Test hamowania neuraminidazy oparty na fluorescencji w celu oceny wrażliwości wirusów grypy na grupę inhibitorów neuraminidazy leków przeciwwirusowych

Opisujemy użycie fenotypowego testu hamowania neuraminidazy opartego na fluorescencji do oceny podatności wirusów grypy A i B na inhibitory neuraminidazy klasy leków przeciwwirusowych.

Ogólnym celem tej metodologii jest ocena podatności wirusów grypy A i B na inhibitory neuraminidazy za pomocą testu opartego na fluorescencji. Metoda ta może pomóc w ustaleniu, czy wirus grypy jest oporny lub wrażliwy na klasę inhibitorów neuraminidazy leków przeciwwirusowych. Główną zasadą testu jest sprawdzenie, czy inhibitor neuraminidazy przeciwwirusowy blokuje działanie enzymu neuraminidazy.

Przed badaniem wrażliwości na leki przeciwwirusowe wirus musi zostać wyhodowany do wysokiego miana wirusa poprzez pasażowanie w kulturach komórkowych, takich jak komórki MDCK, lub w zarodkach jaj kurzych. W tej demonstracji będę używał żywych wirusów grypy A podtypów H1N1 i H3N2. Zaczynając od 96-dołkowej dolnej płytki U, dozuj 120 mikrolitrów na studzienkę nierozcieńczonych wirusów grypy z hodowli do kolumny pierwszej.

I 60 mikrolitrów jednorazowego buforu testowego zawierającego 0,1% NP40 do pozostałych 11 kolumn. Za pomocą pipety wielokanałowej wykonać kolejno dwa pełne rozcieńczenia na płytce, pozostawiając kolumnę 12 jako ślepą próbę zawierającą tylko jeden raz bufor do oznaczania. Przenieś 50 mikrolitrów z każdej z studzienek do przezroczystej 96-dołkowej płaskiej płyty dennej.

Dodać 50 mikrolitrów 300 mikromolowych MUNANA do dołka. I delikatnie postukaj w talerz, aby wymieszać. Następnie użyj uszczelniacza do płytek, aby przykryć płytkę, aby zapobiec parowaniu.

I inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego na dołek, aby zakończyć reakcję. I delikatnie postukaj w talerz, aby wymieszać.

Użyj fluorometru, aby odczytać płytkę. Następnie, po wykreśleniu wykresu RFU w stosunku do rozcieńczeń wirusa zgodnie z protokołem tekstowym, należy określić odpowiednie stężenie wirusów, aby ocenić podatność wirusa na inhibitory NA, wykorzystując optymalny sygnał docelowy jako punkt odniesienia, aby wybrać punkt środkowy przekroju liniowego krzywych aktywności NA wirusa. Aby przygotować 300 mikromolowców w amiwirze, rozpuść pięć miligramów zanamiwiru w 50 mililitrach dwukrotnego buforu do oznaczania.

Przygotować 300 mikromolowy karboksylan oseltamiwiru, rozpuszczając 5,8 miligrama karboksylanu oseltamiwiru w 50 mililitrach dwukrotnego buforu testowego. Rozpuścić 5,7 miligrama trójwodzianu peramiwiru w 50 mililitrach dwukrotnego buforu testowego dla stężenia podstawowego 300 mikromolowych. Następnie przygotuj 300 mikromolowy laninamiwir, rozpuszczając 5,2 miligrama w 50 mililitrach dwukrotnie bufor testowy.

Z zapasów głównych przygotować zapasy robocze dziesięciokrotnych rozcieńczeń inhibitorów NA w 50-mililitrowych probówkach wirówkowych o następujących stężeniach. Należy zwrócić uwagę na przygotowanie serii stężeń inhibitorów NA. Wszelkie nieprawidłowości w stężeniach inhibitorów NA będą widoczne w krzywych hamowania.

Używając rozcieńczeń wirusa w oparciu o aktywność NA, jak określono wcześniej w tym filmie, przygotuj dwa mililitry rozcieńczeń wirusa w jednorazowym buforze testowym zawierającym 0,1% środka powierzchniowo czynnego NP40 w bloku dołka o głębokości 96. Podczas rozcieńczania wirusa należy upewnić się, że jest on dodawany bezpośrednio do jednorazowego buforu testowego. Ma to kluczowe znaczenie zwłaszcza wtedy, gdy ilość wirusa jest bardzo niska.

