Name: Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę oznaczania zawartości glikogenu w sinicach przy użyciu selektywnej hydrolizy enzymatycznej. Technika ta jest prosta, czuła i stosowalna zarówno do szczepów dzikich, jak i zmodyfikowanych genetycznie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Nordic Energy Research (AquaFEED, projekt nr 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, projekt nr 12-131844) i Villum Fonden (projekt nr 13363)

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Kultury sinic
	<ol>
		<li>Uprawę Synechocystis sp. PCC 6803 w temperaturze 30 °C w płynie BG11 medium8, ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO2. Oświetlać kultury w sposób ciągły światłem przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych wynoszącej 50 μmol fotonów/m2/s.</li>
		<li>Uprawiaj Synechococcus sp. PCC 7002 w płynnym podłożu A+23 (można również użyć podłoża BG11), ze stałym dopływem powietrza uzupełnionego 1% (v/v) CO2 . Temperatura powinna wynosić 37 °C. Oświetlać kultury światłem w sposób ciągły przy gęstości strumienia fotonów fotosyntetycznych wynoszącej 150 μmol fotonów/m2/s.</li>
		<li>Zmierzyć gęstość optyczną (OD) kultury przy długości fali 730 nm za pomocą kuwety o ścieżce światła wynoszącej 1 cm. Jeśli wartość OD jest wyższa niż 0,8, należy dokonać odpowiednich rozcieńczeń, aby uzyskać pomiary OD, które są proporcjonalne do stężenia w komórkach. 
		UWAGA: Przedstawione poniżej protokoły są odpowiednie dla kultur płynnych, o gęstości komórek odpowiadającej wartości OD730 nm 2 lub wyższej. Gdy pożądane są hodowle w fazie wzrostu wykładniczego, które zazwyczaj mają wartość OD730 nm poniżej 1, należy skoncentrować gęstość komórek przez odwirowanie i ponowne zawieszenie w buforze lub pożywce, aby osiągnąć wartość OD730 nm 2 lub wyższą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>i odczynniki
	<ol>
		<li>Zrobić 50 mM buforu Tris-HCl o pH 8.</li>
		<li>Przygotować 50 mM buforu octanu sodu o pH 5.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 8 j./ml amyloglukozydazy w 50 mM buforze octanu sodu o pH 5.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 2 μ/ml α-amylazy w 50 mM buforze octanu sodu o pH 5.</li>
		<li>Używając wody destylowanej, przygotować roztwory wzorcowe glukozy w stężeniach od 0 do 100 μg/ml.</li>
		<li>Przygotuj odczynnik GOD-POD z zestawu do oznaczania D-glukozy (format GODPOD), postępując zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oznaczanie suchej masy komórki (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Przenieść 2 ml kultury lub zawiesiny komórek (patrz krok 1.1) do probówki o pojemności 2,0 ml i odwirować przy 6 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml wody i odwirować w temperaturze 6 000 x g i 4 °C przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml wody.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę na wstępnie zważoną aluminiową tacę. Przenieść blachę do suszarki w temperaturze 105 °C w celu wysuszenia przez noc (około 18 godzin). 
	KRYTYCZNE: Ważne jest, aby taca była obsługiwana za pomocą kleszczy, aby uniknąć przenoszenia materiału z palców. Wysuszyć pustą, wstępnie zważoną aluminiową tacę w tych samych warunkach, aby określić utratę masy tac podczas suszenia.</li>
	<li>Po wysuszeniu wyjmij blachę z piekarnika i pozwól jej wyrównać się w warunkach otoczenia przez 5 minut, a następnie zważyć ją z dokładnością do 0,0001 g. 
	UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu w przeliczeniu na suchą masę komórkową.</li>
</ol>
3. Liza komórek sinic
<ol>
	<li>Przenieść 1 ml kultury lub zawiesiny komórkowej (patrz krok 1.1) do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 6 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8 i odwirować przy 6 000 x g i 4 °C przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu Tris-HCl. Powtórz proces.</li>
