Name: Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego do ilościowej oceny neurozapalenia w modelu choroby Parkinsona u myszy po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny. Technika umożliwia nieinwazyjny monitoring zapalenia układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Oldze Sharmie, Theresie Hundt oraz personelowi DZNE Microscopy and Animal Facilities za wsparcie techniczne.

Wszystkie procedury, w tym dotyczące zwierząt, zostały przeprowadzone za zgodą komitetu ochrony zwierząt Krajowej Agencji Ochrony Środowiska Nadrenii Północnej-Westfalii (LANUV). Zwierzęta były trzymane w pomieszczeniach i opiekowane zgodnie ze standardowymi warunkami z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność oraz swobodnym dostępem do pożywienia i wody.
1. Model zwierzęcy
<ol>
	<li>Krzyżuj hemizygotyczne myszy Tg(Gfap-luc+/-) z hemizygotycznymi myszami Tg(M83+/-) w celu wygenerowania hemizygotycznych bigenicznych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) class<="xref">15,16.</li>
	<li>Genotyp potomstwa za pomocą PCR w czasie rzeczywistym pod kątem obecności transgenu kodującego ludzką alfa-synukleinę oraz za pomocą standardowego PCR dla lucyferazy świetlika12,17.</li>
	<li>Zaszczepić zwierzęta w wieku od sześciu do ośmiu tygodni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie inokulum
<ol>
	<li>Przygotować monomeryczną rekombinowaną ludzką alfa-synukleinę z mutacją A53T w buforze soli fizjologicznej buforowanym trisem (TBS) zawierającym 150 mM NaCl w 20 mM Tris-HCl (pH 7,2), jak opisano wcześniej14.</li>
	<li>Przygotować fibrylarną alfa-synukleinę do inokulacji, mieszając 3 μg/μl monomerycznej rekombinowanej ludzkiej alfa-synukleiny w wytrząsarce orbitalnej przy 800 obr./min i temperaturze 37 °C przez 5 dni.</li>
	<li>Rozcieńczyć zespoły fibryli w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), aby osiągnąć końcowe stężenie 1 μg/μl w przypadku inokulacji dootrzewnowej lub 2 μg/μl w przypadku inokulacji dojęzykowej.</li>
	<li>Fragmentuj fibryle alfa-synukleiny za pomocą sonikatora pręcikowego przez 1 minutę (40 impulsów o czasie trwania 0,5 s z jednosekundową przerwą między każdym impulsem i amplitudą ustawioną na 50%) na lodzie. Aby uniknąć zanieczyszczenia przez siew krzyżowy. Użyj czystych sond sonicznych, aby przygotować różne inokulum.</li>
</ol>
3. Iniekcje dojęzykowe.
<ol>
	<li>Znieczulenie zwierząt za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie. Użyj maści weterynaryjnej na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Ostrożnie przymocuj narkotyzowane zwierzęta taśmą klejącą do płyty grzewczej w pozycji leżącej grzbietowej, z głowami skierowanymi w stronę badacza.</li>
	<li>Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 5 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.</li>
	<li>Użyj jednego kleszczyka do kciuka z nosem i ząbkowanymi końcówkami, aby przytrzymać usta zwierzęcia otwarte, a drugiej mniejszej pary kleszczy, aby ostrożnie wyciągnąć język, aby dolna strona języka była dostępna do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wstrzyknąć igłę strzykawki w prawą lub lewą dolną stronę języka, w pobliżu nerwu podjęzykowego. Powoli wstrzyknąć inokulum po 5 sekundach. Powoli wycofaj igłę po 5 sekundach, aby upewnić się, że inokulum wniknęło w tkankę i nie zostało utracone podczas cofania igły.</li>
	<li>Uwolnij zwierzę z fiksacji i pozostaw je na płycie grzewczej pod stałym nadzorem aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
</ol>
4. Iniekcje dootrzewnowe
<ol>
	<li>W przypadku wstrzyknięć dootrzewnowych należy krótko narkotyzować zwierzęta w komorze anestezjologicznej poprzez inhalację izofluranem/tlenem, przy natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o pojemności 27 g 50 μl sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS.</li>
	<li>Należy wstrzykiwać bezpośrednio do otrzewnej myszy i unikać przenikania do jelita cienkiego lub jelita ślepego znajdującego się za ścianą jamy brzusznej, trzymając zwierzę w pozycji grzbietowej z głową skierowaną w kierunku przeciwnym do badacza i w dół pod kątem około 45°. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie wyzdrowieją ze znieczulenia.</li>
</ol>
5. Obrazowanie bioluminescencyjne
<ol>
	<li>Obraz Tg (M83 +/-: Gfap-luc +/-) myszy co 2-4 tygodnie przy użyciu systemu obrazowania bioluminescencyjnego.</li>
	<li>Przed obrazowaniem należy krótko znieczulić myszy w komorze izofluranowo-tlenowej o natężeniu przepływu 2 l/min i parowniku ustawionym na 2%. Uszczypnij palec u nogi zwierzęcia i upewnij się, że nie wycofuje tylnej kończyny, aby zapewnić odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Ogol i wypiluj głowy myszy kremem do depilacji. Pokoloruj uszy na czarno niedrażniącym markerem, aby zablokować niespecyficzną bioluminescencję.</li>
	<li>Rozcieńczyć sól potasową D-lucyferyny, substrat lucyferazy, w PBS do roztworu podstawowego o stężeniu 30 mg/ml. Przechowywać w 1 ml porcji w temperaturze -20 °C. Chronić rozpuszczoną D-lucyferynę przed ekspozycją na światło.</li>
	<li>Zważyć zwierzęta przed wstrzyknięciem. Oblicz dokładną objętość D-lucyferyny do wstrzyknięcia 150 mg/kg masy ciała. Dootrzewnowo wstrzyknąć D-lucyferynę i zwrócić zwierzę do komory anestezjologicznej.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Gdy system obrazowania osiągnie temperaturę roboczą, zainicjuj go, klikając przycisk "Zainicjuj" na panelu sterowania.</li>
	<li>Wybierz przyciski "Luminescencyjny" i "Fotografia". Ustaw czas ekspozycji na 60 s, binning na "Średni", przysłonę przysłony na "1", a wzmocnienie EM na "Wył.".</li>
	<li>Upewnij się, że filtr wzbudzenia jest ustawiony na "Blok", a filtr emisji na "Otwarty" i ustaw wysokość obiektu na 1.50 cm.</li>
