Name: Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego do ilościowej oceny neurozapalenia w modelu choroby Parkinsona u myszy po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny. Technika umożliwia nieinwazyjny monitoring zapalenia układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Oldze Sharmie, Theresie Hundt oraz personelowi DZNE Microscopy and Animal Facilities za wsparcie techniczne.

Wszystkie procedury, w tym dotyczące zwierząt, zostały przeprowadzone za zgodą komitetu ochrony zwierząt Krajowej Agencji Ochrony Środowiska Nadrenii Północnej-Westfalii (LANUV). Zwierzęta były trzymane w pomieszczeniach i opiekowane zgodnie ze standardowymi warunkami z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność oraz swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
1. Model zwierzęcy
<ol>
	<li>Krzyżuj hemizygotyczne myszy Tg(Gfap-luc+/-) z hemizygotycznymi myszami Tg(M83+/-) w celu wygenerowania hemizygotycznych bigenicznych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) class<="xref">15,16.</li>
	<li>Genotyp potomstwa za pomocą PCR w czasie rzeczywistym pod kątem obecności transgenu kodującego ludzką alfa-synukleinę oraz za pomocą standardowego PCR dla lucyferazy świetlika12,17.</li>
	<li>Zaszczepić zwierzęta w wieku od sześciu do ośmiu tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum
<ol>
	<li>Przygotować monomeryczną rekombinowaną ludzką alfa-synukleinę z mutacją A53T w buforze soli fizjologicznej buforowanym trisem (TBS) zawierającym 150 mM NaCl w 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), jak opisano wcześniej14.</li>
	<li>Przygotować fibrylarną alfa-synukleinę do inokulacji, mieszając 3 μg/μl monomerycznej rekombinowanej ludzkiej alfa-synukleiny w wytrząsarce orbitalnej przy 800 obr./min i temperaturze 37 °C przez 5 dni.</li>
	<li>Rozcieńczyć zespoły fibryli w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μg/μl w przypadku inokulacji dootrzewnowej lub 2 μg/μl w przypadku inokulacji dojęzykowej.</li>
	<li>Fragmentuj fibryle alfa-synukleiny za pomocą sonikatora pręcikowego przez 1 minutę (40 impulsów o czasie trwania 0,5 s z jednosekundową przerwą między każdym impulsem i amplitudą ustawioną na 50%) na lodzie. Aby uniknąć zanieczyszczenia przez siew krzyżowy. Użyj czystych sond sonicznych, aby przygotować różne inokulum.</li>
</ol>
3. Iniekcje dojęzykowe.
<ol>
	<li>Znieczulenie zwierząt za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Użyj maści weterynaryjnej na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Ostrożnie przymocuj narkotyzowane zwierzęta taśmą klejącą do płyty grzewczej w pozycji leżącej grzbietowej, z głowami skierowanymi w stronę badacza.</li>
	<li>Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 5 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.</li>
	<li>Użyj jednego kleszczyka do kciuka z nosem i ząbkowanymi końcówkami, aby przytrzymać usta zwierzęcia otwarte, a drugiej mniejszej pary kleszczy, aby ostrożnie wyciągnąć język, aby dolna strona języka była dostępna do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wstrzyknąć igłę strzykawki w prawą lub lewą dolną stronę języka, w pobliżu nerwu podjęzykowego. Powoli wstrzyknąć inokulum po 5 sekundach. Powoli wycofaj igłę po 5 sekundach, aby upewnić się, że inokulum wniknęło w tkankę i nie zostało utracone podczas cofania igły.</li>
	<li>Uwolnij zwierzę z fiksacji i pozostaw je na płycie grzewczej pod stałym nadzorem aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
</ol>
4. Iniekcje dootrzewnowe
<ol>
	<li>W przypadku wstrzyknięć dootrzewnowych należy krótko narkotyzować zwierzęta w komorze anestezjologicznej poprzez inhalację izofluranem/tlenem, przy natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 50 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.</li>
	<li>Należy wstrzykiwać bezpośrednio do otrzewnej myszy i unikać przenikania do jelita cienkiego lub jelita ślepego znajdującego się za ścianą jamy brzusznej, trzymając zwierzę w pozycji grzbietowej z głową skierowaną w kierunku przeciwnym do badacza i w dół pod kątem około 45°. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia.</li>
</ol>
5. Obrazowanie bioluminescencyjne
<ol>
	<li>Obraz Tg (M83 +/-: Gfap-luc +/-) myszy co 2-4 tygodnie przy użyciu systemu obrazowania bioluminescencyjnego.</li>
	<li>Przed obrazowaniem należy krótko znieczulić myszy w komorze izofluranowo-tlenowej o natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Ogol i wypiluj głowy myszy kremem do depilacji. Pokoloruj uszy na czarno niedrażniącym markerem, aby zablokować niespecyficzną bioluminescencję.</li>
	<li>Rozcieńczyć sól potasową D-lucyferyny, substrat lucyferazy, w PBS do roztworu podstawowego o stężeniu 30 mg/ml. Przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Chronić rozpuszczoną D-lucyferynę przed ekspozycją na światło.</li>
	<li>Zważyć zwierzęta przed wstrzyknięciem. Oblicz dokładną objętość D-lucyferyny do wstrzyknięcia 150 mg/kg masy ciała. Dootrzewnowo wstrzyknąć D-lucyferynę i zwrócić zwierzę do komory anestezjologicznej.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Gdy system obrazowania osiągnie temperaturę roboczą, zainicjuj go, klikając przycisk "Zainicjuj" na panelu sterowania.</li>
	<li>Wybierz przyciski "Luminescencyjny" i "Fotografia". Ustaw czas ekspozycji na 60 s, binning na "Średni", przysłonę przysłony na "1", a wzmocnienie EM na "Wył.".</li>
	<li>Upewnij się, że filtr wzbudzenia jest ustawiony na "Blok", a filtr emisji na "Otwarty" i ustaw wysokość obiektu na 1.50 cm.</li>