Dozować wymaganą objętość inhibitorów NA do zbiornika studziennego o głębokości ośmiu głębokości. Następnie dozować 50 mikrolitrów inhibitorów NA w rozcieńczeniach od zera do 30 000 nanomolowych. Dodaj 50 mikrolitrów rozcieńczonych wirusów testowych na studzienkę do kolumn od pierwszej do 11.

I 50 mikrolitrów na studzienkę jednorazowego buforu do oznaczania do kolumny 12. Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać i przykryj, aby zapobiec parowaniu. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 45 minut.

Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów 300 mikromolowych MUNANA do każdego dołka. Następnie delikatnie postukaj w talerz, aby go wymieszać i przykryć. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Dodaj 100 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki. I delikatnie postukaj w talerz, aby go wymieszać. Następnie użyj fluorometru, aby odczytać płytkę.

Aby obliczyć wartości IC50, skopiuj i wklej surowe dane wyjściowe fluorometru do arkusza kalkulacyjnego w formacie 12-kolumnowym, zaczynając od komórki A1. Otwórz oprogramowanie do dopasowywania i kliknij zakładkę eksperymentu. Wybierz alternatywne 2-lekowe próbki Fluoro 11. Kliknij zakładkę opcji i zaznacz opcję Generuj wykresy.

Kliknij ponownie opcje i wybierz zakładkę Nowy klucz. Następnie zapisz plik SEV klucza hamowania w tym samym folderze, co plik arkusza kalkulacyjnego z surowymi danymi. W pliku inhibition_key wymień wszystkie nazwy próbek poniżej ID.Jeśli testowano cztery inhibitory NA, wstaw spacje na dwa dodatkowe wiersze poniżej oseltamiwiru i wpisz peramiwir i laninamiwir.

Zapisz zmiany wprowadzone w pliku inhibition_key. Wróć do okna jasprv1.2 Inhibition Curve Fitting i wybierz plik danych raw jako plik eksperymentu. A inhibition_key jako plik klucza.

Uruchom analizę. Następnie zapisz wyniki w formatach CSV i PDF. Sprawdź wartości IS50 i kształty krzywych wygenerowane przez oprogramowanie.

Wszystkie punkty danych powinny znajdować się na krzywej lub blisko niej. Jeśli tak się nie stanie, powtórz test inhibicji NA. Jak pokazano na tej krzywej hamowania, fluorescencja przeciwko rosnącemu stężeniu inhibitora NA jest wykreślona dla wirusa A(H1N1)pdn09, A/Perth/82/2015.

IC50 jest wskazany tutaj. Wynik normalnego hamowania, zmniejszonego hamowania lub wysoce zmniejszonego hamowania przypisuje się badanym wirusom poprzez porównanie IC50 z medianą. Mediana wartości IC50 powinna być wyznaczona w każdym laboratorium na podstawie danych uzyskanych z badania wirusów z normalnym hamowaniem.

Przykład mediany wartości IC50 wyznaczonej w Centrum Współpracy WHO ds. Grypy w Melbourne dla poszczególnych typów i podtypów. W przypadku wirusów grypy typu A normalne wirusy hamujące to te, których wartości IC50 są mniejsze niż 10 razy w porównaniu z medianą odniesienia IC50 dla ich odpowiedniego podtypu. Wirusy o obniżonej inhibicji to te, których wartości IC50 są od 10 do 100 razy wyższe od mediany referencyjnej IC50 dla ich odpowiednich podtypów.

Podczas gdy wirusy o wysokim stopniu zahamowania mają wartości IC50 100-krotnie wyższe niż mediana referencyjna IC50. W przypadku grypy typu B normalne wirusy hamujące mają wartości IC50 mniej niż pięciokrotnie w porównaniu z referencyjną medianą IC50. Wirusy o zmniejszonej inhibicji spadają od pięciu do 50 razy, a wirusy HRI mają wartości 50 razy wyższe niż mediana referencyjna IC50.

Poniższa tabela przedstawia listę substytucji aminokwasów NA, które zostały wykryte w ciągu ostatnich pięciu lat, a które powodują zmniejszone hamowanie inhibitorów neuraminidazy. Test inhibicji NA oparty na fluorescencji pokazany w tym filmie jest bardzo solidnym i powtarzalnym testem. Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu protokołu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić wrażliwość wirusów grypy na klasę inhibitorów neuraminidazy leków przeciwwirusowych.