	<li>Dziesięć minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny umieść zwierzęta na płycie grzewczej w komorze obrazowania i upewnij się, że ich pyski są prawidłowo umieszczone w wylocie znieczulenia. Zamknąć przepływ izofluranu/tlenu z komory inhalacyjnej i otworzyć przepływ do komory obrazowania o natężeniu przepływu 0,25 l/min i parowaniu 2%. Prawidłowo zamknij drzwiczki komory obrazowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk "Pobierz", aby zmierzyć bioluminescencję, która trwa 60 s. Zatrzymaj przepływ izofluranu i monitoruj zwierzęta do momentu, aż całkowicie wyzdrowieją po powrocie do klatek.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obrazowania, aby określić ilościowo bioluminescencję. W "Palecie narzędzi" wybierz "Narzędzia ROI". W sekcji "Typ" w "Narzędziach ROI" wybierz "Pomiar ROI".</li>
	<li>W "Narzędziach ROI" kliknij narzędzie "kółko" i wybierz liczbę ROI do narysowania z menu rozwijanego – najlepiej "3" dla trzech myszy.</li>
	<li>Na obrazie kliknij prawym przyciskiem myszy każdy ROI i w sekcji "Właściwości" dostosuj szerokość i wysokość do 1,25 cm. Umieść każdy ROI nad obszarem mózgu, który jest określany ilościowo.</li>
	<li>W lewym górnym rogu obrazu ustaw panel jednostek na "promieniowanie (fotony)".</li>
	<li>W "Palecie narzędzi" wybierz "Dostosuj obraz" i dostosuj minimum i maksimum "Skali kolorów", na przykład od 0,20e6 do 1,00e6.</li>
	<li>W sekcji "Plik" zapisz dane za pomocą opcji "Zapisz".</li>
</ol>
6. Analiza biochemiczna
<ol>
	<li>Odizoluj mózg i rdzeń kręgowy zgodnie z ustalonymi protokołami18,19.</li>
	<li>Homogenizować próbki całego mózgu i całego rdzenia kręgowego oddzielnie w PBS w obecności inhibitorów proteazy i fosfatazy (rozcieńczonych do 1x w PBS) w dwóch cyklach 30-sekundowych z prędkością 6,000 obr./min w homogenizatorze tkankowym. Upewnij się, że próbki mózgu i rdzenia kręgowego są homogenizowane do końcowego stężenia 20% (wag./obj.).</li>
	<li>Dwukrotnie poddaj próbki działaniu sonikacji, utrzymując je na lodzie ze stałym impulsem 10 s i amplitudą ustawioną na 50%.</li>
	<li>Dostosuj homogenaty do 10% w PBS i 750 mM NaCl, rozcieńczając je 1:1 z 1,5 M NaCl w PBS.</li>
	<li>Aby oddzielić resztki komórkowe, odwirować homogenaty w stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zachowaj supernatanty do następnych kroków i wyrzuć granulki.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w homogenatach za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować 1,0 mg białka całkowitego z homogenatów mózgu lub 0,8 mg z homogenatów rdzenia kręgowego w N-laurylosarkozylu w końcowym stężeniu 10% (wag./obj.) przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>Nałożyć homogenaty na 3 ml poduszki z sacharozą o stężeniu 10% (wag./obj.) w wodzie destylowanej i ultraodwirować je w temperaturze 465 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić granulki w buforze zawierającym 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 2% β-merkaptoetanolu, 192 mM glicyny, 25 mM trisu i 5% (wag./obj.) sacharozy.</li>
	<li>Gotować próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut i umieścić je w żelach poliakryloamidowych SDS do elektroforezy w układzie buforowym kwasu morfolinowo-etanosulfonowego (MES).</li>
	<li>Przenieść oddzielone białka do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) w systemie półsuchym.</li>
	<li>Inkubować błony w 0,4% (obj./obj.) roztworze formaliny w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wirniku z prędkością 35 obr./min, aby usieciować białka z błoną.</li>
	<li>Zablokuj membrany w buforze TBS zawierającym 0,05% (obj./obj.) mleka Tween 20 i 5% (wag./obj.) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować bloty z pierwszorzędowym przeciwciałem w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć błony trzykrotnie w buforze TBS i inkubować je z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą lub fluoroforem w TBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wizualizacja związanych przeciwciał drugorzędowych za pomocą chemiluminescencji lub fluorescencji zgodnie z ustalonymi protokołami20.</li>
</ol>
7. Analiza immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>Odwodnić wypreparowane mózgi i rdzeń kręgowy w stacji przetwarzania tkanek i zanurzyć je w parafinie za pomocą stacji parafinowej.</li>
	<li>Tkanki zatopione w parafinie przeciąć mikrotomem na odcinki koronalne o grubości 8 μm i zamontować skrawki na szkiełkach</li> podstawowych.
	<li>Odparafinować skrawki tkanki, inkubując je w dwóch oddzielnych kąpielach ksylolowych przez 5 do 10 minut, a następnie ponownie nawodnić je przez serię stopniowanych kąpieli etanolowych (100%, 90%, 70%, 50%), a na koniec zH2O.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 0,01 M buforze cytrynianowym (pH 6,0) przez 5 minut w temperaturze pokojowej i dodatkowo gotować je przez 10 minut w kuchence mikrofalowej.</li>
	<li>Pozwól skrawkom ostygnąć do temperatury pokojowej i inkubuj je z 3% roztworem nadtlenku wodoru przez 30 minut, aby zahamować endogenne peroksydazy.</li>
	<li>Zablokować skrawki tkanki przez inkubację z 20% (obj./obj.) normalną surowicą kozią, 1% (obj./obj.) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5% Tritonem X-100 w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Skrawki inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 1% (obj./obj.) normalnej surowicy koziej, 1% (obj./obj.) BSA i 0,25% Triton X-100 w PBS przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć sekcje dwukrotnie 0,25% (vol/vol) Triton X-100 w PBS i raz PBS.</li>
	<li>Wybarwić skrawki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem i barwnikiem jądrowym DAPI rozcieńczonym w 1% (obj. / obj.) normalnej surowicy koziej, 1% (obj. / obj.) BSA i PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po dwukrotnym umyciu 0,25% (vol/vol) Triton X-100 w PBS i raz PBS, nakryć szkiełka z pożywką do zatapiania i uwidocznić barwienie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego.</li>
</ol>

