Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Chirag Vasavda; Nicholas W. Zaccor; Paul C. Scherer; Charlotte J. Sumner; Solomon H. Snyder

doi:10.3791/55561

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biochemistry

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Full Text

17,266 Views

10:13 min

June 9, 2017

DOI: 10.3791/55561-v

Chirag Vasavda*¹, Nicholas W. Zaccor*¹, Paul C. Scherer¹, Charlotte J. Sumner^1,2, Solomon H. Snyder^1,3,4

¹The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience,Johns Hopkins University School of Medicine, ²Department of Neurology and neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine, ³Departments of Pharmacology and Molecular Sciences,Johns Hopkins University School of Medicine, ⁴Department of Psychiatry and Behavioral Sciences,Johns Hopkins University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [³⁵S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([³⁵S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie błon komórkowych zawierających receptory sprzężone z białkiem G lub GPCR oraz zbadanie farmakologii GPCR przy użyciu funkcjonalnego eseju wiążącego GTP. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biochemii dotyczące właściwości farmakologicznych ustalonych lub osieroconych receptorów sprzężonych z białkiem G. Główną zaletą jest to, że jest prosty, szybki i mierzy najbardziej proksymalne zdarzenie w sygnalizacji receptorów sprzężonych z białkiem G.

Najpierw umieść ludzkie embrionalne komórki nerkowe na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej w 10 mililitrach kompletnego DMEM. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia zbiegu od 70% do 80%. Po inkubacji przetacz komórki za pomocą HAMOR1 przy użyciu odpowiedniego odczynnika do transfekcji zgodnie z wytycznymi producenta.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

Słowa kluczowe: Receptor sprzężony z białkiem G GPCR test wiązania GTP izolacja błony hodowla komórkowa transfekcja liza komórek homogenizacja wirowanie