System hodowli narządów tłuszczowych u Aedes aegypti, wektora wirusa Zika

Cześć, nazywam się Immo Hansen i pracuję w laboratorium fizjologii wektorów molekularnych na Uniwersytecie Stanowym w Nowym Meksyku. System hodowli ciała tłuszczowego komarów, który dzisiaj zademonstrujemy, to system hodowli narządów in vitro, którego używamy w naszym laboratorium do badania fizjologii i metabolizmu żywej tkanki tłuszczowej przyczepionej do ścian brzucha komara. Ciało tłuszczowe owada jest narządem, w którym zachodzi wiele procesów metabolicznych.

Jego funkcje odzwierciedlają funkcje wątroby i tkanki tłuszczowej u kręgowców. Wykorzystaliśmy ten system do zbadania regulacji produkcji białka żółtkowego i mechanizmów pobierania składników odżywczych przez komara Aedis aegypti wywołującego żółtą febrę. Aedi aegypti jest głównym wektorem arbowirusów, takich jak denga, chikungunya i zika.

Ciało tłuszczowe komara jest jedynym źródłem białek żółtkowych u komarów. Ten protokół wideo demonstruje system hodowli tłuszczu komarów in vitro i pokazuje kilka eksperymentalnych zastosowań systemu. Protokół, który będziemy demonstrować, składa się z wielu części.

W pierwszej kolejności będziemy przygotowywać roztwory i odczynniki niezbędne dla systemu hodowli ciała tłuszczowego. Po drugie, przeprowadzimy sekcje komarów w celu wyizolowania ciał tłuszczowych. Następnie, ostatnia rzecz, przeniesiemy izolowane ciała tłuszczowe do pożywki wzbogaconej w aminokwasy, aby aktywować syntezę białek żółtka.

Istnieje kilka dalszych zastosowań, które można wykonać po hodowli ciała tłuszczowego. Dzisiaj przeprowadzimy hodowlę tkanki tłuszczowej, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji. Porównamy dwie próbki, próbkę niestymulowaną z jedną próbką stymulowaną aminokwasami i ekdyzonem.

Dodatkowe materiały i sprzęt, które będą potrzebne, to aspirator z fiolką do zbierania komarów, muchownica CO2 podłączona do butli z gazem CO2, etanol do czyszczenia muchy, mikroskop stereoskopowy ze źródłem światła, mikronożyczki do preparacji, pęseta z cienką końcówką i płytki 96-dołkowe. Aby przygotować się do hodowli ciała tłuszczowego, należy przygotować trzy roztwory podstawowe i odczynniki: roztwór podstawowy aminokwasów, roztwór podstawowy soli fizjologicznej Aedes i roztwór podstawowy wapnia. Roztwór podstawowy soli fizjologicznej Aedes i roztwór podstawowy wapnia łączy się w celu wytworzenia pożywki do hodowli ciała tłuszczowego.

Komary użyte w tym eksperymencie powinny mieć co najmniej trzy dni po wzejściu. Za pomocą aspiratora zasilanego bateryjnie zbierz komary do fiolki do pobrania. Umieść fiolkę z próbką na podkładce CO2 w celu znieczulenia komarów.

Alternatywnie do znieczulenia komarów można użyć lodu. Odrzuć wszystkie samce przed rozpoczęciem sekcji. Najpierw ustaw ostrość mikroskopu preparacyjnego za pomocą komara testowego, aby zapewnić widoczność.

Po ustawieniu ostrości mikroskopu umieść wklęsłe szkiełko na mikroskopie i umieść dwie krople APS na środku. APS pomaga w utrzymaniu komara w stanie podwyższonym i zbieraniu różnych narządów komarów. Wybierz komara za pomocą kleszczy, podnosząc komara za nogi.

Zdejmij nogi. Trzymając komara za klatkę piersiową lewą ręką, użyj innych kleszczy, aby chwycić komara za ostatnie dwa lub trzy segmenty brzucha i delikatnie pociągnij, aby go usunąć. To działanie powinno usunąć jajniki, kanaliki malpighiego, tylne jelito, jelito środkowe i plon.

Po usunięciu narządów użyj nożyczek sprężynowych, aby zakończyć sekcję ciała tłuszczowego. Włóż jedno ostrze do otworu, który powstał po usunięciu ostatnich dwóch do trzech segmentów brzucha i przetnij brzuch wzdłuż, aż dotrze do segmentu poniżej klatki piersiowej. Po nacięciu brzuch powinien rozszerzać się na zewnątrz.

Kolejne nacięcie wykonuje się bocznie w poprzek górnej części brzucha, gdzie zakończyło się pierwsze nacięcie. Po nacięciach brzuch otwiera się i unosi naskórkiem do góry, a ciała tłuszczowe spoczywają w APS. Gdy ciała tłuszczowe zrównoważą się w roztworze APS przez co najmniej pół godziny, można je następnie przenieść do pożywki do hodowli ciał tłuszczowych.

Aby pobudzić ciała tłuszczowe do rozpoczęcia ekspresji genów białka żółtka, przenosimy je do pożywki o wysokim poziomie wolnych aminokwasów i hormonu steroidowego owadów, 20-hydroksyekdyzonu. Po przeniesieniu ciała tłuszczowe są inkubowane przez sześć godzin w pożywce. Po okresie inkubacji ciała tłuszczowe przenosi się do probówki eppendorfa z buforem odpowiednim do pożądanych analiz.

W zależności od celu eksperymentalnego, ciała tłuszczowe mogą być wykorzystane w kilku kolejnych protokołach, takich jak qPCR, Western Bloc, proteomika, metabolomika lub sekwencja RNA. Na przykład przeprowadziliśmy eksperyment z kulturą ciała grubego i stymulowaliśmy izolowane ciała tłuszczowe poprzez inkubację ich na roztworze zawierającym zrównoważoną mieszaninę wszystkich 20 naturalnie występujących aminokwasów i hormonu steroidowego owadów 20-hydroksyekdyzonu przez sześć godzin, podczas gdy kontrolne ciała tłuszczowe inkubowano na PS przez równy okres czasu. Ten rysunek przedstawia wyniki analizy sekwencyjnej RNA w naszym eksperymencie.

Mapa cieplna wskazuje poziomy ekspresji genów 1256 genów ulegających ekspresji w hodowanych ciałach tłuszczowych pod wpływem dwóch różnych zabiegów. Wszystkie te geny znacząco zmieniły poziomy ekspresji między dwoma terapiami. Poniższa tabela przedstawia dziesięć najbardziej regulowanych genów po aktywacji hodowanych ciał tłuszczowych aminokwasami i 20-hydroksyekdyzonem.

Zgodnie z oczekiwaniami, większość z tych genów to geny białka żółtka. Dziękujemy za zainteresowanie kulturą ciała otłuszczonego komarów.