w porównaniu z agarem). Do stopionego podłoża dodać 1 mM kwasu askorbinowego (witaminy C). Witamina C tłumi wolne rodniki, które uwalniają się w wyniku fotowybielania, minimalizując w ten sposób fototoksyczność.</li>
	<li>Wlej 3 - 4 ml stopionej pożywki z witaminą C do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem. Niech podłoże ostygnie i zastygnie. 
	UWAGA: Grubość szkła w naczyniu hodowlanym zależy od grubości szkiełka nakrywkowego odpowiedniego dla mikroskopu. Tutaj użyj szkiełka nakrywkowego nr 1.5.</li>
	<li>Delikatnie podnieś zestaloną pożywkę z naczynia hodowlanego za pomocą ostrego skalpela. Umieść końcówkę pipety między płytą pożywki a naczyniem hodowlanym, aby zapobiec ponownemu wpadnięciu płytki do naczynia (Rysunek 1).</li>
	<li>Weź 1 ml świeżo rosnących komórek, jak opisano w 1.1 powyżej. Delikatnie wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 30 s. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w niewielkiej ilości pozostałej pożywki, która pozostaje w probówce po odrzuceniu supernatantu.</li>
	<li>Załadować 2 - 5 μl zawieszonej hodowli komórkowej między płytą pożywki a szklanym dnem naczynia hodowlanego. Komórki powinny znajdować się na szkle. Końcówka pipety umieszczona pomiędzy pożywką a naczyniem umożliwia łatwe załadowanie kultury komórkowej.</li>
	<li>Bardzo delikatnie wyjmij końcówkę pipety i umieść płytę z pożywką z powrotem w jej pierwotnej pozycji na naczyniu hodowlanym. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby delikatnie wyciśnij pęcherzyki powietrza, przesuwając tylną część końcówki pipety na płytę z mediami.</li>
	<li>Pozostaw komórki w naczyniu hodowlanym na 30 minut do jednej godziny w ciemności w temperaturze, w której zostanie przeprowadzona mikroskopia. Jest to ważne, aby zapobiec wstrząsowi spowodowanemu zmianą warunków wzrostu komórek.</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Umieść kroplę oleju na zewnętrznej stronie szklanki na naczyniu hodowlanym. Umieść szalkę hodowlaną na odwróconym mikroskopie.</li>
	<li>Aby zminimalizować autofluorescencję mediów YE, należy zastosować filtr GFP o wąskim zakresie długości fali (520 - 535 nm).</li>
	<li>Skoncentruj się na środkowej płaszczyźnie komórek i upewnij się, że są one dobrze rozmieszczone i niezbyt zatłoczone. Upewnij się, że akwizycja obrazu komórek rozpoczęła się na odpowiednim etapie cyklu komórkowego. W tym eksperymencie śledź komórki z późnego G2.</li>
	<li>Zaprogramuj oprogramowanie do akwizycji obrazów, aby wykonywało obrazy GFP, RFP i DIC komórek.
	<ol>
		<li>W tym eksperymencie użyj czasu naświetlania 100 ms dla DIC i czasu ekspozycji 75 ms dla filtrów GFP i RFP. Czas ekspozycji zależy od ustawień mikroskopu, badanego białka i czasu trwania eksperymentu. Dla podanych ustawień mikroskopu użyj 50% mocy lasera.</li>
		<li>Aby przechwytywać obrazy w 3 wymiarach, zaprogramuj oprogramowanie do akwizycji obrazów do obrazowania w skali Z. Użyj kroku o rozmiarze 0,4 μm i odległości 3,0 μm (połowa całkowitego z) wokół centralnego punktu ostrości komórek. Prowadzi to do uchwycenia 16 klatek Z na punkt czasowy z łączną odległością Z wynoszącą 6 μm. 
