Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Ogólnym celem tej metody obrazowania bioluminescencyjnego jest ilościowe określenie stanu zapalnego układu nerwowego w ośrodkowym układzie nerwowym mysiego modelu choroby Parkinsona po obwodowym wstrzyknięciu włókienek alfa-synukleiny. Metoda ta może pomóc w ustaleniu, kiedy i w jakim stopniu występuje zapalenie układu nerwowego w mysich modelach chorób neurodegeneracyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapalenie nerwów może być nieinwazyjne i wielokrotnie monitorowane, dopóki u myszy nie rozwinie się choroba neurologiczna.

Implikacją tej techniki jest 10. godzina diagnozy choroby neurologicznej, ponieważ wzrost bioluminescencji spowodowany zapaleniem nerwów nie tylko towarzyszy, ale często poprzedza chorobę neurologiczną. Zacznij od odpowiedniego znieczulenia zwierzęcia do operacji. Uszczypnij palec u nogi i upewnij się, że zwierzę nie wycofuje kończyny, aby wskazać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.

Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Użyj taśmy klejącej, aby ostrożnie przymocować zwierzę do płyty grzewczej w grzbietowej pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę badacza. Następnie napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o rozmiarze 27 pięcioma mikrolitrami sonikowanych włókien alfa-synukleiny.

Następnie użyj pary kleszczyków do kciuków z nosem, aby utrzymać otwarte usta zwierzęcia i użyj mniejszej pary kleszczy, aby ostrożnie wyciągnąć język, aby spód języka był dostępny do wstrzyknięcia. Wprowadzić igłę strzykawki w prawą lub lewą dolną stronę języka, w pobliżu nerwu podjęzykowego. Po pięciu sekundach powoli wstrzyknąć inokulum.

Pozostawić igłę na miejscu przez kolejne pięć sekund, aby upewnić się, że inokulum wniknie w tkankę, a następnie ostrożnie wyjąć igłę. Po wstrzyknięciu należy uwolnić zwierzę i pozostawić je na płycie grzewczej pod stałym nadzorem aż do całkowitego wyzdrowienia. W przypadku wstrzyknięć dootrzewnowych należy krótko odnarkotyzować zwierzęta w komorze anestezjologicznej izofluranem.

Ponownie uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie. Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o rozmiarze 27 50 mikrolitrami sonikowanych alfa-synucelinowych fibirlów lub PBS. Trzymaj zwierzę w pozycji grzbietowej z głową skierowaną w stronę przeciwną do badacza i w dół pod kątem około 45 stopni.

Wstrzykiwać bezpośrednio do otrzewnej myszy bez przenikania do jelita cienkiego lub jelita ślepego znajdującego się za ścianą brzucha. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia. Przed obrazowaniem należy ogolić i zdepilować głowy myszy znieczulonych izofluranem.

Pokoloruj uszy na czarno niedrażniącym markerem, aby zablokować niespecyficzną bioluminescencję. Zważyć zwierzęta przed wstrzyknięciem. Następnie oblicz dokładną objętość D-Lucyferyny do wstrzyknięcia przy 150 miligramach na kilogram masy ciała.

Dootrzewnowo wstrzyknąć obliczoną objętość D-Lucyferyny, a następnie zwrócić każde zwierzę do komory anestezjologicznej. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Gdy system obrazowania osiągnie temperaturę roboczą, zainicjuj system, klikając przycisk Zainicjuj w panelu sterowania.

Następnie wybierz przyciski Luminescencyjny i Fotografia. Ustaw czas ekspozycji na 60 sekund, Binning na średni, F/Stop na jeden, a wzmocnienie EM na wyłączone. Wybierz opcję Blokuj, a następnie Otwórz.

A następnie pod zakładką Wysokość tematu wybierz 1.50 z menu rozwijanego. Dziesięć minut po wstrzyknięciu D-Lucyferyny umieść zwierzęta na płytce grzewczej w komorze obrazowania i upewnij się, że ich mięśnie są prawidłowo umieszczone w ujściu znieczulenia. Przełączyć przepływ izofluranu z komory inhalacyjnej do komory obrazowania i prawidłowo zamknąć drzwi komory obrazowania.

Kliknij przycisk pobierania, aby zmierzyć bioluminescencję, co trwa 60 sekund. Zatrzymać przepływ izofluranu, a następnie przywrócić zwierzęta do klatek. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo bioluminescencję, otwierając menu palety narzędzi i wybierając Narzędzia ROI.

W obszarze Typ wybierz opcję Zwrot z inwestycji w pomiar. W Narzędziach ROI kliknij narzędzie koła i wybierz liczbę ROI do narysowania z menu rozwijanego. Najlepiej trzy na trzy myszy.

Na obrazie kliknij prawym przyciskiem myszy każdy ROI i w obszarze właściwości dostosuj szerokość i wysokość do 1,25 centymetra. Umieść każdy zwrot z inwestycji w obszarze mózgu, który jest określany ilościowo. W lewym górnym rogu obrazu ustaw panel jednostek na promieniowanie w fotonach.

Następnie otwórz menu palety narzędzi. Wybierz obraz, dostosuj i dostosuj minimum i maksimum skali kolorów. Na przykład od 200 000 do miliona.

Na koniec w obszarze plik kliknij Zapisz, aby zapisać dane. Jak pokazano tutaj, po wstrzyknięciu dootrzewnowym włókienek alfa-synukleiny, cztery z pięciu transgenicznych myszy transgenicznych z lucyferycznym reporterem A53T GFAP rozwinęły chorobę neurologiczną w ciągu 229 dni, jak wskazują fioletowe kwadraty. Jednak tylko jedna z pięciu myszy, którym wstrzyknięto interglossalnie, rozwinęła chorobę neurologiczną w ciągu 285 dni, jak wskazują zielone kółka.

Obrazowanie bioluminescencyjne ujawniło, że transgeniczne myszy emitowały podwyższoną bioluminescencję ze swoich mózgów i rdzeni kręgowych, na krótko przed wystąpieniem objawów choroby neurologicznej. Ta bioluminescencja była bardziej wyraźna po wstrzyknięciu dootrzewnowym i nieobecna po wstrzyknięciu PBS, co sugeruje brak glejozy astrocytowej. Rysunek ten pokazuje bioluminescencję w mózgach myszy transgenicznych w czasie po dootrzewnowym wstrzyknięciu włókienek alfa-synukleiny.

Jak pokazano w niebieskich, zielonych, brązowych i pomarańczowych kółkach. Zwiększony poziom bioluminescencji powyżej progu 2 milionów fotonów na sekundę na centymetr kwadratowy na steradian zaobserwowano kilka tygodni przed tym, jak u tych czterech pojedynczych myszy rozwinęły się neurologiczne objawy choroby. Jedno z pięciu zwierząt wykazało również podwyższony poziom bioluminescencji na krótko przed śmiercią 285 dni po wstrzyknięciu dojęzykowym włókienek alfa-synukleiny.

W przeciwieństwie do tego, w przypadku zdrowych myszy kontrolnych z wstrzyknięciem PBS i jednego zwierzęcia, u którego nie rozwinęła się choroba po wstrzyknięciu dootrzewnowym, z włókienkami alfa-synukleiny oznaczonymi czerwonymi kółkami, sygnał bioluminescencji pozostał poniżej progu w okresie obserwacji. Barwienie immunofluorescencyjne wycinków mózgu chorych zwierząt przeciwciałami przeciwko GFAP i Iba1 potwierdziło zapalenie nerwów z mikroglejem i reaktywnymi astrocytami w regionach ze złogami alfa-synukleiny. Zdrowe zwierzęta, które nie gromadziły złogów alfa-synukleiny, wykazywały niewielkie zabarwienie dla GFAP i Iba1.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurodegeneracją do nieinwazyjnego badania zapalenia nerwów w ośrodkowym układzie nerwowym myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obwodowo wstrzykiwać myszom fibryle alfa-synukleiny i jak wykonywać obrazowanie bioluminescencyjne w celu monitorowania zapalenia nerwów OUN.

Ogólnym celem zabiegu jest obwodowe wywołanie choroby neurologicznej poprzez iniekcję dojęzykową lub dootrzewnową z włókienkami alfa-synukleiny oraz nieinwazyjne zobrazowanie indukcji zapalenia nerwów w czasie.