Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Ogólnym celem tej procedury jest pobranie komórkowej i bezkomórkowej zawartości światła płuc za pomocą płukania oskrzeli w celu przeprowadzenia analiz ex vivo i oceny trwającego stanu chorobowego zwierzęcia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii układu oddechowego dotyczące mechanizmów immunologicznych wywołanych infekcją i stanem zapalnym poprzez ilościowe określenie wrodzonych odpowiedzi komórkowych i humoralnych w płucach. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest prosta, wydajna i wysoce powtarzalna oraz nie ma potrzeby stosowania specjalnego sprzętu ani narzędzi.

Przed rozpoczęciem zabiegu należy utworzyć cewnik, wkładając igłę o rozmiarze 23 do 0,5-centymetrowego kawałka przezroczystej rurki z tworzywa sztucznego z polietylenu o rozmiarze 21 i umieścić zwierzę w pozycji leżącej. Zabezpiecz kończyny myszy i zdezynfekuj szyję 70% etanolem. Następnie za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry w pobliżu tchawicy.

Otwórz skórę, aby odsłonić gruczoły ślinowe i użyj kleszczy, aby oddzielić gruczoły i odsłonić mięsień gnykowy mostka. Użyj kleszczy, aby naciąć mięsień wokół tchawicy. Gdy jest widoczny, użyj kleszczy, aby przewlec bawełniany szew pod tkankę tchawicy.

Następnie za pomocą igły o rozmiarze 26 ostrożnie nakłuj środek tchawicy między dwoma pierścieniami chrząstki i wprowadź gotowy cewnik na około 0,5 centymetra do światła tchawicy. Ustabilizuj cewnik za pomocą szwu. Następnie załaduj strzykawkę o pojemności jednego mililitra z jednym mililitrem sterylnego zbilansowanego roztworu soli uzupełnionego 100 mikromolowym EDTA.

Podłączyć załadowaną strzykawkę do cewnika i delikatnie wstrzyknąć zbilansowany roztwór soli i EDTA do płuc. Po wstrzyknięciu całej soli fizjologicznej delikatnie odessać roztwór, masując klatkę piersiową. Bardzo ważne jest, aby zachować delikatność podczas wstrzykiwania i ponownego pobierania płynu w postaci stałej, aby zmaksymalizować pobieranie płynu BAL i zminimalizować siły tnące.

Jeśli płyn w stanie stałym przejdzie przez nos, ponownie zabezpiecz szew wzdłuż cewnika. Po zebraniu całego aspiratu przenieś płyn do 15-mililitrowej rurki na lodzie i powtórz płukanie jeszcze dwa razy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po trzecim pobraniu płukania oskrzelowo-pęcherzykowego odwirować zbiorczy aspirat i przechowywać supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach buforu do lizy ACK. Po nie więcej niż dwóch minutach w temperaturze pokojowej rozcieńczyć bufor do lizy jednym mililitrem zimnego PBS i zebrać komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości PBS dla liczby próbek do analizy i podzielić komórki na odpowiednią liczbę dołków na płytce 96-dołkowej w celu analizy. Zebrać komórki przez kolejne odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach FC Block i PBS. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej dodaj 50 mikrolitrów odpowiedniego koktajlu przeciwciał do każdej studzienki i inkubuj komórki przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem.

Pod koniec inkubacji odwirować płytkę i odrzucić supernatant, ponownie zawieszając granulki do końcowej objętości 200 mikrolitrów buforu FAX na studzienkę do analizy cytometrycznej przepływowej. Stosując strategię bramkowania opartą na zróżnicowanej ekspresji antygenów na powierzchniach różnych populacji komórek popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, możliwe jest zidentyfikowanie różnych typów komórek odpornościowych. Komórki i podkoszulki są bramkowane zgodnie z ich właściwościami rozpraszania do przodu i z boku.

Żywe / martwe komórki barwnikowo-ujemne są bramkowane, a następnie następuje identyfikacja komórek Cd11c High i Cd11c Low. W populacji Cd11c High makrofagi i komórki dendrytyczne można zidentyfikować na podstawie ich ekspresji odpowiednio MHC-II i SinglecF. W populacji Cd11c Low limfocyty T i limfocyty B można zidentyfikować na podstawie ich odpowiedniej ekspresji CD3 / CD19 i MHC-II.

W pozostałych komórkach eozynofile i neutrofile można zidentyfikować odpowiednio na podstawie ekspresji markera Cd11b lub Ly-6G. Można również dodać kulki zliczające, aby określić bezwzględną liczbę komórek w różnych populacjach komórek, porównując stosunek zdarzeń koralików do komórek, na przykład u zwierząt naiwnych i stymulowanych LPS. Po pobraniu płynu BAL można wykonać inne techniki, takie jak układ kulek cytokin immunoblot ELISA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące bezkomórkowej zawartości płynu BAL.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią do badania zawartości komórkowej i bezkomórkowej światła płuc myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie i powtarzalnie wykonywać BAL.