Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie znakowanych fluorescencyjnie pojedynczych komórek z żywych całych siatek siatkówkowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii. Na przykład, ile istnieje podtypów danej klasy neuronów i jakie są markery genetyczne dla każdego podtypu?

Główną zaletą tej techniki jest to, że rezygnujemy z konieczności dysocjacji tkanki siatkówki, co pozwala komórkom przetrwać w zdrowszym środowisku przed izolacją. Implikacje tej techniki rozciągają się na każdą fluorescencyjnie znakowaną populację komórek, a zatem mogą być stosowane w innych systemach w celu zrozumienia różnorodności komórkowej i funkcji w zdrowiu i chorobie. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ technika ta opiera się na zdolności badacza do zaciśnięcia łatki na komórce bez uszczerbku dla żywotności komórki.

Przyszła demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji RNA mogą być trudne do nauczenia, ponieważ niewielka ilość RNA może łatwo ulec degradacji, jeśli nie zostanie odpowiednio i szybko obsłużona. Aby rozpocząć tę procedurę, przebij rogówkę igłą i odetnij ją na granicy rogówki i twardówki. Następnie zdejmij soczewkę za pomocą kleszczy.

Delikatnie rozerwij twardówkę i przeetnij nerw wzrokowy, w którym spotykają się siatkówka i twardówka. Ostrożnie zakończ usuwanie twardówki z siatkówki. Następnie usuń przezroczyste ciało szkliste.

Przekrój siatkówki na pół i przechowuj je w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Gdy tkanka będzie gotowa do zamontowania w komorze rejestrującej, przenieś kawałek siatkówki do roztworu enzymu, rozcieńczonego w 500 mikrolitrach natlenionego roztworu zewnątrzkomórkowego na szalce Petriego i inkubuj go przez dwie minuty w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Następnie umyj siatkówkę w natlenionym roztworze zewnątrzkomórkowym i przenieś ją do komory rejestracyjnej ze szklanym dnem za pomocą plastikowej pipety transferowej.

Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie spłaszcz tkankę z warstwą fotoreceptorów skierowaną w dół. Usuń nadmiar płynu za pomocą pipety i zakotwicz tkankę za pomocą platynowego pierścienia z nylonową siatką. Następnie napełnij komorę natleniznym roztworem zewnątrzkomórkowym i zamontuj go na stoliku mikroskopowym.

Perfuzjuj tkankę natleniznym roztworem zewnątrzkomórkowym z prędkością od dwóch do czterech mililitrów na minutę. Aby przygotować się do tej procedury, należy przebić kilka szklanych mikropipet do zapisów elektrofizjologicznych za pomocą ściągacza do mikropipet. Obserwuj warstwę komórek zwojowych za pomocą optyki IR-DIC.

Następnie zidentyfikuj GFP plus komórki zwojowe za pomocą epifluorescencji na około 480 nanometrach. Następnie zlokalizuj pipetę wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym w DIC. Zastosuj lekkie nadciśnienie i wyzeruj wszelkie przesunięcia napięcia na amplifier.

Następnie opuść szklaną mikropipetę na dodatnią komórkę GFP i zastosuj kroki polecenia napięcia testowego, aby monitorować rezystancję uszczelnienia. Podciśnienie powinno utworzyć gigaomowe uszczelnienie między pipetą a błoną komórkową. Po utworzeniu stabilnego uszczelnienia rozerwij membranę, stosując krótkie impulsy podciśnienia, aby uzyskać dostęp do całej komórki.

Odczekaj jedną do dwóch minut, aż dendryty komórki wypełnią się fluorescencyjnym znacznikiem. Na tym etapie ostrożnie wyekstrahuj zawartość cytoplazmatyczną komórki do pipety, stosując podciśnienie za pomocą dziesięciomililitrowej strzykawki. W międzyczasie monitoruj ekstrakcję w DIC, wizualizując zmniejszający się rozmiar ciała komórki.

Po wyekstrahowaniu zawartości cytoplazmatycznej ostrożnie zdejmij pipetę z tkanki i szybko wyjmij pipetę z roztworu. Następnie szybko wyjmij pipetę z uchwytu głowicy i krótko przepłucz końcówkę pipety H2O nasączony DEPC. Następnie podłącz pipetę do strzykawki o pojemności jednego mililitra za pomocą ciasno dopasowanej rurki.

Natychmiast wyrzuć komórki do dziesięciu mikrolitrów buforu do lizy, jeden w 0,2 mililitrowych probówkach PCR. Krótko odwirować probówki w mini wirówce stołowej o temperaturze 2000 razy g przez dziesięć sekund. Następnie natychmiast zamrozić próbki na suchym lodzie na pięć minut.