	<li>Dokładnie zawiesić osad w 500 μl 50 mM buforu Tris-HCl, pH 8, 
	KRYTYCZNE: Dobrze zawiesić osad, aby uzyskać efektywną lizę komórek. Zawiesinę należy przechowywać w lodzie.</li>
	<li>Zawiesić komórki w temperaturze 4 °C, wykonując 30 cykli ultradźwięków, z których każdy trwa 30 s z częstotliwością 20 kHz o maksymalnej amplitudzie, a następnie 90 s bez nich. 
	UWAGA: Ta metoda może skutecznie lizować Synechococcus sp. PCC 7002.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, przenieś refuzję komórek do probówki z nakrętką i dodaj kulki tlenku cyrkonu do probówki, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Umieścić probówkę w homogenizatorze tkankowym i poddać komórki lizie w temperaturze 4 °C, wykonując 2 cykle ubijania, z których każdy trwa 5 minut przy ustawieniu częstotliwości 5, 
		UWAGA: Ta metoda może skutecznie lizować Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować probówkę zawierającą lizat przez 10 minut w temperaturze 6 000 x g i temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Granulka powinna składać się głównie z dużych resztek komórkowych. Jeśli istnieje znaczna liczba nieuszkodzonych komórek, powtórz krok 3.4. Utrzymać supernatant na lodzie.</li>
	<li>Określ stężenie białka za pomocą komercyjnego zestawu do oznaczania białek BCA. 
	UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu na podstawie zawartości białka.</li>
</ol>
4. Wytrącanie glikogenu
<ol>
	<li>Usunąć chlorofil a z lizatu komórkowego, mieszając 900 μl 96% (v/v) etanolu i 100 μl supernatantu z kroku 3.5 w probówce z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Po zamknięciu nakrętki podgrzewać probówkę w temperaturze 90 °C przez 10 minut za pomocą standardowego laboratoryjnego bloku grzewczego.</li>
	<li>Inkubować probówkę na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę o ciśnieniu 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 30 minut i ostrożnie usunąć sklarowany nadosad; osad zawiera glikogen. Lekko wysuszyć granulat na powietrzu, aby usunąć nadmiar etanolu. 
	KRYTYCZNY: Należy unikać nadmiernego wysuszania granulek, w przeciwnym razie trudno będzie je rozpuścić w kroku 5.1.</li>
	<li>OPCJONALNIE: Zmierzyć absorbancję supernatantu otrzymanego w kroku 4.3 przy długości fali 664 nm w celu oznaczenia zawartości chlorofilu A. Użyj współczynnika absorpcji 84,6 L/g/cm24, 
	UWAGA: Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu.</li>
</ol>
5. Hydroliza enzymatyczna i oznaczanie glikogenu
<ol>
	<li>Rozpuścić osad otrzymany w kroku 4.3 w 100 μl 50 mM octanu sodu o pH 5 i dodać 50 μl 8 U/ml amylogozydazy i 50 μl 2 U/ml α-amylazy. Dobrze wymieszaj te materiały za pomocą vortex. 
	UWAGA: Mieszanie przez pipetowanie nie jest zalecane, ponieważ granulki glikogenu są lepkie.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 60 °C na bloku grzewczym przez 2 godziny, aby umożliwić trawienie glikogenu do cząsteczek glukozy.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 10 000 x g przez 5 minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
6. Oznaczanie całkowitej zawartości glukozy za pomocą odczynnika GOD-POD
<ol>
	<li>Zmierzyć stężenie glukozy w supernatantze otrzymanym w kroku 5.3 za pomocą odczynnika GOD-POD. Przenieść 100 μl supernatantu z etapu 5.3 do studzienki na płytce 96-dołkowej. Jako kontrolę ujemną użyj 100 μl 50 mM octanu sodu o pH 5. Aby wygenerować krzywą kalibracyjną, należy również zmierzyć roztwory wzorcowe glukozy.</li>
	<li>Dodać 150 μl odczynnika GOD-POD do każdej próbki i szybko wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Inkubować płytkę statycznie w temperaturze 25 °C przez 30 minut. Zapisać wartość absorbancji przy długości fali 510 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
	<li>Obliczyć stężenie glukozy przy użyciu krzywej kalibracyjnej otrzymanej z wzorców glukozy. 
	UWAGA: Stężenie glikogenu w lizacie komórkowym jest wyrażone jako stężenie glukozy (μg/ml).</li>
</ol>