		UWAGA: Akwizycja obrazu serii Z umożliwia uchwycenie korpusów biegunów wrzeciona.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rób zdjęcia co 2 minuty. Zmieniaj czas naświetlania zgodnie z wymaganiami eksperymentu. Czas ekspozycji można również zmienić w zależności od interesującego białka i siły sygnału. Należy jednak pamiętać, że krótsze odstępy czasu lub dłuższy czas ekspozycji zwiększają fototoksyczność z powodu bielenia, a zatem komórki można obserwować tylko przez krótki czas.</li>
	<li>Rejestruj obrazy, aż komórki fizycznie się rozdzielą, jak zaobserwowano na obrazach DIC, lub zaprogramuj oprogramowanie tak, aby zatrzymało akwizycję po 90 minutach.</li>
</ol>
3. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Analiza czasowa zdarzeń cytokinetycznych
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, wykonuj projekcje klatek Z dla każdego punktu czasowego. Utwórz różne pliki dla każdej długości fali uzyskanego obrazu.</li>
		<li>Wyeksportuj tę serię punktów czasowych projekcji jako plik .tiff.</li>
		<li>Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ. Otwórz serię obrazów dla dowolnej długości fali.</li>
		<li>Wybierz komórkę, która ma być badana. Kliknij dwukrotnie opcję linii na pasku narzędzi. Spowoduje to otwarcie kolejnego okna, w którym można dostosować szerokość linii. Dostosuj szerokość linii tak, aby odpowiadała szerokości komórki. W przypadku ogniwa WT jest to około 40 - 50 pikseli. Narysuj linię wzdłuż długiej osi interesującej Cię komórki.</li>
		<li>Kliknij Analyze>Tools>ROI manager i kliknij dodaj. Spowoduje to dodanie wybranego wiersza do okna ROI do późniejszego wykorzystania. Nie zamykaj tego okna.</li>
		<li>Kliknij interesujący Cię obraz i wybierz Edycja>Wybór>Wyprostuj. Spowoduje to otwarcie kolejnego okna. Zaznacz "Przetwarzaj cały stos". Spowoduje to wyprostowanie komórki w poziomie.</li>
		<li>Kliknij Obraz>Przekształć>Obróć o 90 stopni w prawo. Ten obraz jest teraz wyprostowany w pionie.</li>
		<li>Kliknij Image>Stacks>Make Montage. Spowoduje to otwarcie okna do przypisania liczby wierszy i kolumn dla stosu, współczynnika skali dla rozmiaru obrazu, pierwszego i ostatniego wycinka (klatki) dla montażu oraz przyrostu klatki dla montażu. Sprawdź plasterki etykiet i naciśnij Enter.</li>
		<li>Gdy pokazane zostanie okno z montażem interesującej Cię komórki, otwórz serię obrazów dla drugiej długości fali.</li>
		<li>Kliknij identyfikator linii w menedżerze ROI. Spowoduje to wybranie tej samej komórki w drugim pliku obrazu. Powtórz kroki 3.1.6 - 3.1.8. Spowoduje to otwarcie montażu drugiego obrazu.</li>
		<li>Na obrazie ze znacznikiem korpusu słupa wrzeciona Sad1-mCherry poszukaj początku separacji znacznika korpusu słupa wrzeciona i oznacz ten punkt czasowy jako czas 0.</li>
		<li>Podążaj za sygnałem Rlc1-Tomato na obrazie w czasie i szukaj sygnału, który pojawia się jako wyraźna linia, a nie plamy Rlc1-Tomato. Ten punkt czasowy oznacza zakończenie montażu pierścienia aktomiozyny/rozpoczęcie fazy dojrzewania.</li>
		<li>Następnie przewiń film w czasie, aby określić, kiedy pierścień Rlc1-Tomato zaczyna się zmniejszać. Jest to oznaczone jako koniec fazy dojrzewania/początek zwężenia pierścienia.</li>
		<li>Podążaj za sygnałem Rlc1-Tomato w czasie przez całe zwężenie, aż pojawi się jako kropka w środku osi komórki. Jest to oznaczone jako koniec zwężenia pierścienia/koniec wnikania przegrody.</li>
		<li>Po montażu obrazów DIC określ ostateczną separację komórek. Zapisz punkt czasowy, w którym komórka fizycznie się rozdziela.</li>
		<li>W przypadku separacji korpusów biegunów wrzeciona zmierz odległość między dwoma korpusami biegunów wrzeciona w czasie za pomocą narzędzia do linii w ImageJ. Wykreśl odległość w korpusie słupa wrzeciona w czasie.</li>
		<li>Zapisz różne punkty czasowe dla różnych zdarzeń cytokinekinetycznych, aby obliczyć czas trwania każdej fazy cytokinetycznej i porównać z separacją korpusu wrzeciona w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza przestrzenna zdarzeń cytokinetycznych
	<ol>
		<li>Wybierz komórkę z widocznym pierścieniem aktomiozyny. Kliknij dwukrotnie opcję linii na pasku narzędzi ImageJ. Spowoduje to otwarcie kolejnego okna, w którym można dostosować szerokość linii. Dostosuj szerokość linii tak, aby odpowiadała grubości pierścienia (15–20 pikseli). Narysuj linię wzdłuż pierścienia, uważając, aby uwzględnić całą grubość pierścienia.</li>