Po zamrożeniu przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni, aby uzyskać najlepsze rezultaty. Aby przygotować się do tej procedury, ustaw separator magnetyczny, przyklejając górną część odwróconego uchwytu końcówki P20 lub P200 do 96-dołkowego stojaka magnetycznego. Następnie przygotuj świeży 70% etanol w ilości około jednego mililitra na próbkę.

Usuń kulki magnetyczne RNA z magazynu o temperaturze 4 stopni C i rozmroź je w temperaturze pokojowej. Gdy kulki RNA osiągną temperaturę pokojową, wiruj je przez 30 sekund, aby upewnić się, że roztwór jest dobrze wymieszany. Następnie rozmrażaj komórki w temperaturze pokojowej przez jedną minutę.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów H2O wolnego od Rnazy do każdej próbki i pipetuj w górę iw dół. Następnie dodaj 22 mikrolitry kulek RNA do każdej probówki i dokładnie wymieszaj. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby umożliwić RNA interakcję i związanie się z kulkami magnetycznymi.

Następnie umieść probówki na separatorze magnetycznym na osiem minut. Przed kontynuowaniem upewnij się, że supernatant jest czysty. Obserwuj kulki z jednej palety i pamiętaj, aby nie odczepić jej od boku rurki podczas pipetowania.

Usunąć supernatant z próbek i dodać 150 mikrolitrów 70% etanolu. Następnie usuń etanol i powtórz pranie jeszcze dwa razy. Pozostawić próbki do wyschnięcia na powietrzu przez sześć minut.

Sprawdzaj co jakiś czas, czy na dnie rurki zebrało się więcej etanolu i odpowiednio go usuń. Pamiętaj, że bardzo ważne jest odpowiednie wysuszenie koralików. Jeśli kulki nie są wystarczająco suche, etanol może być przenoszony wraz z eluentem i zmniejszy całkowitą wydajność, podczas gdy nadmiernie wysuszone kulki mogą spowodować utratę RNA.

Podczas suszenia próbek należy przygotować 10-krotny bufor reakcyjny, łącząc 19 mikrolitrów drugiego buforu do lizy i jeden mikrolitr inhibitora Rnazy. Krótko go obróć i trzymaj na lodzie. Gdy próbki wyschną, a granulki perełek nie będą już błyszczące, wyjmij probówki z separatora magnetycznego i dodaj 9,5 mikrolitra H2O wolnego od Rnazy, aby ponownie uwodnić próbki.

Następnie umieść próbki na lodzie i dodaj jeden mikrolitr 10x buforu reakcyjnego do każdej próbki. Zdjęcie przedstawia warstwę komórek zwojowych siatkówki, uwidocznioną za pomocą IR-DIC w całym przygotowaniu siatkówki. Ten sam preparat został zwizualizowany w epifluorescencji na około 480 nanometrach w celu identyfikacji komórek zwojowych GFP dodatnich.

Ten obraz przedstawia komórkę dodatnią GFP, która została przeznaczona do nagrywania metodą patch-clamp i wypełniona znacznikiem fluorescencyjnym. Konfokalny obraz dendrytów ipRGC zobrazowany w wewnętrznej warstwie splotu i włączonej i wyłączonej pozwala na klasyfikację tych typów komórek To wyjście bioanalizatora pokazuje przykłady bibliotek, które przeszły odwrotną transkrypcję, amplifikację i oczyszczanie. Pasy od pierwszego do trzeciego pokazują idealne rozmazy DNA, podczas gdy pas czwarty reprezentuje słabo przetworzoną próbkę.

Pas kontrolny powinien zawierać dwa czyste piki o rozmiarach znaczników 35 pz i 10380 pz. Oto szczegółowy ślad jednej z pomyślnie przygotowanych bibliotek o dużej intensywności około 2 kb. Ten ślad również świadczy o udanym przygotowaniu, ale z rozmazem wyśrodkowanym wokół 500 pz.

Ten obraz przedstawia dane wyjściowe bioanalizatora po znakowaniu, amplifikacji i oczyszczaniu próbek. Szczegółowy ślad pomyślnie oznaczonej próbki można zobaczyć tutaj, odpowiadający próbce na pierwszym pasie. Niepełne oznakowanie spowoduje powstanie śladu, takiego jak ten widoczny tutaj, co uzasadnia ponowne oznakowanie ze świeżym rozcieńczeniem.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować RNA z fluorescencyjnie znakowanych typów komórek w nienaruszonej siatkówce. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że RNA jest bardzo wrażliwe na degradację i kluczem jest posiadanie zdrowych komórek siatkówki. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak qPCR, hybrydyzacja NC2 lub immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy zidentyfikowane geny są specyficzne dla danego podtypu komórkowego. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuronauki, próbującym zrozumieć heterogeniczność neuronów w różnych obszarach mózgu. Zrozumienie tej heterogeniczności pozwoli na przyszłe badania funkcji komórkowych i łączności w populacjach zidentyfikowanych molekularnie.