<ol><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li>
<li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717602902260">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li>
<li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li>
<li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li>
<li>Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64(2014).</li>
<li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://aem.asm.org/content/82/14/4180.long">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li>
<li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Non-coding+RNA+Ncr0700%2FPmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li>
<li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li>
<li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60111a017">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+group+2+%7Bsigma%7D+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li>
<li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Letters%22%5BJournal%5D)">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li>
<li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/242624484_Activation_and_pathway_of_glucosylglycerol_synthesis_in_the_cyanobacterium_Synechocystis_sp_PCC_6803">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li>
<li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004(2015).</li>
<li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li>
<li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li>
<li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+antagonistic+effects+of+%CE%B1-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li>
<li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li>
<li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+%28H2O2%29+scavenging+activity+of+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria%3A+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth+Res%22%5BJournal%5D)">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687987480361">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li>
<li>López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li>
<li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li>
<li>Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%3A+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li>
<li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA%2C+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li>
<li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytycznymi etapami w ramach protokołu są wytrącanie glikogenu i jego ponowne zawieszenie. Po odwirowaniu po wytrąceniu etanolu glikogen tworzy półprzezroczyste osadki, które luźno przylegają do ścianek probówek do mikrowirówek. Dlatego podczas usuwania supernatantu należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie usunąć osadu. Granulka glikogenu jest lepka, a solubilizacja może być trudna, jeśli wyschnie. Należy zauważyć, że całkowite rozpuszczenie osadu glikogenu jest ważne, ponieważ niepełne rozpuszczenie doprowadzi do nieefe...