	<li>Dziesięć minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny umieść zwierzęta na płycie grzewczej w komorze obrazowania i upewnij się, że ich pyski są prawidłowo umieszczone w wylocie znieczulenia. Zamknąć przepływ izofluranu/tlenu z komory inhalacyjnej i otworzyć przepływ do komory obrazowania o natężeniu przepływu 0,25 l/min i parowaniu 2%. Prawidłowo zamknij drzwiczki komory obrazowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Pobierz", aby zmierzyć bioluminescencję, która trwa 60 s. Zatrzymaj przepływ izofluranu i monitoruj zwierzęta do momentu, aż całkowicie wyzdrowieją po powrocie do klatek.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo bioluminescencję. W "Palecie narzędzi" wybierz "Narzędzia ROI". W sekcji "Typ" w "Narzędziach ROI" wybierz "Pomiar ROI".</li>
	<li>W "Narzędziach ROI" kliknij narzędzie "kółko" i wybierz liczbę ROI do narysowania z menu rozwijanego – najlepiej "3" dla trzech myszy.</li>
	<li>Na obrazie kliknij prawym przyciskiem myszy każdy ROI i w sekcji "Właściwości" dostosuj szerokość i wysokość do 1,25 cm. Umieść każdy ROI nad obszarem mózgu, który jest określany ilościowo.</li>
	<li>W lewym górnym rogu obrazu ustaw panel jednostek na "promieniowanie (fotony)".</li>
	<li>W "Palecie narzędzi" wybierz "Dostosuj obraz" i dostosuj minimum i maksimum "Skali kolorów", na przykład od 0,20e6 do 1,00e6.</li>
	<li>W sekcji "Plik" zapisz dane za pomocą opcji "Zapisz".</li>
</ol>
6. Analiza biochemiczna
<ol>
	<li>Odizoluj mózg i rdzeń kręgowy zgodnie z ustalonymi protokołami18,19.</li>
	<li>Homogenizować próbki całego mózgu i całego rdzenia kręgowego oddzielnie w PBS w obecności inhibitorów proteazy i fosfatazy (rozcieńczonych do 1x w PBS) w dwóch cyklach 30-sekundowych z prędkością 6,000 obr./min w homogenizatorze tkankowym. Upewnij się, że próbki mózgu i rdzenia kręgowego są homogenizowane do końcowego stężenia 20% (wag./obj.).</li>
	<li>Dwukrotnie poddaj próbki działaniu sonikacji, utrzymując je na lodzie ze stałym impulsem 10 s i amplitudą ustawioną na 50%.</li>
	<li>Dostosuj homogenaty do 10% w PBS i 750 mM NaCl, rozcieńczając je 1:1 z 1,5 M NaCl w PBS.</li>
	<li>Aby oddzielić resztki komórkowe, odwirować homogenaty w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zachowaj supernatanty do następnych kroków i wyrzuć granulki.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w homogenatach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować 1,0 mg białka całkowitego z homogenatów mózgu lub 0,8 mg z homogenatów rdzenia kręgowego w N-laurylosarkozylu w końcowym stężeniu 10% (wag./obj.) przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Nałożyć homogenaty na 3 ml poduszki z sacharozą o stężeniu 10% (wag./obj.) w wodzie destylowanej i ultraodwirować je w temperaturze 465 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić granulki w buforze zawierającym 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 2% β-merkaptoetanolu, 192 mM glicyny, 25 mM trisu i 5% (wag./obj.) sacharozy.</li>
	<li>Gotować próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut i umieścić je w żelach poliakryloamidowych SDS do elektroforezy w układzie buforowym kwasu morfolinowo-etanosulfonowego (MES).</li>
	<li>Przenieść oddzielone białka do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) w systemie półsuchym.</li>
	<li>Inkubować błony w 0,4% (obj./obj.) roztworze formaliny w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wirniku z prędkością 35 obr./min, aby usieciować białka z błoną.</li>
	<li>Zablokuj membrany w buforze TBS zawierającym 0,05% (obj./obj.) mleka Tween 20 i 5% (wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować bloty z pierwszorzędowym przeciwciałem w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć błony trzykrotnie w buforze TBS i inkubować je z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą lub fluoroforem w TBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wizualizacja związanych przeciwciał drugorzędowych za pomocą chemiluminescencji lub fluorescencji zgodnie z ustalonymi protokołami20.</li>
</ol>
7. Analiza immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>Odwodnić wypreparowane mózgi i rdzeń kręgowy w stacji przetwarzania tkanek i zanurzyć je w parafinie za pomocą stacji parafinowej.</li>
	<li>Tkanki zatopione w parafinie przeciąć mikrotomem na odcinki koronalne o grubości 8 μm i zamontować skrawki na szkiełkach</li> podstawowych.
	<li>Odparafinować skrawki tkanki, inkubując je w dwóch oddzielnych kąpielach ksylolowych przez 5 do 10 minut, a następnie ponownie nawodnić je przez serię stopniowanych kąpieli etanolowych (100%, 90%, 70%, 50%), a na koniec zH2O.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 0,01 M buforze cytrynianowym (pH 6,0) przez 5 minut w temperaturze pokojowej i dodatkowo gotować je przez 10 minut w kuchence mikrofalowej.</li>
	<li>Pozwól skrawkom ostygnąć do temperatury pokojowej i inkubuj je z 3% roztworem nadtlenku wodoru przez 30 minut, aby zahamować endogenne peroksydazy.</li>
	<li>Zablokować skrawki tkanki przez inkubację z 20% (obj./obj.) normalną surowicą kozią, 1% (obj./obj.) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5% Tritonem X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Skrawki inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 1% (obj./obj.) normalnej surowicy koziej, 1% (obj./obj.) BSA i 0,25% Triton X-100 w PBS przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć sekcje dwukrotnie 0,25% (vol/vol) Triton X-100 w PBS i raz PBS.</li>
	<li>Wybarwić skrawki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem i barwnikiem jądrowym DAPI rozcieńczonym w 1% (obj. / obj.) normalnej surowicy koziej, 1% (obj. / obj.) BSA i PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po dwukrotnym umyciu 0,25% (vol/vol) Triton X-100 w PBS i raz PBS, nakryć szkiełka z pożywką do zatapiania i uwidocznić barwienie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.</li>
</ol>