<ol><li>Aguzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Beyond+the+prion+principle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Beyond the prion principle.</a> Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).</li>
<li>Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+pathology+in+long-term+embryonic+nigral+transplants+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease.</a> Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+bodies+in+grafted+neurons+in+subjects+with+Parkinson%27s+disease+suggest+host-to-graft+disease+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation.</a> Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).</li>
<li>Hansen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+propagates+from+mouse+brain+to+grafted+dopaminergic+neurons+and+seeds+aggregation+in+cultured+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells.</a> J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).</li>
<li>Masuda-Suzukake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+spreading+of+pathological+alpha-synuclein+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain.</a> Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).</li>
<li>Holmqvist, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+Parkinson+pathology+spread+from+the+gastrointestinal+tract+to+the+brain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats.</a> Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338 (6109), 949-953 (2012).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1, 38(2013).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+injection+of+alpha-synuclein+induces+CNS+alpha-synuclein+pathology+and+a+rapid-onset+motor+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).</li>
<li>Mougenot, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+acceleration+of+a+synucleinopathy+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model.</a> Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).</li>
<li>Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prion+neuroinvasion+following+tongue+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rapid prion neuroinvasion following tongue infection.</a> J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).</li>
<li>Tamgüney, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+prions+by+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Measuring prions by bioluminescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).</li>
<li>Watts, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+multiple+system+atrophy+prions+to+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).</li>
<li>Breid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinvasion+of+alpha-Synuclein+Prionoids+after+Intraperitoneal+and+Intraglossal+Inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation.</a> J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+imaging+of+GFAP+expression+after+neuronal+damage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice.</a> Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).</li>
<li>Bernis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+human+brain-derived+alpha-synuclein+in+transgenic+mice+expressing+human+wild-type+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75(2015).</li>
<li>Gunther, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+testing+and+spinal+cord+removal+in+a+mouse+model+for+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+MPTP+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease.</a> Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Kim, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+bacterial+endotoxin+generates+a+distinct+strain+of+alpha-synuclein+fibril%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril.</a> Sci Rep. 6, 30891(2016).</li>
<li>Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+pathogenesis%3A+disease+onset+is+characterized+by+marked+induction+of+GFAP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells.</a> Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).</li>
<li>Stöhr, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+synthetic+Abeta+prion+strains+producing+different+amyloid+deposits+in+bigenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracerebral+inoculation+of+pathological+alpha-synuclein+initiates+a+rapidly+progressive+neurodegenerative+alpha-synucleinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice.</a> J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).</li>
<li>Recasens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body+extracts+from+Parkinson+disease+brains+trigger+alpha-synuclein+pathology+and+neurodegeneration+in+mice+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys.</a> Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).</li>
<li>Sacino, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+CNS+alpha-synuclein+pathology+by+fibrillar+and+non-amyloidogenic+recombinant+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein.</a> Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38(2013).</li>
<li>Peelaerts, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+strains+cause+distinct+synucleinopathies+after+local+and+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration.</a> Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-) stanowi łatwą metodę wywoływania choroby neurologicznej, której towarzyszy zapalenie nerwów w celu podsumowania ważnych cech synukleinopatii. Podobnie, wstrzyknięcie do języka stanowi inną drogę neuroinwazji przez prionoidy alfa-synukleiny u myszy transgenicznych, ale jest mniej skuteczne. Zdecydowaliśmy się zakończyć nasze eksperymenty po 420 dniach od wstrzyknięcia i nie możemy wykluczyć możli...