		<li>Kliknij Analyze>Tools>ROI manager i kliknij dodaj. Spowoduje to dodanie wybranego wiersza do okna ROI do późniejszego wykorzystania. Nie zamykaj tego okna.</li>
		<li>Kliknij interesujący Cię obraz i wybierz Edycja>Wybór>Wyprostuj. Spowoduje to otwarcie kolejnego okna. Zaznacz "Przetwarzaj cały stos". Spowoduje to wyprostowanie pierścienia w poziomie.</li>
		<li>Zresetuj intensywność najjaśniejszej płaszczyzny w wyprostowanym stosie z (od 3.1.6) za pomocą opcji Image>Adjust>Brightness/Contrast>Reset.</li>
		<li>Kliknij zakładkę Stk>3D Project. Spowoduje to otwarcie okna dialogowego. Zmień metodę projekcji na Najjaśniejszy punkt, a odstępy między plasterkami na 2 lub 3 piksele. Na koniec zmień oś obrotu na oś X lub Y (zmieni się to w zależności od pożądanego kąta widzenia), kliknij interpoluj i kliknij OK, aby wygenerować projekcję 3D obrazu. Użyj paska przewijania pod obrazem, aby obrócić obraz.</li>
		<li>Otwórz serię obrazów dla drugiej długości fali za pomocą ImageJ.</li>
		<li>Kliknij identyfikator linii w menedżerze ROI. Spowoduje to wybranie tego samego pierścienia w drugim pliku obrazu. Powtórz kroki 4.2.4 i 4.2.5. Spowoduje to otwarcie 3-wymiarowego pierścienia na obrazie z drugą długością fali.</li>
		<li>Po otwarciu obu pierścieni obrazów 3D kliknij Image>Color>Merge Channels. Spowoduje to otwarcie pudełka. Wybierz każdy obraz z menu rozwijanego dla odpowiedniego żądanego koloru i kliknij OK. Spowoduje to otwarcie kompozycji obu obrazów na różnych długościach fal.</li>
		<li>Porównaj lokalizację różnych markerów w odniesieniu do lokalizacji w pierścieniu cytokinetycznym lub błonie wnikającej. Rlc1-GFP jest markerem pierścienia cytokinetycznego. Białka kolokalizujące się z Rlc1-GFP lokalizują się w pierścieniu, podczas gdy białka lokalizujące się za sygnałem Rlc1-GFP lokalizują się w błonie wnikającej. 
		UWAGA: Białko będące przedmiotem zainteresowania musi mieć inny fluorofor niż marker pierścieniowy.</li>
		<li>Generuj 3-wymiarowe pierścienie podczas różnych etapów cytokinezy, aby porównać lokalizację przestrzenną białek przez cały czas cytokinezy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza rozmieszczenia białek w pierścieniu cytokinetycznym
	<ol>
		<li>Aby porównać i przeanalizować rozkład białek wzdłuż pierścienia, zmierz współczynnik wariancji dystrybucji białek. Wysoki współczynnik wariancji wskazuje na nierównomierne rozmieszczenie białek wzdłuż miejsca podziału i sugeruje nieprawidłowe składanie pierścieni, dojrzewanie lub tworzenie przegrody, w zależności od tego, która faza jest obrazowana lub analizowana.</li>
		<li>Korzystając z trójwymiarowego zrekonstruowanego pierścienia cytokinetycznego (z 3.2.2), podzielić obraz na co najmniej 4 ćwiartki tak, aby w każdym kwadrancie pojawiła się jedna czwarta pierścienia. W tym celu użyj narzędzia linia, aby narysować prostopadłe linie na obrazie. Po każdej linii kliknij Obraz>Nakładka>Dodaj zaznaczenie lub użyj skrótu Ctrl+B.</li>
		<li>Przejdź do opcji Analizuj>ustaw pomiar. Wybierz średnią wartość szarości w oknie, które zostanie otwarte. Kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Używając linii narysowanych powyżej jako prowadnic, narysuj prostokąt, aby zdefiniować każdy kwadrant za pomocą narzędzia Prostokąt.</li>
		<li>Aby zmierzyć średnią intensywność każdego kwadrantu, kliknij Analizuj>Zmierz lub użyj skrótu Ctrl+M.</li>
		<li>Zapisz średnią wartość szarości dla wszystkich czterech kwadrantów (MG1-MG 4).</li>
		<li>Zaznacz mały obszar w każdym kwadrancie poza pierścieniem jako zaznaczenie tła.</li>
		<li>Zmierz średnią wartość szarości dla wyboru tła dla wszystkich czterech kwadrantów (BG1-BG 4).</li>
		<li>li>Aby odjąć tło dla każdej ćwiartki, użyj następującego wzoru: MG1-Średnia(BG1:BG4)= Intensywność pierścienia w każdym kwadrancie (IRQ). Na tym etapie dostępne są 4 wartości przerwań, po jednej dla każdego kwadrantu.</li>
		<li>Następnie oblicz współczynnik wariancji dla każdego pierścienia, korzystając z następującego wzoru: Odchylenie standardowe (IRQ1:IRQ4)/Średnia (IRQ1:IRQ4). Oblicz średni współczynnik wariancji dla każdego szczepu i porównaj z innymi szczepami. 