<ol><li>Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Beyond+the+prion+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Beyond the prion principle.</a> Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).</li>
<li>Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+pathology+in+long-term+embryonic+nigral+transplants+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease.</a> Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+bodies+in+grafted+neurons+in+subjects+with+Parkinson%27s+disease+suggest+host-to-graft+disease+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation.</a> Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).</li>
<li>Hansen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+propagates+from+mouse+brain+to+grafted+dopaminergic+neurons+and+seeds+aggregation+in+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells.</a> J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).</li>
<li>Masuda-Suzukake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+pathological+alpha-synuclein+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain.</a> Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).</li>
<li>Holmqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+Parkinson+pathology+spread+from+the+gastrointestinal+tract+to+the+brain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338 (6109), 949-953 (2012).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1, 38(2013).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+injection+of+alpha-synuclein+induces+CNS+alpha-synuclein+pathology+and+a+rapid-onset+motor+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).</li>
<li>Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prion+neuroinvasion+following+tongue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rapid prion neuroinvasion following tongue infection.</a> J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).</li>
<li>Tamgüney, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+prions+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measuring prions by bioluminescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+multiple+system+atrophy+prions+to+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).</li>
<li>Breid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasion+of+alpha-Synuclein+Prionoids+after+Intraperitoneal+and+Intraglossal+Inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation.</a> J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).</li>
<li>Bernis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+human+brain-derived+alpha-synuclein+in+transgenic+mice+expressing+human+wild-type+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75(2015).</li>
<li>Gunther, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+testing+and+spinal+cord+removal+in+a+mouse+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+MPTP+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease.</a> Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+bacterial+endotoxin+generates+a+distinct+strain+of+alpha-synuclein+fibril%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril.</a> Sci Rep. 6, 30891(2016).</li>
<li>Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+pathogenesis%3A+disease+onset+is+characterized+by+marked+induction+of+GFAP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells.</a> Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).</li>
<li>Stöhr, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synthetic+Abeta+prion+strains+producing+different+amyloid+deposits+in+bigenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+inoculation+of+pathological+alpha-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+alpha-synucleinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice.</a> J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).</li>
<li>Recasens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+extracts+from+Parkinson+disease+brains+trigger+alpha-synuclein+pathology+and+neurodegeneration+in+mice+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys.</a> Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38(2013).</li>
<li>Peelaerts, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+strains+cause+distinct+synucleinopathies+after+local+and+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration.</a> Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-) stanowi łatwą metodę wywoływania choroby neurologicznej, której towarzyszy zapalenie nerwów w celu podsumowania ważnych cech synukleinopatii. Podobnie, wstrzyknięcie do języka stanowi inną drogę neuroinwazji przez prionoidy alfa-synukleiny u myszy transgenicznych, ale jest mniej skuteczne. Zdecydowaliśmy się zakończyć nasze eksperymenty po 420 dniach od wstrzyknięcia i nie możemy wykluczyć możli...

