Name: Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u Danio rerio. Ta metoda pozwala ocenić steatozę wątroby i obrzęk naczyń, wspierając badania nad chorobami alkoholowymi wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Katy Murray z Międzynarodowego Centrum Zasobów Zebrafish; dr Stacey Huppert i Kari Huppert z CCHMC za ich pomocne porady dotyczące protokołu; oraz służbie weterynaryjnej CCHMC za opiekę nad rybami. Praca ta była wspierana przez R00AA020514 grantu NIH oraz grant badawczy z Centrum Genomiki Pediatrycznej w CCHMC (do CY). Projekt był również częściowo wspierany przez grant NIH P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) z Digestive Disease Research Core Center w Cincinnati.

<ol><li>Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoon%2C+YH+%22Surveillance+report+%23100%3A+Liver+cirrhosis+mortality+in+the+United+States%3A+National%2C+State%2C+and+regional+trends%22">Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends</a>. , National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism. Bethesda, MD. 2000-2011 (2014).</li>
<li>Singal, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+frequency+and+outcomes+of+liver+transplantation+based+on+etiology+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease.</a> Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).</li>
<li>Louvet, A., Mathurin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+disease%3A+mechanisms+of+injury+and+targeted+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).</li>
<li>Ki, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+treatment+ameliorates+alcoholic+liver+injury+in+a+murine+model+of+chronic-binge+ethanol+feeding%3A+role+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3.</a> Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+differences+in+liver+injury+and+one-carbon+metabolism+in+alcohol-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice.</a> Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+ethanol+exposure+potentiates+lipopolysaccharide+liver+injury+despite+inhibiting+Jun+N-terminal+kinase+and+caspase+3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation.</a> J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).</li>
<li>Leo, M. A., Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+fibrosis+after+long-term+administration+of+ethanol+and+moderate+vitamin+A+supplementation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat.</a> Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+and+progressive+steatosis+and+focal+necrosis+in+rat+liver+induced+by+continuous+intragastric+infusion+of+ethanol+and+low+fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet.</a> Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).</li>
<li>Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragastric+ethanol+infusion+model+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intragastric ethanol infusion model in rodents.</a> Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).</li>
<li>Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinks+like+a+fish%3A+using+zebrafish+to+understand+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).</li>
<li>Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+hepatic+dysfunction+parameters+in+two+models+of+fatty+liver+disease+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae.</a> Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Animal+Model+for+Alcoholic+Liver+Disease+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish.</a> Zebrafish. , (2015).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+metabolism+and+oxidative+stress+are+required+for+unfolded+protein+response+activation+and+steatosis+in+zebrafish+with+alcoholic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3407311/">The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. , (2012).</li>
<li>Lassen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+baculovirus+expression%2C+and+tissue+distribution+of+the+zebrafish+aldehyde+dehydrogenase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2.</a> Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).</li>
<li>Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+alcohol+dehydrogenases+share+common+ancestry+with+mammalian+class+I%2C+II%2C+IV%2C+and+V+alcohol+dehydrogenase+genes+but+have+distinct+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics.</a> J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+signaling+facilitates+liver+repair+from+acute+ethanol-induced+injury+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish.</a> Dis Model Mech. , (2016).</li>
<li>Vonghia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Acute alcohol intoxication.</a> Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).</li>
<li>Wittekind, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+staining+for+routine+diagnostic+pathology+including+the+role+of+tannic+acid.+1.+Value+and+limitations+of+the+hematoxylin-eosin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain.</a> Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cld.172/full">Histopathology of alcoholic liver disease.</a> Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).</li>
<li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Jagged-mediated+Notch+signaling+disrupts+zebrafish+biliary+development+and+generates+multi-organ+defects+compatible+with+an+Alagille+syndrome+phenocopy%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy.</a> Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).</li>
<li>Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Ethanol-induced+Fibrotic+Liver+Model+in+Zebrafish+to+Study+Progenitor+Cell-mediated+Hepatocyte+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+rhythms+of+lipid+metabolic+gene+expression+in+zebra+fish+liver%3A+Response+to+light%2Fdark+and+feeding+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiol+Int%22%5BJournal%5D)">Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles.</a> Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).</li>
<li>van der Velden, Y. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serine-threonine+kinase+LKB1+is+essential+for+survival+under+energetic+stress+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Obecny protokół opisuje szczegółową procedurę leczenia ostrym etanolem larw danio pręgowanego i późniejsze analizy histopatologiczne z barwieniem H&E. Ostre leczenie etanolem należy przeprowadzić nie wcześniej niż 96 godzin po zapłodnieniu, ponieważ jest to etap, w którym wątroba danio pręgowanego zaczyna wyrażać enzymy metabolizujące alkohol13. 2% etanolu to maksymalna dawka, jaką larwy mogą tolerować13,14. Larwy poddane działaniu etanolu...