		UWAGA: Statystycznie istotny wzrost współczynnika wariancji w szczepie w porównaniu z grupą kontrolną wskazuje na nierównomierne rozmieszczenie/dostarczanie białka wzdłuż miejsca podziału na tym etapie cytokinezy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+cytokinesis+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanics of cytokinesis in eukaryotes.</a> Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).</li>
<li>Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in eukaryotes.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).</li>
<li>Xu, X., Vogel, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+protein+promotes+cleavage+furrow+maturation+during+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis.</a> Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).</li>
<li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+failure+generating+tetraploids+promotes+tumorigenesis+in+p53-null+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells.</a> Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).</li>
<li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+development+and+disease%3A+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme.</a> Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).</li>
<li>Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+cytokinesis+in+cells+deficient+in+the+breast+cancer+susceptibility+protein+BRCA2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2.</a> Science. 306 (5697), 876-879 (2004).</li>
<li>Storchova, Z., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+polyploidy+to+aneuploidy%2C+genome+instability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).</li>
<li>Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile-ring+assembly+in+fission+yeast+cytokinesis%3A+Recent+advances+and+new+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).</li>
<li>Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+cytokinesis+in+budding+yeast%2C+fission+yeast+and+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells.</a> Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).</li>
<li>Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+turgor+pressure%2C+the+contractile+ring%2C+and+septum+assembly+to+forces+in+cytokinesis+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast.</a> Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).</li>
<li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cell+wall+beta%281%2C3%29glucan+is+required+to+couple+septation+to+actomyosin+ring+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction.</a> J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).</li>
<li>Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+TRAPP-II+Complex+and+the+Exocyst+in+Membrane+Deposition+during+Fission+Yeast+Cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis.</a> PLoS Biol. 14 (4), e1002437(2016).</li>
<li>Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drc1p%2FCps1p%2C+a+1%2C3-beta-glucan+synthase+subunit%2C+is+essential+for+division+septum+assembly+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genetics. 153 (3), 1193-1203 (1999).</li>
<li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%281%2C3%29beta-D-glucan+synthase+subunit+Bgs1p+is+responsible+for+the+fission+yeast+primary+septum+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation.</a> Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).</li>
<li>Cortes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+Paxillin-like+Protein+Pxl1+and+Glucan+Synthase+Bgs1+Is+Essential+for+Actomyosin+Ring+Stability+and+Septum+Formation+in+Fission+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast.</a> PLoS Genet. 11 (7), e1005358(2015).</li>
<li>Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+%281%2C3%29beta-D-glucan+synthase+catalytic+subunit+homologue+Bgs1p%2FCps1p+from+fission+yeast+suggests+that+it+is+involved+in+septation%2C+polarized+growth%2C+mating%2C+spore+wall+formation+and+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination.</a> J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).</li>
<li>Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+localization+of+the+integral+membrane+protein+Cps1p+to+the+cell+division+site+is+dependent+on+the+actomyosin+ring+and+the+septation-inducing+network+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).</li>
<li>Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasma+membrane+flattens+out+to+fuel+cell-surface+growth+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).</li>
<li>Wei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+Spatiotemporal+Activation+Pattern+of+Cdc42+by+Gef1+and+Scd1+Promotes+Different+Events+during+Cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. , (2016).</li>
