Oznaczanie zawartości glikogenu w sinicach

Ogólnym celem tej procedury jest określenie zawartości glikogenu w sinicach za pomocą selektywnej hydrolizy i testu opartego na enzymach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie sinic, takie jak fizjologia, genetyka molekularna i bioinżynieria różnych badanych szczepów sinic. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest dostosowana do małej skali, łatwa do wykonania, a także bardzo czuła i specyficzna dla glikogenu.

Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w cyjanobakterie, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów, które gromadzą glikogen lub skrobię, takich jak E.Coli, drożdże, mikroalgi oraz różne mikroorganizmy heterotroficzne i fototroficzne. Rozpocznij ten protokół od przygotowania kultur sinic zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przenieś jeden mililitr kultury cyjanobakterii lub zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie odwirować w temperaturze 6 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w jednym mililitrze 50 milimolowych Tris-HCL pH osiem. Odwirować zawieszony osad jak poprzednio.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy po raz drugi w buforze Tris-HCL. Odwirować probówki jak poprzednio i wyrzucić supernatant. Następnie dokładnie zawieś osad w 500 mikrolitrach 50-milimolowego buforu Tris-HCL o pH osiem.

Bardzo ważne jest, aby granulat był dobrze zawieszony, aby zapewnić wydajną lizę. Zawiesinę należy przechowywać w lodzie. Zawiesić zawieszone komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 30 cyklach ultradźwięków, z których każdy składa się z 30 sekund z częstotliwością 20 kiloherców o maksymalnej amplitudzie, a następnie 90 sekund bez.

Odwirować probówkę zawierającą lizat w temperaturze 6 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu osad powinien składać się głównie z dużych szczątków komórkowych, a supernatant jest używany do dalszej analizy. W tym momencie określ stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek.

Usuń chlorofil a z lizatu komórkowego, mieszając 900 mikrolitrów etanolu i 100 mikrolitrów otrzymanego supernatantu w 1,5 mililitrowej probówce z nakrętką. Po zamknięciu nakrętki podgrzewaj probówkę w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez 10 minut, używając standardowego laboratoryjnego bloku grzewczego. Następnie inkubuj probówkę w lodzie przez 30 minut.

Następnie odwiruj probówkę w temperaturze 20 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant. Osad zawiera glikogen.

Lekko wysuszyć granulat na powietrzu, aby usunąć nadmiar etanolu. Nie susz nadmiernie granulek, aby uniknąć trudnego rozpuszczenia. Zmierzyć absorbancję otrzymanego supernatantu w 666 nanometrach, aby określić zawartość chlorofilu a.

Wartość tę można wykorzystać do normalizacji zawartości glikogenu. Rozpuść osad w 100 mikrolitrach 50-milimolowego octanu sodu o pH pięć. Dobrze wymieszaj te materiały za pomocą wiru.

Nie zaleca się mieszania przez pipetowanie, ponieważ mieszanina jest lepka. Dodaj również 50 mikrolitrów po osiem jednostek na mililitr amylozozydazy i 50 mikrolitrów po dwie jednostki na mililitr alfa-amylazy. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze 60 stopni Celsjusza w bloku grzewczym przez dwie godziny, aby umożliwić trawienie glikogenu do cząsteczek glukozy.

Po inkubacji odwirować próbkę z prędkością 20 000 g przez pięć minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Zmierzyć stężenie glukozy w supernatance po hydrolizie enzymatycznej przy użyciu odczynnika GOD-POD. Przenieść 100 mikrolitrów supernatantu z etapu wytrącania glikogenu do studzienki w 96-dołkowej płytce.

Jako kontrolę ujemną użyj 100 mikrolitrów 50-milimolowego octanu sodu o pH pięć. Aby wygenerować krzywą kalibracyjną, należy również zmierzyć roztwory wzorcowe glukozy. Dodać 150 mikrolitrów odczynnika GOD-POD do każdej próbki i szybko wymieszać przez pipetowanie.

Inkubuj płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie zapisz wartość absorbancji przy 510 nanometrach za pomocą czytnika płytek. Obliczyć ilość glikogenu jako ekwiwalent glukozy, stosując krzywą kalibracyjną otrzymaną z wzorców glukozy.

Zawartość glikogenu w synechocystis pokazano tutaj. Dwa zmutowane szczepy, delta pmg A i delta pmg R, o których wiadomo, że nadmiernie akumulują glikogen, porównano ze szczepem typu dzikiego. Zgodnie z oczekiwaniami, zmutowane szczepy wykazywały podwyższony poziom glikogenu.

I odwrotnie, mutant, który nie ma syntazy glikogenu, nie gromadził glikogenu. Użyte tutaj szczepy zostały zaprojektowane do produkcji mannitolu. Warto zauważyć, że mutant syntazy glikogenu wytwarzał więcej mannitolu niż szczep kontrolny, co sugeruje, że węglowodan syntetyzowany w procesie fotosyntezy jest przekierowywany do mannitolu w zmutowanym szczepie pozbawionym zdolności do syntezy glikogenu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie ilościowo określić zawartość glikogenu w sinicach w ciągu pięciu godzin. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym ponownym zawieszeniu komórek i rozpuszczeniu granulek glikogenu w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak testy aktywności enzymów metabolicznych, przy użyciu pozostałych lizatów komórkowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak sposób regulacja metabolizmu węglowodanów u cyjanobakterii.