Istnieje coraz więcej dowodów na to, że alfa-synukleina ma cechy podobne do białek prionowych, szczególnie w zakresie zdolności do samosiewu i rozprzestrzeniania się nieprawidłowego fałdowania między komórkami i wzdłuż ścieżek neuronalnych. Ta właściwość alfa-synukleiny jest również określana jako "podobna do prionu" lub "prionoidowa" i jest poparta obserwacjami w eksperymentach transplantacyjnych, które sugerują zdolność przenoszenia nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny z chorych neuronów do nowo przeszczepionych zdrowych neuronów1,2,3,4. Również bezpośrednie wstrzyknięcie nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny do mózgu lub obwodu, np. mięśnia kończyny tylnej lub ściany jelita, powoduje rozprzestrzenianie się patologii alfa-synukleiny na dystalne części OUN 5,6,7,8,9,10. Bardziej szczegółowo przeanalizowaliśmy transmisję prionoidów alfa-synukleiny drogami obwodowymi i odpowiedzieliśmy na pytanie, czy nieprawidłowo sfałdowana alfa-synukleina może neuroinatakować OUN po pojedynczym wstrzyknięciu dojęzykowym lub dootrzewnowym, cechę, którą wcześniej wykazano dla prionów, ale nie dla nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny. Po wstrzyknięciu prionów do języka, neuroinwazja OUN jest osiągana poprzez propagację wzdłuż nerwu podjęzykowego języka, który prowadzi do jądra nerwu podjęzykowego, które znajduje się w pniu mózgu11. Jako model mysi wybraliśmy myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-), które nadmiernie eksprymują mutant A53T ludzkiej alfa-synukleiny z promotora prionów i lucyferazy świetlika pod kontrolą promotora Gfap w celu monitorowania aktywacji astrocytarnej przez bioluminescencję, jak wcześniej wykazano w mózgu myszy zakażonych prionami12. W naszych rękach bigeniczne myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) nie rozwinęły choroby do 23 miesiąca życia, jak wykazały inne13. Pojedyncze wstrzyknięcie ludzkich włókienek alfa-synukleiny drogą dojęzykową lub dootrzewnową wywołało chorobę neurologiczną z patologią w mózgach i rdzeniach kręgowych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) wspierających hipotezę, że prionoidy alfa-synukleiny mają ważne cechy wspólne z prionami14.