<li>Nabeshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+centromeres+during+metaphase-anaphase+transition+in+fission+yeast%3A+Dis1+is+implicated+in+force+balance+in+metaphase+bipolar+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle.</a> Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).</li>
<li>Johnson, A. E., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dma1+ubiquitinates+the+SIN+scaffold%2C+Sid4%2C+to+impede+the+mitotic+localization+of+Plo1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase.</a> EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).</li>
<li>Yonetani, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cytokinesis+by+the+formin+cdc12p%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p.</a> Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Fission+Yeast%3A+A+laboratory+Manual%22">Fission Yeast: A laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).</li>
<li>Hachet, O., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1p%2Fanillin+and+the+septation+initiation+network+orchestrate+contractile+ring+assembly+for+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis.</a> Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contractile+ring+coordinates+curvature-dependent+septum+assembly+during+fission+yeast+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis.</a> Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-level+investigation+of+the+structure%2C+transformation%2C+and+bioactivity+of+single+living+fission+yeast+cells+by+time-+and+space-resolved+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy.</a> Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).</li>
<li>Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li>
<li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj opisaliśmy protokół badania zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepienia w sposób czasowy. Opisany tutaj protokół zapewnia czasowe rozwiązanie różnych zdarzeń cytokinetycznych w odniesieniu do siebie; czas rekrutacji lub utraty białka w odniesieniu do fazy cytokinetycznej; struktura pierścienia w różnych fazach cytokinezy; oraz progresja cytokinezy w odniesieniu do mitozy. Dzięki temu protokołowi możliwe jest precyzyjne zdefiniowanie fazy cytokinetycznej, która może być zmieniona w różnych mutantach, zapewni...

Cytokineza, ostatni etap podziału komórki, jest złożonym procesem niezbędnym do prawidłowego różnicowania, rozwoju i przetrwania organizmu. Cytokineza obejmuje wiele zdarzeń, które są organizowane w celu zapewnienia pomyślnej separacji komórek przy jednoczesnym zachowaniu integralności genomu1. Cytokineza obejmuje zdarzenia, w których pierścień aktomiozyny po złożeniu ulega zwężeniu, co jest równoczesne z rozszerzaniem się błony i bruzdowaniem oraz przebudową zewnątrzkomórkowej macierzy komórkowej, po której następuje odcięcie komórki1,2,3. Niewłaściwa organizacja zdarzeń cytokinetycznych może prowadzić do separacji komórek i wad ploidalności, a także może powodować choroby takie jak rak4,5,6,7,8. Podstawowe zasady, które umożliwiają organizację zdarzeń cytokinetycznych nie są dobrze poznane, co prowadzi do przeszkód w naszym zrozumieniu etiologii tych chorób.
Drożdże rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) to doskonały system modelowy do badania cytokinezy ze względu na konserwatywną naturę zaangażowanych białek1. W drożdżach rozszczepialnych, po złożeniu pierścienia aktomiozyny, pierścień wchodzi w fazę dojrzewania/przebywania, w której nie zwęża się9. Dojrzewanie kończy się rozpoczęciem zwężenia pierścienia aktomiozyny, któremu towarzyszy bruzdowanie błony i wnikanie przegrody. Przełomowe prace na przestrzeni lat dały nam dość dobre zrozumienie tworzenia pierścieni aktomiozyny w drożdżach rozszczepieniowych1,9,10. U niektórych eukariontów, w tym drożdży rozszczepialnych, pomyślne złożenie pierścienia aktomiozyny nie jest wystarczające do bruzdowania błony. W drożdżach rozszczepieniowych samo zwężenie pierścienia nie zapewnia wystarczającej siły, aby pokonać wewnętrzne ciśnienie turgoru w celu tworzenia bruzd11. Niedawny model wskazuje, że siła ta jest zamiast tego dostarczana przez wnikanie przegrody nośnej11. W innym modelu zasugerowano, że rola rozszerzenia błony plazmatycznej przyczynia się do tworzenia bruzd12,13. Zwężenie pierścienia i bruzdowanie błony nie występują w wrażliwym na temperaturę mutancie cps1-191 Bgs1/Cps1, głównym enzymie powodującym pierwotne tworzenie przegrody14,15. Komórki pozbawione Bgs1 wykazują wadliwą przegrodę pierwotną i przedłużone zwężenie