Alkoholowa choroba wątroby (ALD), która jest spowodowana nadmiernym spożyciem alkoholu, jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności związanej z alkoholem. W Stanach Zjednoczonych prawie połowa zgonów z powodu chorób wątroby dotyczy alkoholu1, a ALD jest odpowiedzialny za prawie 1 na 3 przeszczepy wątroby2. ALD ma szerokie spektrum. Stłuszczenie, które charakteryzuje się nadmiernym nagromadzeniem lipidów w hepatocytach, występuje we wczesnym etapie intensywnego picia i jest odwracalne po zaprzestaniu spożywania alkoholu. Pod wpływem czynników genetycznych i środowiskowych oraz ciągłego spożywania alkoholu, stłuszczenie wątroby może przekształcić się w alkoholowe zapalenie wątroby, a ostatecznie w marskość wątroby 3. Badania z wykorzystaniem modeli ALD u gryzoni dostarczyły istotnych informacji na temat choroby, ale mają ograniczenia (omówione w referencji3). Doustne karmienie dietą alkoholową powoduje stłuszczenie tylko u gryzoni4,5. Rozwój stanu zapalnego i zwłóknienia wymaga albo drugiej zniewagi6,7 lub przewlekłej infuzji dożołądkowej, która jest inwazyjna i wymagająca technicznie8,9. U danio pręgowanego teleost dochodzi również do uszkodzenia wątroby w odpowiedzi zarówno na przewlekłe, jak i ostre leczenie alkoholowe10,11,12,13,14,15. W szczególności larwa danio pręgowanego stanowi atrakcyjny uzupełniający organizm modelowy, w którym bada się ostre alkoholowe uszkodzenie wątroby10,11,13,15. Wątroba danio pręgowanego jest funkcjonalna i wytwarza kluczowe enzymy do metabolizmu etanolu przez 4 dni po zapłodnieniu (dpf)13,16,17. Etanol może być bezpośrednio dodawany do wody, a ekspozycja na 2% etanolu przez 24 godziny jest wystarczająca do wywołania stłuszczenia wątroby i reakcji fibrogennych u larw danio pręgowanego13,15.
Doniesiono, że leczenie 2% etanolem przez 24 godziny spowodowało stężenie etanolu w tkance wynoszące 80 mM u larw danio pręgowanego13. Inni wykazali, że larwy tolerują takie stężenie, a fenotypy wątroby obserwowane u leczonych zwierząt są specyficzne dla ekspozycji na etanol11,13,15,18. Ponieważ jednak 80 mM jest prawie śmiertelne u ludzi19, ważne jest, aby ocenić histologię wątroby danio pręgowanego leczonego etanolem i określić fizjologiczne znaczenie dla ludzi.
Szybki rozwój zewnętrzny i przezroczystość larw danio pręgowanego umożliwiają scharakteryzowanie działania alkoholu w wątrobie w czasie rzeczywistym i w ustalonych próbkach. Dostępność specyficznych dla typu komórek fluorescencyjnych linii transgenicznych oraz najnowsze postępy w mikroskopii konfokalnej ułatwiają badanie, w jaki sposób różne typy komórek wątroby zmieniają swoją morfologię i zachowanie w odpowiedzi na ostre leczenie etanolem11,15. Jednak obrazowanie konfokalne fluorescencyjnego transgenicznego danio pręgowanego nie może całkowicie zastąpić barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) podczas badania histologii wątroby. Znakowanie wszystkich typów komórek wątroby w tym samym czasie przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego wymaga wytworzenia indywidualnych linii transgenicznych, z których każda znakuje jeden typ komórek wątroby unikalnym fluoroforem. Wprowadzenie różnych środowisk transgenicznych do tej samej ryby wymaga hodowli wielu pokoleń, co jest czasochłonne i kosztowne. Dodatkowe barwienie immunofluorescencyjne jest potrzebne do wykrycia składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Z drugiej strony, barwienie H&E jednocześnie oznacza wszystkie typy komórek wątroby i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, zapewniając w ten sposób przegląd klasy wątroba<sup="xref">20. Co więcej, łatwo ujawnia kilka histopatologicznych cech chorób wątroby, takich jak śmierć hepatocytów, stłuszczenie i zwłóknienie. Chociaż H&E jest rutynowym barwnikiem w histologii wątroby ssaków, nie jest powszechnie stosowany w badaniach nad wątrobą danio pręgowanego, a protokół jest mniej ugruntowany.
Ta praca opisuje protokół leczenia ostrym etanolem u larw danio pręgowanego oraz dalszych analiz histologicznych z barwieniem H&E. Protokół barwienia H&E może być stosowany we wszystkich badaniach nad rozwojem i funkcją wątroby. Ponadto skrawki parafiny mogą być wykorzystywane do immunohistochemii, a także do innych specjalnych barwników w patologii wątroby, w tym barwienia trichromowego, barwienia retikuliną itp.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówki wirówkowe</td><td>E & K Scientific</td><td>280150</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>VWR International</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>VWR International</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol (EtOH)</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2801</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Nowicjusz Dostawa</td><td>10010A</td><td>Drażniący</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Research Products International</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowy uchwyt na słoiki</td><td>Dostawa dla nowicjuszy</td><td>5300JRK</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologiczne szalki Petriego z pokrywką</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki do biopsji</td><td>Simport</td><td>M476.1</td><td></td></tr><tr><td>Ładowane szkiełka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-16</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczyste nośniki montażowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>8310-16</td><td>Można zastąpić innymi przezroczystymi mediami montażowymi</td></tr><tr><td>Komercyjne sole morskie</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrza mikrotomu</td><td>Fisher Scientific</td><td>4280L</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Mz 95</td><td></td></tr><tr><td>Zamknięty procesor tkanek</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300 S Zestaw</td><td></td></tr><tr><td>barwników Eozyna-Floksyna</td><td>Dla nowicjuszy</td><td>1082A</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>roztwór formaldehydu, odczynnik ACS, 37 % WT. w H20, zawiera 10 - 15% metanolu jako stabilizator (zapobiegający polimeryzacji)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>Podejrzenie działania rakotwórczego; drażniący</td></tr><tr><td>Formalina, Buforowany, 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Podejrzewany czynnik rakotwórczy; drażniący</td></tr><tr><td>Butelka z podziałką</td><td>VWR International</td><td>16159-520</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoksylina</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s212</td><td></td></tr><tr><td>Drażniące formy histologiczne</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło z gorącą płytą/mieszadłem</td><td>VWR International</td><td>47751-148</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144</td><td>Inkubator substancji drażniących</td></tr><tr><td></td><td>VWR International</td><td>97058-220</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD Medical</td><td>BD-309301</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop złożony</td><td>Mikroskopia Carl Zeiss</td><td>491912-9850-000</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Nowicjusz Dostawa</td><td>12094E</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>błękit metylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Drażniący mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica Jung BioCut 2035&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik nutujący</td><td>VWR International</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td>Podejrzenie działania rakotwórczego; drażniący</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>VWR International</td><td>53283-916</td><td></td></tr><tr><td>Pompka do pipet (10 ml)</td><td>VWR International</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, monozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia szkiełek</td><td>Dostawa dla nowicjuszy</td><td>5300KIT</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Fisher BioOdczynniki</td><td>S318-500</td><td>Bardzo niebezpieczne</td></tr><tr><td>Fosforan sodu, dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Sitko ze stali nierdzewnej (średnica 5 cali)</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>L0906045in</td><td></td></tr><tr><td>Kasety na</td><td>tkanki Simport</td><td>M505.12</td><td></td></tr><tr><td>Centrum do zatapiania tkanek</td><td>Sakura Finetek USA Inc</td><td>#5100</td><td></td></tr><tr><td>Wycieraczki do tkanek, 1-warstwowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>137117M</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina w proszku/sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Drażniąca</td></tr><tr><td>baza Tris, podstawowy wzorzec i bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do mycia, niska gęstość polietylen, szerokie usta</td><td>Nalge Nunc International</td><td>2402-0750</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Drażniący</td></tr></tbody></table>

analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alkoholowa choroba wątroby (ALD) odnosi się do uszkodzenia wątroby spowodowanego ostrym lub przewlekłym nadużywaniem alkoholu. Jest to jedna z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności związanej z alkoholem i dotyka ponad 2 miliony ludzi w Stanach Zjednoczonych. Lepsze zrozumienie mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw uszkodzenia wątroby wywołanego alkoholem ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznego leczenia ALD. Larwy danio pręgowanego wykazują stłuszczenie wątroby i fibrogenezę już po 24 godzinach ekspozycji na 2% etanol, co czyni je przydatnymi w badaniu ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby. W pracy opisano procedurę leczenia etanolem w ostrym przypadku u larw danio pręgowanego i wykazano, że powoduje on stłuszczenie i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby. Opisano również szczegółowy protokół barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), który jest zoptymalizowany pod kątem analizy histologicznej wątroby larw danio pręgowanego. Barwienie H&E ma kilka unikalnych zalet w porównaniu z immunofluorescencją, ponieważ oznacza wszystkie komórki wątroby i składniki zewnątrzkomórkowe jednocześnie i może łatwo wykryć uszkodzenie wątroby, takie jak stłuszczenie i zwłóknienie. Biorąc pod uwagę rosnące wykorzystanie danio pręgowanego w modelowaniu uszkodzeń wątroby wywołanych toksynami i wirusami, a także dziedzicznych chorób wątroby, protokół ten służy jako odniesienie dla analiz histologicznych przeprowadzanych we wszystkich tych badaniach.