Cyjanobakterie gromadzą glikogen jako główny magazyn węglowodanów węgla z CO2 utrwalonego w świetle w procesie fotosyntezy. Glikogen to glikan składający się z liniowego glukanu połączonego α-1,4 z gałęziami utworzonymi przez wiązania glukozylowe połączone α-1,6. Biosynteza glikogenu w sinicach rozpoczyna się od przekształcenia glukozo-6-fosforanu w ADP-glukozę poprzez sekwencyjne działanie fosfoglukutazy i pirofosforylazy ADP-glukozy. Ugrupowanie glukozy w ADP-glukozie jest przenoszone do nieredukującego końca szkieletu α-1,4-glukanu glikogenu przez jedną lub więcej syntaz glikogenu (GlgA). Następnie rozgałęziające się enzymy wprowadzają wiązanie glukozylowe połączone z α-1,6, które jest dalej rozszerzane w celu wytworzenia cząsteczki glikogenu. W ciemności glikogen jest rozkładany przez fosforylazę glikogenu, enzymy rozgałęziające glikogen, α-glukanotransferazę i fosforylazę malto-dekstrynową na fosforylowaną glukozę i wolną glukozę. Zasilają one szlaki kataboliczne, w tym oksydacyjny szlak pentozofosforanowy, szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (glikoliza) i szlak Entnera-Doudoroffa1,2,3,4.
Metabolizm glikogenu u cyjanobakterii cieszy się coraz większym zainteresowaniem w ostatnich latach ze względu na możliwość przekształcenia się cyjanobakterii w fabryki komórek mikrobiologicznych napędzanych światłem słonecznym do produkcji chemikaliów i paliw. Metabolizm glikogenu można zmodyfikować w celu zwiększenia wydajności produktów, ponieważ glikogen jest największą elastyczną pulą węgla w tych bakteriach. Przykładem jest sinica Synechococcus sp. PCC 7002, która została genetycznie zmodyfikowana w celu produkcji mannitolu; Genetyczne zakłócenie syntezy glikogenu zwiększa wydajność mannitolu 3-krotnie<klasa SUP="xref">5. Innym przykładem jest produkcja bioetanolu z Synechococcus sp. z nasyconym glikogenem dzikim typem PCC 70026. Zawartość glikogenu w komórkach typu dzikiego może wynosić do 60% suchej masy komórki podczas głodu azotu6.
Nasze zrozumienie metabolizmu i regulacji glikogenu również poszerzyło się w ostatnich latach. Podczas gdy wiadomo, że glikogen gromadzi się w świetle i jest katabolizowany w ciemności, szczegółowa kinetyka metabolizmu glikogenu podczas cyklu dziennego została ujawniona dopiero niedawno w Synechocystis sp. PCC 68037. Ponadto zidentyfikowano kilka genów wpływających na akumulację glikogenu. Godnym uwagi przykładem jest odkrycie, że przypuszczalna kinaza histydynowa PmgA i niekodujące RNA PmgR1 tworzą kaskadę regulatorową i kontrolują akumulację glikogenu. Co ciekawe, mutanty delecyjne pmgA i pmgR1 gromadzą dwa razy więcej glikogenu niż dziki szczep Synechocystis sp. PCC 68038,9. Wiadomo również, że inne elementy regulatorowe wpływają na akumulację glikogenu, w tym alternatywny czynnik sigma E i czynnik transkrypcyjny CyAbrB210,11.
Wraz ze wzrostem zainteresowania regulacją i metabolizmem glikogenu, uzasadniony jest szczegółowy protokół opisujący określanie zawartości glikogenu. W literaturze stosuje się kilka metod. Hydroliza kwasowa, po której następuje oznaczenie zawartości monosacharydów za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej anionowymiennej w połączeniu z pulsacyjnym detektorem amperometrycznym lub oznaczanie spektrometryczne po traktowaniu kwasem i fenolem są szeroko stosowanymi metodami przybliżania zawartości glikogenu9,10,12,13. Jednak wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy z anionowymiennością jest bardzo drogi i nie odróżnia glukozy pochodzącej z glikogenu od glukozy pochodzącej z innych koniugatów glikokoniugatów zawierających glukozę, takich jak sacharoza14, glucosylglycerol15 i cellulose16,17,18, o których wiadomo, że kumulują się w niektórych gatunkach sinic. Metoda kwasowo-fenolowa może być wykonywana przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Używa jednak wysoce toksycznych odczynników i nie odróżnia glukozy pochodzącej z różnych glikokoniugatów, ani nie odróżnia glukozy od innych cukrów prostych, które stanowią materiał komórkowy, takiego jak glikolipidy, lipopolisacharydy i matryce zewnątrzkomórkowe12. Warto zauważyć, że test gorący kwasowo-fenolowy jest często stosowany do oznaczania całkowitej zawartości węglowodanów, a nie do konkretnego oznaczania zawartości glukozy12. Enzymatyczna hydroliza glikogenu do glukozy przez α-amyloglukozydazę, a następnie wykrywanie glukozy za pomocą testu sprzężonego z enzymami generuje odczyt kolorymetryczny, który jest bardzo czuły i specyficzny dla glukozy pochodzącej z glikogenu. Swoistość można dodatkowo zwiększyć dzięki preferencyjnemu wytrącaniu glikogenu z lizatów komórkowych przez etanol5,8,19.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół enzymatycznego testu zawartości glikogenu w dwóch najczęściej badanych gatunkach sinic, Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002, w szczepach typu dzikiego i zmutowanych. Aby zapewnić efektywną hydrolizę, stosuje się koktajl α-amylazy i α-amyloglukozydazy8. Endodziałająca α-amylaza hydrolizuje wiązania α-1,4 w różnych glukanach do dekstrytyn, które są dalej hydrolizowane do glukozy przez egzodziałającą α-amylogozydazę20. Synergiczne działanie tych enzymów jest dobrze znane, a enzymy te są rutynowo wykorzystywane do selektywnej hydrolizy skrobi, która jest α połączonym glukanem, podobnym do glikogenu, bez wpływu na inne glikokoniuganty, takie jak celuloza, w biomasie roślinnej 21. Uwolniona glukoza jest wykrywana ilościowo po teście sprzężonym z enzymami składającym się z oksydazy glukozowej - która katalizuje redukcję tlenu do nadtlenku wodoru i utlenianie glukozy do laktonu - i peroksydazy - która wytwarza różowy barwnik chinoneiminowy z nadtlenku wodoru, związku fenolowego i 4-aminoantypiryny22.

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Czytnik mikropłytek&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>NA</td><td>Czytnik płytek Eliza</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm</td><td>Next Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Ubijak do koralików</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro Spektrofotometr UV/Visible</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>Adiustacja pH</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Amyloglykozydaza (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzym do depolimeryzacji glikogenu</td></tr><tr><td>&alfa;-Amylaza, termostabilna (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzym do depolimeryzacji glikogenu</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Standard do oznaczania glukozy</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>Do oznaczania stężeń białka</td></tr><tr><td>Aluminiowe tacki do suszenia, jednorazowe</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>Do oznaczania suchej masy komórek</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania D-glukozy (format GODPOD)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>Do oznaczania stężenia glukozy</td></tr><tr><td>Chlebki z tlenku cyrkonu, 0,15 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Koraliki do lizy komórek w Rurki RINO Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td></td><td>Next Advance</td><td>NA</td><td>do lizy komórek w Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyjanobakterie gromadzą glikogen jako główny wewnątrzkomórkowy magazyn węgla i energii podczas fotosyntezy. Ostatnie osiągnięcia w badaniach zwróciły uwagę na złożone mechanizmy metabolizmu glikogenu, w tym cykl diel biosyntezy i katabolizmu, regulację redoks oraz udział niekodującego RNA. Jednocześnie podejmowane są wysiłki na rzecz przekierowania węgla z glikogenu do pożądanych produktów w genetycznie modyfikowanych cyjanobakteriach w celu zwiększenia wydajności produktu. Do oznaczania zawartości glikogenu w sinicach stosuje się kilka metod, o różnej dokładności i złożoności technicznej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wiarygodnego oznaczania zawartości glikogenu w sinicach, który można wykonać w standardowym laboratorium nauk przyrodniczych. Protokół obejmuje selektywne wytrącanie glikogenu z lizatu komórkowego i enzymatyczną depolimeryzację glikogenu w celu wytworzenia monomerów glukozy, które są wykrywane za pomocą testu sprzężonego z enzymem oksydazy glukozowej i peroksydazy (GOD-POD). Metodę zastosowano do Synechocystis sp. PCC 6803 i Synechococcus sp. PCC 7002, dwóch modelowych gatunków sinic, które są szeroko stosowane w inżynierii metabolicznej. Co więcej, metoda z powodzeniem wykazała różnice w zawartości glikogenu między typem dzikim a mutantami z niedoborem elementów regulatorowych lub genów biosyntezy glikogenu.

10 mL szczepu dzikiego Synechocystis sp. PCC 6803 hodowano w warunkach fotoautotroficznych do momentu, aż wartość OD730nm osiągnęła około 0,8. Komórki zebrano i resuspensowano w 50 mM Tris-HCl, pH 8. Wartość OD730nm dostosowano do poziomu 2-3. Zawartość glikogenu przeanalizowano zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Zawartość glikogenu w przeliczeniu na OD730nm wyniosła 13 ± 1,8 µg/mL/OD730nm (N = 12). Zawartość glikogenu w st...

Tutaj prezentujemy wiarygodny i łatwy test do pomiaru zawartości glikogenu w komórkach sinic. Procedura polega na wytrącaniu, selektywnej depolimeryzacji i wykrywaniu pozostałości glukozy. Metoda ta jest odpowiednia zarówno dla szczepów dzikich, jak i genetycznie modyfikowanych i może ułatwić inżynierię metaboliczną sinic.