pierścienia15,16. Bgs1 jest rekrutowany do miejsca podziału komórki w celu wniknięcia przegrody podczas dojrzewania po złożeniu pierścienia aktomiozyny17,18. Podobnie, podczas celularyzacji w zarodkach Drosophila, zwężenie pierścienia jest dwufazowe ze znacznie powolnym początkowym tempem zwężania19, przypominając fazę dojrzewania obserwowaną u drożdży rozszczepialnych. Dwufazowe zwężenie pierścienia może spowolnić bruzdowanie błony, aby umożliwić wystarczające rozszerzenie błony20 i modyfikację macierzy zewnątrzkomórkowej. Sugeruje to, że po złożeniu pierścienia aktomiozyny zwężenie pierścienia zachodzi skutecznie tylko wtedy, gdy komórka spełniła wymagania dotyczące tworzenia bruzdy. Nie wiadomo dobrze, jakie warunki są wymagane do zwężenia pierścienia aktomiozyny po złożeniu pierścienia, ani jakie zdarzenia molekularne regulują ten proces. Niedawno wykazaliśmy, że po złożeniu pierścienia aktomiozyny mała GTPaza Cdc42 ulega unikalnemu wzorcowi aktywacji czasoprzestrzennej21. Wzorzec ten jest ustalany przez unikalny wzorzec lokalizacji czynników wymiany nukleotydów guanidyny (GEF) Cdc42, które aktywują Cdc42. GEF Gef1 lokalizuje się w zmontowanym pierścieniu aktomiozyny i sprzyja wystąpieniu zwężenia pierścienia i wniknięciu przegrody, podczas gdy Scd1 lokalizuje się w błonie bruzdowej i sprzyja prawidłowemu tworzeniu przegrody. Odkryliśmy, że wzorzec aktywacji Cdc42 ustalony przez jego GEF prowadzi do regulacji różnych zdarzeń cytokinetycznych.
Aby zrozumieć molekularny mechanizm zdarzeń, które ostatecznie prowadzą do separacji komórek po złożeniu pierścienia aktomiozyny, należy śledzić różne zdarzenia cytokinetyczne w czasie i przestrzeni. W drożdżach rozszczepieniowych cytokineza najpierw polega na gromadzeniu węzłów prekursorowych wokół jądra, które ostatecznie rekrutują miozynę typu II, forminę Cdc12 i inne białka wymagane do składania pierścieni aktomiozyny. Aby określić czas różnych zdarzeń cytokinetycznych i zapewnić układ odniesienia, separacja znaczników korpusu bieguna wrzeciona (formacja wrzeciona) jest traktowana jako czas 022. Składanie pierścienia aktomiozyny można śledzić poprzez monitorowanie w czasie intensywności znakowanego fluorescencyjnie białka pierścieniowego aktomiozyny, takiego jak regulatorowy łańcuch lekki miozyny typu II Rlc1. Tutaj opisujemy mikroskopowe podejście do analizy różnych etapów cytokinezy w czasie.

<table><tbody><tr><td>Pożywka z ekstraktem drożdżowym</td><td>Sunrise Science Products</td><td>YES 225</td><td>0,5% w/v ekstraktu drożdżowego, 3% w/v glukozy, 225mg/L adenina, histydyna, leucyna, uracyl i lizyna</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>SeaKem LE agaroza, Lonza</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Zastosowano szkiełko nakrywkowe nr 1,5. Będzie się to różnić w zależności od zastosowanych specyfikacji mikroskopu.&nbsp;</td></tr>System laserowej <tr><td>skaningowej mikroskopii konfokalnej VT-Hawk 2D</td><td>Visitech International, Wielka Brytania</td><td></td><td>z mikroskopem odwróconym Olympus IX-83 z obiektywem UAPO 100X / apertura numeryczna 1,49 (Olympus) i kamerą cyfrową EM-CCD (Hamamatsu).&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr></tbody></table>

analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokineza, ostatni etap podziału komórki jest kluczowy dla utrzymania integralności genomu. Prawidłowa cytokineza jest ważna dla różnicowania i rozwoju komórek. Cytokineza obejmuje serię zdarzeń, które są dobrze skoordynowane w czasie i przestrzeni. Cytokineza polega na wytworzeniu pierścienia aktomiozyny w miejscu podziału, a następnie na zwężeniu pierścienia, tworzeniu bruzd błonowych i przebudowie macierzy zewnątrzkomórkowej. Drożdże rozszczepieniowe, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) to dobrze zbadany system modelowy, który ujawnił z dużą jasnością początkowe zdarzenia w cytokinezie. Nie rozumiemy jednak dokładnie, w jaki sposób różne zdarzenia cytokinetyczne są koordynowane czasoprzestrzennie. Aby to ustalić, należy bardzo szczegółowo przeanalizować różne zdarzenia cytokinetyczne zarówno w czasie, jak i w przestrzeni. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do badania różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach. Dzięki takiemu podejściu możliwe jest określenie czasu różnych zdarzeń cytokinetycznych i określenie czasu rekrutacji różnych białek podczas cytokinezy. Ponadto opisujemy protokoły porównujące lokalizację i dystrybucję białek w miejscu podziału komórki. Jest to podstawowy protokół do badania cytokinezy w drożdżach rozszczepieniowych i może być również stosowany do innych drożdży i systemów grzybowych.