<table><tbody><tr><td>przeciwciało anty-aktynowe</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>anty-alfa-synukleina, przeciwciało fosfo S129 [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>anty-alfa-synukleina, przeciwciało fosfo S129 [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-IBA-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-sekwestrosom-1 (p62)</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ubikwityny [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp;</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>27 g strzykawka</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline marker laboratoryjny&nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa D-lucyferyny</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 mg/ml roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 sonikator</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS System obrazowania Lumina II</td><td>Oprogramowanie PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Oprogramowanie</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(M83+/-) myszy lub B6; Myszy C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J</td><td>Kleszcze Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Standardowy wzór</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze o wąskim wzorze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-XP&nbsp;</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110&nbsp;</td></tr><tr><td>Grubościenne rurki poliwęglanowe</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało sprzężone HRP</td><td>Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 przeciwciało sprzężone&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td> System obrazowania <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Stella 3200</td><td></td> System obrazowania w podczerwieni Raytest <td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&nbsp;</td><td>LI-COR Animacja z zakresu nauk biologicznych</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immobilon-FL</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>roztwór roboczy 3%</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>rozcieńczenie robocze 1:50 000</td></tr><tr><td>Fluoromount media&nbsp;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT inhibitory proteazy i fosfatazy</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>Homogenizator Precellys 24-Dual&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało sprzężone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 przeciwciało sprzężone</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; BCA&nbsp; Białko&nbsp; Oznaczenie&nbsp; Zestaw</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM2255</td><td></td> Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Aby zbadać podobne do prionów zachowanie nieprawidłowo sfałdowanej alfa-synukleiny, potrzebne są modele mysie, które umożliwiają szybkie i proste przekazywanie prionoidów alfa-synukleinowych, które powodują neuropatologię w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Tutaj opisujemy, że dojęzykowe lub dootrzewnowe wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny do bigenicznych myszy Tg (M83 +/-: Gfap-luc +/-), które wykazują nadekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z mutacją A53T z promotora białka prionowego i lucyferazy świetlika z promotora kwaśnego białka fibrylarnego gleju (Gfap), jest wystarczające do wywołania choroby neuropatologicznej. W porównaniu z homozygotycznymi myszami Tg(M83+/+), u których rozwijają się poważne objawy neurologiczne rozpoczynające się w wieku 8 miesięcy, heterozygotyczne zwierzęta Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) pozostają wolne od spontanicznej choroby do osiągnięcia wieku 22 miesięcy. Co ciekawe, wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny drogą dootrzewnową wywołało chorobę neurologiczną z paraliżem u czterech z pięciu myszy Tg (M83 + / -: Gfap-luc +/-) z medianą czasu inkubacji wynoszącą 229 ±17 dni. Chore zwierzęta wykazywały poważne złogi fosforylowanej alfa-synukleiny w mózgach i rdzeniu kręgowym. Nagromadzenie alfa-synukleiny było nierozpuszczalne w sarkozylu i kolokalizowane z ubikwityną i p62, a towarzyszyła im reakcja zapalna skutkująca glejozą astrocytową i mikroglejozą. Co zaskakujące, inokulacja włókienek alfa-synukleiny do języka była mniej skuteczna w wywoływaniu choroby, a tylko jedno z pięciu wstrzykniętych zwierząt wykazywało patologię alfa-synukleiny po 285 dniach. Nasze odkrycia pokazują, że inokulacja drogą dojęzykową, a tym bardziej drogą dootrzewnową, jest odpowiednia do wywołania choroby neurologicznej z istotnymi cechami synukleinopatii u myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-). Zapewnia to nowy model do bardziej szczegółowego badania patogenezy podobnej do prionów indukowanej przez prionoidy alfa-synukleiny.