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że alfa-synukleina ma cechy podobne do białek prionowych, szczególnie w zakresie zdolności do samosiewu i rozprzestrzeniania się nieprawidłowego fałdowania między komórkami i wzdłuż ścieżek neuronalnych. Ta właściwość alfa-synukleiny jest również określana jako "podobna do prionu" lub "prionoidowa" i jest poparta obserwacjami w eksperymentach transplantacyjnych, które sugerują zdolność przenoszenia nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny z chorych neuronów do nowo przeszczepionych zdrowych neuronów1,2,3,4. Również bezpośrednie wstrzyknięcie nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny do mózgu lub obwodu, np. mięśnia kończyny tylnej lub ściany jelita, powoduje rozprzestrzenianie się patologii alfa-synukleiny na dystalne części OUN 5,6,7,8,9,10. Bardziej szczegółowo przeanalizowaliśmy transmisję prionoidów alfa-synukleiny drogami obwodowymi i odpowiedzieliśmy na pytanie, czy nieprawidłowo sfałdowana alfa-synukleina może neuroinatakować OUN po pojedynczym wstrzyknięciu dojęzykowym lub dootrzewnowym, cechę, którą wcześniej wykazano dla prionów, ale nie dla nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny. Po wstrzyknięciu prionów do języka, neuroinwazja OUN jest osiągana poprzez propagację wzdłuż nerwu podjęzykowego języka, który prowadzi do jądra nerwu podjęzykowego, które znajduje się w pniu mózgu11. Jako model mysi wybraliśmy myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-), które nadmiernie eksprymują mutant A53T ludzkiej alfa-synukleiny z promotora prionów i lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora Gfap w celu monitorowania aktywacji astrocytarnej przez bioluminescencję, jak wcześniej wykazano w mózgu myszy zakażonych prionami12. W naszych rękach bigeniczne myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) nie rozwinęły choroby do 23 miesiąca życia, jak wykazały inne13. Pojedyncze wstrzyknięcie ludzkich włókienek alfa-synukleiny drogą dojęzykową lub dootrzewnową wywołało chorobę neurologiczną z patologią w mózgach i rdzeniach kręgowych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) wspierających hipotezę, że prionoidy alfa-synukleiny mają ważne cechy wspólne z prionami14.