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest oznaczenie zawartości glikogenu w cyjanobakteriach z wykorzystaniem enzymatycznej selektywnej hydrolizy i analizy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad cyjanobakteriami, takie jak fizjologia, genetyka molekularna i bioinżynieria różnych badanych szczepów cyjanobakterii. Główną zaletą tej techniki jest jej przystosowanie do małej skali, łatwość wykonania oraz wysoka czułość i specyficzność wobec glikogenu.Choć metoda ta pozwala uzyskać wiedzę na temat sinic, może ona zostać zastosowana również do innych mikroorganizmów gromadzących glikogen lub skrobię, takich jak E.Coli, drożdże, mikroalgi oraz różne mikroorganizmy heterotroficzne i fototroficzne. Należy rozpocząć ten protokół od przygotowania kultur sinic zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś 1 ml kultury sinic lub zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 1,5 ml.Następnie wiruj przy 6 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Odlej nadsącz, a następnie resuspender osad w 1 ml 50 mM Tris-HCL pH 8. Wiruj resuspenderowany osad w ten sam sposób co poprzednio.Odlej nadsącz i ponownie resuspenduj osad komórkowy w buforze Tris-HCL. Wirowarkuj probówki w ten sam sposób co poprzednio i odlej nadsącz. Następnie dokładnie resuspenduj osad w 500 µL 50 mM buforu Tris-HCL o pH 8.Dla zapewnienia efektywnej lizy kluczowe jest dokładne zawieszenie osadu. Roztwór po resuspensji należy przechowywać w lodzie. Lizę resuspendowanych komórek należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C, stosując 30 cykli sonikacji; każdy cykl powinien składać się z 30 sekund ultradźwięków o częstotliwości 20 kHz przy maksymalnej amplitudzie, po których następuje 90 sekund przerwy.Odwiruj probówkę z lizatem przy 6 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu osad powinien składać się głównie z dużych fragmentów szczątków komórkowych, a nadfiltr należy wykorzystać do dalszych analiz. Na tym etapie określ stężenie białka, korzystając z zestawu do oznaczania białek.Usuń chlorofil a z lizatu komórkowego, mieszając 900 µL etanolu i 100 µL otrzymanego supernatantu w probówce z nakrętką o pojemności 1,5 mL. Po zakręceniu probówki podgrzej ją w temperaturze 90 °C przez 10 minut, używając standardowego laboratoryjnego bloku grzejnego. Następnie inkubuj probówkę w lodzie przez 30 minut.Następnie odwiruj probówkę z prędkością 20 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po wirowaniu ostrożnie usuń nadsącz. Osad zawiera glikogen.Osad należy lekko osuszyć na powietrzu, aby usunąć nadmiar etanolu. Nie należy go nadmiernie wysuszać, aby uniknąć trudności z jego rozpuszczaniem. Pomiar absorbancji otrzymanego supernatantu należy przeprowadzić przy 666 nanometrach w celu oznaczenia zawartości chlorofilu a.Wartość ta może zostać wykorzystana do normalizacji zawartości glikogenu. Rozpuścić osad w 100 µL 50 mM octanu sodu o pH 5. Dobrze wymieszać te materiały za pomocą wortexa.Mieszanie pipetowaniem nie jest zalecane ze względu na lepkość mieszaniny. Następnie należy dodać 50 µL amyloglukozydazy o stężeniu 8 U/mL oraz 50 µL alfa-amylazy o stężeniu 2 U/mL. Kolejnym krokiem jest inkubacja mieszaniny w bloku grzejnym w temperaturze 60 °C przez dwie godziny, aby umożliwić trawienie glikogenu do cząsteczek glukozy.Po inkubacji odwiruj próbkę przy 20 000 ×g przez pięć minut i przenieś nadpływ do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Zmierz stężenie glukozy w nadpływie po hydrolizie enzymatycznej, wykorzystując odczynnik GOD-POD. Przenieś 100 µl nadpływu z etapu wytrącania glikogenu do dołka na płytce 96-dołkowej.Jako kontrolę negatywną należy zastosować 100 µL 50 mM octanu sodu o pH 5. W celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej należy zmierzyć również roztwory standardowe glukozy. Do każdej próbki należy dodać 150 µL odczynnika GOD-POD i szybko wymieszać, pipetując.Inkubuj płytkę w temperaturze 25 °C przez 30 minut. Następnie zmierz wartość absorbancji przy 510 nm za pomocą czytnika płytek. Oblicz ilość glikogenu jako równoważnik glukozy, korzystając z krzywej kalibracyjnej otrzymanej ze standardów glukozy.Przedstawiono tutaj zawartość glikogenu w komórkach synechocystis. Dwa szczepy mutanty, delta pmg A i delta pmg R, znane z hiperakumulacji glikogenu, zostały porównane ze szczepem typu dzikiego. Zgodnie z oczekiwaniami, szczepy mutanty wykazały podwyższony poziom glikogenu.Z kolei mutant pozbawiony syntazy glikogenu nie gromadził glikogenu. Szczepy użyte w tej pracy zostały zmodyfikowane w celu produkcji mannitolu. Co istotne, mutant syntazy glikogenu produkował więcej mannitolu niż szczep kontrolny, co sugeruje, że węglowodany syntetyzowane w procesie fotosyntezy są przekierowane na produkcję mannitolu w szczepie mutantcie pozbawionym zdolności do syntezy glikogenu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie ilościowo oznaczyć zawartość glikogenu w cyjanobakteriach w ciągu pięciu godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o dokładnym resuspendowaniu komórek i solubilizacji osadów glikogenu w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Po zastosowaniu tej procedury, przy użyciu pozostałych lizatów komórkowych, można przeprowadzić inne metody, takie jak testy aktywności enzymów metabolicznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w jaki sposób regulowany jest metabolizm węglowodanów w cyjanobakteriach.

determination-of-the-glycogen-content-in-cyanobacteria

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje test spektrofotometryczny do szacowania aktywności syntazy glikogenu. Metoda polega na zmniejszaniu się absorbancji NADH w czasie i wskazuje na aktywność syntazy glikogenu.