Obwodowe wstrzyknięcie prionoidów alfa-synukleiny poprzez język lub otrzewną wywołało neuropatologię w OUN bigenicznych myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) (Tabela 1 oraz Rysunek 1). Po pojedynczym wstrzyknięciu dootrzewnowym włókien alfa-synukleiny u czterech z pięciu myszy rozwinęła się choroba neurologiczna z medianą czasu inkubacji wynoszącą 229 ±17 dni. Co zaskakujące, tylko u jednej z pięciu myszy rozwinęła się choroba OUN po...

Obwodowe wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny do otrzewnej lub języka myszy Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-), które wykazują ekspresję ludzkiej alfa-synukleiny z rodzinną mutacją A53T i lucyferazą świetlika, może wywołać neuropatologię, w tym zapalenie nerwów, w ich ośrodkowym układzie nerwowym.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Ogólnym celem tej metody obrazowania bioluminescencyjnego jest ilościowe określenie stanu zapalnego układu nerwowego w ośrodkowym układzie nerwowym modelu mysiego choroby Parkinsona po obwodowym wstrzyknięciu włókien alfa-synukleiny. Metoda ta może pomóc w ustaleniu, kiedy i w jakim stopniu występuje neurostan zapalny w modelach mysich chorób neurodegeneracyjnych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość nieinwazyjnego i wielokrotnego monitorowania stanu zapalnego układu nerwowego aż do momentu wystąpienia objawów choroby neurologicznej u myszy.Znaczenie tej techniki polega na możliwości diagnozowania chorób neurologicznych w 10. godzinie, ponieważ wzrost bioluminescencji wynikający z zapalenia nerwów nie tylko towarzyszy chorobie neurologicznej, ale często ją wyprzedza. Należy rozpocząć od prawidłowego znieczulenia zwierzęcia przed zabiegiem chirurgicznym. Wykonaj test ucisku palca i potwierdź, że zwierzę nie cofa kończyny, co wskazuje na osiągnięcie chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia.Nanieś maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas anestezji. Za pomocą taśmy klejącej ostrożnie przymocuj zwierzę do płyty grzewczej w pozycji grzbietowej, z głową skierowaną w stronę badacza. Następnie napełnij jednorazową strzykawkę podskórną o rozmiarze 27 G pięcioma mikrolitrami sonikowanych włókien alfa-synukleiny.Następnie, używając pęsety anatomicznej, należy rozewrzeć pysk zwierzęcia i za pomocą mniejszej pęsety ostrożnie wysunąć język, aby umożliwić dostęp do jego dolnej powierzchni w celu wykonania iniekcji. Wprowadzić igłę strzykawki w prawą lub lewą dolną stronę języka w pobliżu nerwu językowo-gardłowego. Po pięciu sekundach powoli wstrzyknąć inokulum.Pozostaw igłę w miejscu przez kolejne pięć sekund, aby upewnić się, że inokulum przeniknęło do tkanki, a następnie ostrożnie wyjmij igłę. Po wstrzyknięciu zwolnij zwierzę i pozostaw je na płycie grzewczej pod stałym nadzorem aż do całkowitego powrotu do sprawności. W przypadku wstrzykiwań dosytronikalnych krótko narkotyzuj zwierzęta w komorze anestezjologicznej izofluranem.Ponownie uciśnij palec zwierzęcia i upewnij się, że nie cofa kończyny tylnej, aby potwierdzić prawidłowe działanie znieczulenia. Napełnij jednorazową strzykawkę hipodermiczną o rozmiarze 27 G 50 µL sonikowanych włókien alfa-synukleiny lub PBS. Przytrzymaj zwierzę w pozycji grzbietowej, głową skierowaną w stronę przeciwną do badacza i nachyloną w dół pod kątem około 45 stopni.Wstrzyknij preparat bezpośrednio do otrzewnej myszy, uważając, aby nie przebić jelita cienkiego ani kątnicy znajdujących się za ścianą brzucha. Monitoruj zwierzęta aż do momentu wybudzenia z narkozy. Przed obrazowaniem ogól myszy znieczulonych izofluranem należy ogolić i poddać depilacji.Zafarbuj uszy na czarno za pomocą niepodrażniającego markera, aby zablokować niespecyficzną bioluminescencję. Zważ zwierzęta przed iniekcją. Następnie oblicz dokładną objętość D-lucyferyny do wstrzyknięcia w dawce 150 mg na kg masy ciała.Wstrzyknij do jamy otrzchłonnej obliczoną objętość D-lucyferyny, a następnie umieść każde zwierzę z powrotem w komorze anestezjologicznej. Uruchom oprogramowanie do obrazowania. Po osiągnięciu przez system obrazowania temperatury roboczej zainicjuj system, klikając przycisk Initialize w panelu sterowania.Następnie wybierz przyciski Luminescent i Photograph. Ustaw