komórki drożdży szczapowych wyrażające marker pierścienia, Rlc1-GFP (zielony, Rysunek 2) oraz marker ciałka bieguna wrzeciona Sad1-mCherry (czerwony, Rysunek 2) obrazowano podczas cytokinezy. Pojawienie się markera ciała bieguna wrzeciona (biała strzałka, Rysunki 2A, B) uznaje się za czas 0. Sygnał Rlc1-GFP pojawia się w czasie -4 min w odniesieniu do rozdzielenia ciałek biegunowych wrzeciona (czerwona strzałka, rys. 2A, 2B). Sygnał Rlc1-...

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

Ogólnym celem tej techniki mikroskopii żywych komórek jest badanie zdarzeń czasoprzestrzennych zachodzących podczas cytokinezy w modelowym systemie drożdży rozdzielnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie cytokinezy, takie jak molekularne szczegóły poszczególnych etapów cytokinezy w czasie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość analizy różnych komponentów przestrzennych aparatu cytokinetycznego przez długie okresy czasu przy minimalnej toksyczności dla komórek.Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w cyto विदेशkinezę i drożdże szczelinowe, może ona zostać zastosowana również w przypadku drożdży pączkujących i innych grzybów. Aby rozpocząć tę procedurę, wlej od trzech do czterech mililitrów roztopionej pożywki z dodatkiem witaminy C na szalkę Petriego z szklanym dnem. Po zastygnięciu pożywki, za pomocą ostrego skalpela ostrożnie podnieś blok pożywki z szalki, a następnie umieść końcówkę pipety pomiędzy blokiem a szalką, aby zapobiec opadnięciu bloku z powrotem do naczynia.Następnie nanieś od 2 do 5 µL zawiesiny hodowli komórkowej pomiędzy płytkę z medium a szklane dno naczynia hodowlanego. Następnie bardzo delikatnie wyjmij końcówkę pipety

spatiotemporal-analysis-of-cytokinetic-events-in-fission-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół do oceny dynamiki powstawania wrzeciona i progresji mitotycznej. Nasze zastosowanie obrazowania poklatkowego umożliwia użytkownikowi identyfikację komórek na różnych etapach mitozy, śledzenie i identyfikację defektów mitotycznych oraz analizę dynamiki wrzeciona i losu komórek mitotycznych po ekspozycji na leki antymitotyczne.

Obrazowanie żywych komórek w celu oceny dynamiki czasu metafazy i losu komórki po perturbacjach wrzeciona mitotycznego

Mikroskopia poklatkowa jest cennym narzędziem do badania mejozy u pączkujących drożdży. Protokół ten opisuje metodę, która łączy synchronizację cyklu komórkowego, mikroskopię poklatkową i warunkowe wyczerpanie białka docelowego, aby zademonstrować, jak badać funkcję określonego białka podczas segregacji chromosomów mejotycznych.

Zastosowanie mikroskopii poklatkowej i specyficznego dla etapu zubożenia komórek białek do badania mejozy u S. cerevisiae

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj technikę mikroskopii komórkowej do analizy cytokinezy w drożdżach rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe. Metoda umożliwia obserwację zdarzeń czasoprzestrzennych z minimalną toksycznością dla komórek.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Przeglądaj więcej filmów