Test spektrofotometryczny w celu określenia aktywności syntazy glikogenu

W tym filmie opisujemy jakościowy test spektrofotometryczny, aby określić zakres rozgałęzień w próbce glikogenu o niescharakteryzowanej strukturze. Porównanie maksimów absorbancji próbki niescharakteryzowanej z maksimum polisacharydów o znanych strukturach rozgałęzionych wskazuje na obecność rozgałęzień w próbce niescharakteryzowanej.

Test rozgałęzień glikogenu w celu zmierzenia stopnia rozgałęzienia glikogenu

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego określania zawartości fikobiliproteiny w cyjanobakterii Synechocystis za pomocą metody spektrofotometrycznej. Procedura ekstrakcji została również z powodzeniem zastosowana do innych szczepów sinic i glonów; Jednak ze względu na różnice w widmach absorpcji pigmentu konieczne jest przetestowanie równań spektrofotometrycznych dla każdego szczepu indywidualnie.

Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości fikobiliproteiny w Cyanobacterium synechocystis

Tutaj opisane są protokoły izolacji cyjanobakteryjnych polimerów węglowodanowych uwalnianych i izolacji ich egzoproteomów. Obie procedury obejmują kluczowe etapy uzyskiwania polimerów lub białek o wysokim stopniu czystości, które można wykorzystać do dalszej analizy lub zastosowań. Można je również łatwo dostosować do konkretnych potrzeb użytkownika.

Patrząc na zewnątrz: izolacja polimerów i białek węglowodanowych uwalnianych przez sinice

Techniki pomiaru aktywności kluczowych enzymów metabolizmu glikogenu są prezentowane przy użyciu prostego spektrofotometru działającego w zakresie widzialnym.

Metody spektrofotometryczne do badania metabolizmu glikogenu eukariotycznego

Optymalne stężenie sacharozy zostało określone do ekstrakcji glikogenu wątrobowego za pomocą wirowania w gradicynie gęstości sacharozy. Korzystne okazało się dodanie 10-minutowego etapu wrzenia w celu zahamowania enzymów rozkładających glikogen.

Ekstrakcja cząsteczek glikogenu wątrobowego w celu określenia struktury glikogenu

Obecny protokół szczegółowo opisuje izolację fikobilisomów z cyjanobakterii poprzez wirowanie przez nieciągły gradient gęstości sacharozy. Frakcje nienaruszonych fikobilisomów potwierdza widmo emisji fluorescencji 77K i analiza SDS-PAGE. Otrzymane frakcje fikobilisomów nadają się do barwienia ujemnego TEM i analizy spektrometrii mas.

Izolacja i charakterystyka nienaruszonego fikobilisomu u cyjanobakterii

W obecnym protokole, technika elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE) jest używana do określenia rozkładu długości łańcucha (CLD) i średniej długości łańcucha (ACL) glikogenu.

Oznaczanie rozkładu długości łańcucha glukanowego glikogenu metodą elektroforezy węglowodanowej wspomaganej fluoroforem (FACE)

Adsorpcja peptydów na plastikowych naczyniach podczas tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń na bazie końcówek może znacząco wpłynąć na określenie siły działania i zakłócić zrozumienie zależności struktura-aktywność używanych do identyfikacji ołowiu i optymalizacji ołowiu w fazach odkrywania leków. W tym miejscu opisano metody automatycznego akustycznego bezkontaktowego seryjnego rozcieńczania próbek peptydów.

Zautomatyzowane dozowanie akustyczne do seryjnego rozcieńczania agonistów peptydów w testach oznaczania siły działania

Poznaj metodę oznaczania zawartości glikogenu w sinicach przy użyciu selektywnej hydrolizy enzymatycznej. Technika ta jest prosta, czuła i stosowalna zarówno do szczepów dzikich, jak i zmodyfikowanych genetycznie.

Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Przeglądaj więcej filmów