10% buforowana formalina oraz 4% paraformaldehyd (PFA) to dwa najczęściej stosowane utrwalacze w praktyce histologicznej. Nie dają one jednak optymalnych wyników utrwalania w przypadku tkanki wątroby danio pręgowanego (Rycina 1 oraz Tabela 1). Utrwalanie 10% formaliną lub 4% PFA często prowadzi do kurczenia się tkanek, co powoduje powstanie dużych szczelin między wątrobą a tkankami otaczającymi (Rycina 1A, <stron...

Ten protokół opisuje analizy histologiczne wątroby larw danio pręgowanego, które były leczone 2% etanolem przez 24 godziny. Takie ostre leczenie etanolem powoduje stłuszczenie wątroby i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena patohistologii wątroby larwy danio-pręgowanego wywołanej ostrymi obrażeniami alkoholowymi. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie alkoholowej choroby wątroby, takie jak cechy histologiczne ostrego uszkodzenia wątroby przez alkohol oraz w jakim stopniu reakcje wątroby danio-pręgowanego na ostre uszkodzenie alkoholem przypominają te obserwowane u ludzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że zastosowana przez nas terapia etanolem indukuje silniejsze odpowiedzi niż inne opublikowane metody.Ponadto nasz protokół histologiczny poprawia integralność tkanek na preparatach. Rozpocznij od wybrania za pomocą pipety Pasteura do 40 larw w 96 godzinie po zapłodnieniu z nadmuchniętymi pęcherzami pławnymi. Rozdziel je równomiernie do dwóch nowych naczyń Petriego.Usunąć jak największą ilość pozostałej wody z jaj, a następnie do jednej szalki dodać wodę z jaj zawierającą 2% etanol, zachowując gęstość jednej larwy na mililitr. Do drugiej szalki dodać taką samą ilość wody z jaj bez etanolu, która będzie służyć jako kontrola. Przechowywać larwy kontrolne oraz poddane działaniu etanolu w pomieszczeniu dla ryb przez 24 godziny.Po upł

histological-analyses-of-acute-alcoholic-liver-injury-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji1. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem.  W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.

Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Poznaj analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u Danio rerio. Ta metoda pozwala ocenić steatozę wątroby i obrzęk naczyń, wspierając badania nad chorobami alkoholowymi wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów