In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1^gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie spektralnej optycznej koherentnej tomografii koherentnej i skaningowej oftalmoskopii laserowej w celu uzyskania informacji na temat odpowiednio grubości siatkówki i rozmieszczenia komórek mikrogleju. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie okulistyki eksperymentalnej dotyczące korelacji między nieprawidłowościami siatkówki a akumulacją komórek mikrogleju. Główną zaletą tej techniki jest to, że informacje te można uzyskać w czasie rzeczywistym w sposób nieinwazyjny.

Po potwierdzeniu braku odpowiedzi na wymaz z rogówki, umieść mysz w pozycji leżącej po lewej stronie platformy, z prawą orbitą skierowaną w stronę soczewki. Nałóż kroplę hydroksypropylometylocelulozy w sztywnej, przepuszczającej gaz soczewce kontaktowej plus cztery dioptrie na prawe oko i uruchom moduł akwizycji. W przypadku skanów B wybierz opcję Podczerwień i optyczna tomografia koherentna W obszarze Application and Structure (Zastosowanie) i structure (Zastosowanie) wybierz opcję Retina (Siatkówka) i za pomocą mikromanipulatora przesuń soczewkę w kierunku oka myszy.

Przed ustawieniem ostrości na siatkówce upewnij się, że wybrano wskaźnik Oculus dexter, a następnie użyj pokrętła ostrości, aby powiększyć siatkówkę, aż duże naczynia będą wyraźnie widoczne na obrazie dna oka po lewej stronie ekranu monitora. Użyj mikromanipulatora, aby dostosować położenie kamery, w razie potrzeby obracając pokrętło czułości, aby odpowiednio zmniejszyć lub zwiększyć jasność obrazu dna oka. Wybierz opcję Line Scan (Skanowanie liniowe) z menu Pattern (Wzór) i użyj mikromanipulatora, aby przesunąć skan B między górnym i dolnym rogiem okna skanowania optycznej tomografii koherentnej w dziedzinie spektralnej (SD-OCT).

Ustaw wartość Automatycznie w czasie rzeczywistym na co najmniej dziewięć, aby uzyskać wysoką jakość obrazu, a następnie kliknij przycisk Pobierz. Po uzyskaniu wszystkich obrazów przenieś soczewkę kontaktową z oka do świeżo zbilansowanego roztworu soli i nawodnij rogówkę świeżą kroplą hydroksypropylometylocelulozy. Po zobrazowaniu lewego oka obróć standardową optykę o 30 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby ją wyjąć i zamontuj soczewkę 55 stopni, aby przeprowadzić drugą rundę obrazowania.

Aby ocenić autofluorescencję, bez poruszania myszką, wybierz Podczerwień na panelu sterowania i skup się na dużych naczyniach siatkówki. Wybierz automatyczne obrazowanie fluorescencyjne i w razie potrzeby użyj pokrętła czułości, aby dostosować jasność obrazu. Naciśnij raz pokrętło czułości i ustaw automatyczną wartość czasu rzeczywistego na co najmniej 67.

Po osiągnięciu automatycznej wartości w czasie rzeczywistym uzyskaj obraz i naciśnij pokrętło czułości po raz drugi, aby zatrzymać uśrednianie. Dostosuj ostrość, aby uwidocznić różne warstwy siatkówki, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. Po uzyskaniu wszystkich obrazów, przenieś się do szerokokątnej soczewki 102 stopni na optykę i wyobraź sobie automatyczną fluorescencję w każdym oku, jak właśnie pokazano.

Aby ręcznie zmierzyć grubość siatkówki na każdym obrazie, kliknij dwukrotnie nazwę pierwszego zwierzęcia doświadczalnego, aby otworzyć skan OCT. Otwórz skan B uzyskany za pomocą soczewki 30 lub 55 stopni i wybierz profil grubości. Kliknij ikonę Edytuj segmentacje warstw.

Oprogramowanie automatycznie zidentyfikuje wewnętrzne membrany ograniczające i podstawowe. Aby ręcznie skorygować położenie membran, wybierz warstwę, która ma zostać zmodyfikowana, a także opcję czerwonego kółka. Przytrzymując wciśnięty przycisk myszy, przesuń okrąg, aby zmodyfikować linię, aż odpowiednia warstwa zostanie prawidłowo umieszczona, a następnie kliknij Zapisz i zamknij, aby wyjść z okna.

W opcji Warstwa wybierz Siatkówka i kliknij inną pozycję na diagramie, aby wyświetlić grubość siatkówki dla wybranej pozycji. Następnie zmierz grubość siatkówki i żądaną odległość od głowy nerwu wzrokowego i wyeksportuj wartości do arkusza kalkulacyjnego. W tych reprezentatywnych pojedynczych skanach SD-OCT od myszy homozygotycznej pod względem ekspresji gfp pod promotorem Cx3cr1, architektura siatkówki jest wyraźnie uwidoczniona zarówno na obrazach soczewek 30 stopni, jak i 55 stopni.

Jednak wysoki współczynnik odbicia naczyniówki obserwuje się w skanach uzyskanych za pomocą soczewki 30 stopni. Po SD-OCT skaningowa oftalmoskopia laserowa umożliwia wizualizację poszczególnych komórek mikrogleju gfp dodatnich w siatkówce za pomocą soczewki 55 stopni lub 102 stopni z większym pokryciem dna oka uzyskanym za pomocą soczewki 102 stopni. W skanach SD-OCT, po ręcznej korekcji wewnętrznych granic granicznych i błony podstawowej siatkówki, zwykle obserwuje się dobrą korelację pomiaru grubości siatkówki między soczewkami 30 i 55 stopni, gdy mierzona jest ta sama odległość od głowy nerwu wzrokowego.

Po opanowaniu tej techniki można ukończyć w mniej niż pięćdziesiąt minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny okulistyki eksperymentalnej do zbadania patologii siatkówki u małych gryzoni in vivo.