<table><tbody><tr><td>przeciwciało anty-aktynowe</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>anty-alfa-synukleina, przeciwciało fosfo S129 [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>anty-alfa-synukleina, przeciwciało fosfo S129 [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-IBA-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-sekwestrosom-1 (p62)</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ubikwityny [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp;</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>27 g strzykawka</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline marker laboratoryjny&nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 mg/ml roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 sonikator</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS System obrazowania Lumina II</td><td>Oprogramowanie PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Oprogramowanie</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(M83+/-) myszy lub B6; Myszy C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J</td><td>Kleszcze Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy wzór</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze o wąskim wzorze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP&nbsp;</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110&nbsp;</td></tr><tr><td>Grubościenne rurki poliwęglanowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało sprzężone HRP</td><td>Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 przeciwciało sprzężone&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td> System obrazowania <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Stella 3200</td><td></td> System obrazowania w podczerwieni Raytest <td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&nbsp;</td><td>LI-COR Animacja z zakresu nauk biologicznych</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immobilon-FL</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>roztwór roboczy 3%</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>rozcieńczenie robocze 1:50 000</td></tr><tr><td>Fluoromount media&nbsp;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT inhibitory proteazy i fosfatazy</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>Homogenizator Precellys 24-Dual&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało sprzężone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 przeciwciało sprzężone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; BCA&nbsp; Białko&nbsp; Oznaczenie&nbsp; Zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM2255</td><td></td> Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Aby zbadać podobne do prionów zachowanie nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny, potrzebne są modele mysie, które umożliwiają szybkie i proste przekazywanie prionoidów alfa-synukleinowych, które powodują neuropatologię w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Tutaj opisujemy, że dojęzykowe lub dootrzewnowe wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny do bigenicznych myszy Tg (M83 +/-: Gfap-luc +/-), które wykazują nadekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z mutacją A53T z promotora białka prionowego i lucyferazy świetlika z promotora kwaśnego białka fibrylarnego gleju (Gfap), jest wystarczające do wywołania choroby neuropatologicznej. W porównaniu z homozygotycznymi myszami Tg(M83+/+), u których rozwijają się poważne objawy neurologiczne rozpoczynające się w wieku 8 miesięcy, heterozygotyczne zwierzęta Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) pozostają wolne od spontanicznej choroby do osiągnięcia wieku 22 miesięcy. Co ciekawe, wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny drogą dootrzewnową wywołało chorobę neurologiczną z paraliżem u czterech z pięciu myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-) z medianą czasu inkubacji wynoszącą 229 ±17 dni. Chore zwierzęta wykazywały poważne złogi fosforylowanej alfa-synukleiny w mózgach i rdzeniu kręgowym. Nagromadzenie alfa-synukleiny było nierozpuszczalne w sarkozylu i kolokalizowane z ubikwityną i p62, a towarzyszyła im reakcja zapalna skutkująca glejozą astrocytową i mikroglejozą. Co zaskakujące, inokulacja włókienek alfa-synukleiny do języka była mniej skuteczna w wywoływaniu choroby, a tylko jedno z pięciu wstrzykniętych zwierząt wykazywało patologię alfa-synukleiny po 285 dniach. Nasze odkrycia pokazują, że inokulacja drogą dojęzykową, a tym bardziej drogą dootrzewnową, jest odpowiednia do wywołania choroby neurologicznej z istotnymi cechami synukleinopatii u myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-). Zapewnia to nowy model do bardziej szczegółowego badania patogenezy podobnej do prionów indukowanej przez prionoidy alfa-synukleiny.

Obwodowe wstrzyknięcie prionoidów alfa-synukleiny poprzez język lub otrzewną wywołało neuropatologię w OUN myszy bigenicznych Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) (Tabela 1 i Rysunek 1). Po pojedynczym wstrzyknięciu domięśniowym włókien alfa-synukleiny u czterech z pięciu myszy rozwinęła się choroba neurologiczna z medianą czasu inkubacji wynoszącą 229 ±17 dni. Co zaskakujące, tylko u jednej z pięciu myszy rozwinęła się choroba OUN po wst...

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Ogólnym celem tej metody obrazowania bioluminescencyjnego jest ilościowe określenie stanu zapalnego układu nerwowego w ośrodkowym układzie nerwowym modelu mysiego choroby Parkinsona po obwodowym wstrzyknięciu włókien alfa-synukleiny. Metoda ta może pomóc w ustaleniu, kiedy i w jakim stopniu występuje neurostan zapalny w modelach mysich chorób neurodegeneracyjnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość nieinwazyjnego i wielokrotnego monitorowania stanu zapalnego układu nerwowego aż do momentu wystąpienia objawów choroby neurologicznej u myszy.Znaczenie tej techniki polega na możliwości diagnozowania chorób neurologicznych w 10. godzinie, ponieważ wzrost bioluminescencji wynikający z zapalenia nerwów nie tylko towarzyszy chorobie neurologicznej, ale często ją wyprzedza. Należy rozpocząć od prawidłowego znieczulenia zwierzęcia przed zabiegiem chirurgicznym. Wykonaj test ucisku palca i potwierdź, że zwierzę nie cofa kończyny, co wskazuje na osiągnięcie chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia.Nanieś maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas anestezji. Za pomocą taśmy klejącej ostrożnie przymocuj zwierzę do płyty grzewczej w pozycji grzbietowej, z głową skierowaną w s

bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Choroba Parkinsona była wiązana z ekspozycją na pestycydy. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika żołądkowego w pożądanym stężeniu oraz metodę analizy ich wpływu na gromadzenie się alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym.

Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Ten film pokazuje wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny myszowi w celu wywołania zapalenia nerwów. Włókienka są wstrzykiwane dootrzewnowo transgenicznej myszy wykazującej ekspresję zmutowanych białek alfa-synukleiny. Po dotarciu do ośrodkowego układu nerwowego fibryle wnikają do neuronów i indukują agregację zmutowanych białek. Agregaty rozprzestrzeniają się na sąsiednie neurony, mikroglej i astrocyty. Rozpoznanie agregatów powoduje, że mikroglej indukuje zapalenie nerwów, uszkadzając neurony.

Indukcja zapalenia nerwów u myszy poprzez wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny

Źródło: Breid, S.,  et. al. Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókienek alfa-synukleiny. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych, prezentując reakcje lucyferazy-lucyferyny w aktywowanych astrocytach. Protokół umożliwia nieinwazyjną kwantyfikację aktywacji astrocytarnej, wspomagając badania nad zapaleniem OUN i skutecznością terapeutyczną.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia nerwów u myszy transgenicznej

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Źródło: Schmitz, K., et al., Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje metodę wizualizacji i monitorowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego lub zapalenia nerwu wzrokowego wywołanego EAE za pomocą obrazowanie bioluminescencyjne. Obejmuje to pozycjonowanie myszy, wstrzykiwanie odczynnika i przechwytywanie sekwencyjnych...

Obrazowanie bioluminescencyjne w modelu myszy EAE

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego do ilościowej oceny neurozapalenia w modelu choroby Parkinsona u myszy po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny. Technika umożliwia nieinwazyjny monitoring zapalenia układu nerwowego.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Przeglądaj więcej filmów