czas ekspozycji na 60 seconds, Binning na medium, F/Stop na one oraz EM gain na off. Wybierz Block, a następnie Open.Następnie w zakładce subject height wybierz wartość 1,50 z menu rozwijanego. Dziesięć minut po iniekcji D-lucyferyny umieść zwierzęta na płycie grzewczej w komorze obrazowania i upewnij się, że ich mięśnie są prawidłowo umieszczone w wylocie anestezji. Przełącz przepływ izofluranu z komory inhalacyjnej do komory obrazowania, a następnie szczelnie zamknij drzwi komory obrazowania.Kliknij przycisk acquire, aby zmierzyć bioluminescencję, co trwa 60 sekund. Zatrzymaj przepływ izofluranu, a następnie zwróć zwierzęta do ich klatek. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby ilościowo określić bioluminescencję, otwierając menu palety narzędzi i wybierając ROI Tools.W polu typ wybierz Measurement ROI. W narzędziach ROI (ROI Tools) kliknij narzędzie koła i z menu rozwijanego wybierz liczbę obszarów ROI do narysowania. Optymalnie trzy dla trzech myszy.Na obrazie kliknij prawym przyciskiem myszy każdy obszar zainteresowania (ROI) i w ustawieniach właściwości dostosuj szerokość oraz wysokość do 1,25 centymetra. Umieść każdy ROI nad obszarem mózgu, który jest kwantyfikowany. W lewym górnym rogu obrazu w panelu jednostek wybierz promieniowanie w fotonach.Następnie otwórz menu palety narzędzi. Wybierz opcję dostosowywania obrazu i ustaw minimum oraz maksimum skali kolorów. Na przykład od 200 000 do jednego miliona.Na koniec w menu Plik kliknij Zapisz, aby zapisać dane. Jak widać tutaj, po wtryśnięciu do jamy otrzewnowej włókien alfa-synukleiny, u czterech z pięciu transgenicznych myszy A53T synuclein GFAP z reporterem lucyferazy rozwinęła się choroba neurologiczna w ciągu 229 dni, co zaznaczono fioletowymi kwadratami. Jednak tylko u jednej z pięciu myszy z wtryśnięciem drogą podjęzykową rozwinęła się choroba neurologiczna w ciągu 285 dni, co zaznaczono zielonymi kółkami.Obrazowanie bioluminescencyjne wykazało, że myszy transgeniczne emitowały zwiększoną bioluminescencję z mózgów i rdzeni kręgowych krótko przed wystąpieniem objawów choroby neurologicznej. Bioluminescencja ta była bardziej wyraźna po wstrzyknięciu domięśniowym i nie występowała po wstrzyknięciu PBS, co sugeruje brak gliozy astrocytarnej. Rycina przedstawia bioluminescencję w mózgach myszy transgenicznych w czasie po wstrzyknięciu domięśniowym włókien alfa-synukleiny.Jak pokazują niebieskie, zielone, brązowe i pomarańczowe kółka. Podwyższone poziomy bioluminescencji powyżej progu 2 milionów fotonów na sekundę na centymetr kwadratowy na steradian zaobserwowano kilka tygodni przed wystąpieniem neurologicznych objawów choroby u tych czterech osobniczych myszy. Jedno z pięciu zwierząt wykazało również podwyższone poziomy bioluminescencji krótko przed śmiercią, 285 dni po wewnątrzjęzykowym wstrzyknięciu fibryli alfa-synukleiny.W przeciwieństwie do nich, u zdrowych myszy kontrolnych wstrzykniętych PBS oraz u jednego zwierzęcia, u którego nie rozwinęła się choroba po wstrzyknięciu dootrzewnowym, z włóknami alfa-synukleiny zaznaczonymi czerwonymi okręgami, sygnał bioluminescencyjny pozostał poniżej progu w okresie obserwacji. Barwienie immunofluorescencyjne przekrojów mózgu chorych zwierząt przeciwciałami przeciwko GFAP i Iba1 potwierdziło neurostan zapalny z mikrogleozą i reaktywnymi astrocytami w obszarach z odkładami alfa-synukleiny. Zdrowe zwierzęta, u których nie nagromadziły się odkłady alfa-synukleiny, wykazały słabe barwienie dla GFAP i Iba1.Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, proces ten może zająć mniej niż jedną godzinę. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się neurodegeneracją do nieinwazyjnego badania stanu zapalnego układu nerwowego w ośrodkowym układzie nerwowym myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykonywać obwodowe wstrzyknięcia włókien alfa-synukleiny u myszy oraz jak przeprowadzać obrazowanie bioluminescencyjne w celu monitorowania stanu zapalnego OUN.Ogólnym celem procedury jest obwodowe wywołanie choroby neurologicznej poprzez wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny do języka lub do jamy otrzewnej oraz nieinwazyjne obrazowanie indukcji stanu zapalnego układu nerwowego w czasie.

bioluminescence-imaging-neuroinflammation-transgenic-mice-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Choroba Parkinsona była wiązana z ekspozycją na pestycydy. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika żołądkowego w pożądanym stężeniu oraz metodę analizy ich wpływu na gromadzenie się alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym.

Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Ten film pokazuje wstrzyknięcie włókienek alfa-synukleiny myszowi w celu wywołania zapalenia nerwów. Włókienka są wstrzykiwane dootrzewnowo transgenicznej myszy wykazującej ekspresję zmutowanych białek alfa-synukleiny. Po dotarciu do ośrodkowego układu nerwowego fibryle wnikają do neuronów i indukują agregację zmutowanych białek. Agregaty rozprzestrzeniają się na sąsiednie neurony, mikroglej i astrocyty. Rozpoznanie agregatów powoduje, że mikroglej indukuje zapalenie nerwów, uszkadzając neurony.

Indukcja zapalenia nerwów u myszy poprzez wstrzyknięcie włókien alfa-synukleiny

Źródło: Breid, S.,  et. al. Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókienek alfa-synukleiny. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych, prezentując reakcje lucyferazy-lucyferyny w aktywowanych astrocytach. Protokół umożliwia nieinwazyjną kwantyfikację aktywacji astrocytarnej, wspomagając badania nad zapaleniem OUN i skutecznością terapeutyczną.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia nerwów u myszy transgenicznej

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Źródło: Schmitz, K., et al., Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy. J. Vis. Exp. (2017).Ten film pokazuje metodę wizualizacji i monitorowania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego lub zapalenia nerwu wzrokowego wywołanego EAE za pomocą obrazowanie bioluminescencyjne. Obejmuje to pozycjonowanie myszy, wstrzykiwanie odczynnika i przechwytywanie sekwencyjnych...

Obrazowanie bioluminescencyjne w modelu myszy EAE

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Pokazujemy technikę obrazowania in vivo na żywo bioluminescencji i bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w eksperymentalnym modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) dla stwardnienia rozsianego u myszy SJL/J.

Bioluminescencja i obrazowanie w bliskiej podczerwieni zapalenia nerwu wzrokowego i zapalenia mózgu w modelu EAE stwardnienia rozsianego u myszy

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Poznaj metodę obrazowania bioluminescencyjnego do ilościowej oceny neurozapalenia w modelu choroby Parkinsona u myszy po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny. Technika umożliwia nieinwazyjny monitoring zapalenia układu nerwowego.

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie bioluminescencyjne zapalenia układu nerwowego u myszy transgenicznych po obwodowej inokulacji włókien alfa-synukleiny

Przeglądaj więcej filmów