Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Ogólnym celem tego testu jest ocena właściwości przeciwzakrzepowych komórek śródbłonka przy użyciu całej krwi niezakrzepowej. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na pytania badawcze związane z badaniami sercowo-naczyniowymi, transportem i badaniami związanymi z chirurgią. Zasadniczo może być używany do wszystkich pytań, które mają związek z odpornością i aktywacją komórek śródbłonka.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można stosować krew pełną, bez antykoagulantów, ponieważ antykoagulację gwarantują komórki śródbłonka. Aby rozpocząć protokół, wymieszaj siedem mililitrów kulek mikronośnika z 42 mililitrami roztworu koagulantu w 50-mililitrowej probówce i inkubuj kulki przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umyj kulki 25 mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS i przepłucz kulki, pipetując w górę iw dół.

Poczekaj, aż kulki osiądą na dnie probówki, zanim wyrzucisz supernatant i powtórzysz. Następnie umyj koraliki jednorazowo 25 mililitrami Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM. Następnie przykryj koraliki 10 mililitrami pożywki 199 i pozwól im się zrównoważyć przez 10 minut przed dalszym użyciem.

Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z kolby T175 zawierającej PAEC i dodać pięć mililitrów PBS. Następnie usuń PBS z kolby T175 i zastąp go pięcioma mililitrami trypsyny z 0,05% EDTA. Inkubuj komórki przez trzy do czterech minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Zebrać komórki, przepłukując kolbę 15 mililitrami pożywki do hodowli komórkowych i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować komórki, po odwirowaniu usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach pożywki do hodowli komórkowych. Dodaj 20 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych do zawiesiny komórek i ponownie zawieś komórki.

Dodać 20 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych bez komórek do 500-mililitrowej kolby z mieszadłem magnetycznym. Dodaj komórki do umytych kulek mikronośnika i dokładnie wymieszaj roztwór za pomocą 25-mililitrowej pipety serologicznej. Przenieść mieszaninę komórek perełkowych do magnetycznej kolby obrotowej.

Przepłucz probówkę 10 mililitrami pożywki do hodowli komórkowych, aby zebrać pozostałe komórki. Dodaj dodatkowe 85 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych do kolby przędzarkowej. Umieścić kolbę w inkubatorze na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza na shakerze.

Dodaj 50 mililitrów pożywki do hodowli komórkowych, aby uzyskać całkowitą objętość 200 mililitrów. Kontynuuj mieszanie przez dodatkowe 24 godziny na shakerze. Dodaj bezbarwne pożywki Rockwell Park Memorial Institute lub RPMI, aż do osiągnięcia 320 mililitrów całkowitej objętości.

Usuń 100 mililitrów starego podłoża i dodawaj 100 mililitrów świeżego, uzupełnionego bezbarwnego RPMI, co 48 godzin. Hoduj komórki przez pięć do siedmiu dni, w zależności od stanu zlewania się kulek pokrytych komórkami. Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej usuń kulki pokryte komórkami z kolby mieszadła magnetycznego i przenieś je do 12-mililitrowych probówek polipropylenowych z okrągłym dnem.

Po jednej do dwóch minut, gdy koraliki się osiądą, usuń nadmiar nośnika. Dodaj więcej koralików do rurek, aż każda tubka będzie zawierała dokładnie dwa milimetry koralików. Następnie dodaj pięć mililitrów klarownego RPMI do każdej probówki i dokładnie wymieszaj roztwór za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej.

Pozwól koralikom się uspokoić i usuń nadmiar mediów. Powtórz procedurę prania jeszcze raz z RPMI i usuń cały nadmiar medium. Ostrożnie i powoli pobierz krew od zdrowego ochotnika i zbierz ją w dziewięciomililitrowej neutralnej probówce polipropylenowej, bez antykoagulantu.

Powoli przenieś osiem mililitrów krwi do każdej z polipropylenowych probówek zawierających dwa mililitry kulek pokrytych komórkami, aby uzyskać całkowitą objętość 10 mililitrów. Należy ostrożnie obchodzić się z krwią i kulkami, aby uniknąć przedwczesnej aktywacji EC. Ostrożnie przechyl mieszaninę kulek krwi, aby zapewnić równomierne wymieszanie i uszczelnij nakrętkę folią parafinową.

Umieść probówki na poziomym stole uchylnym z delikatnymi ustawieniami, w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i zapisz czasy krzepnięcia. W ustalonych odstępach czasu usuń co najmniej 1,5 do dwóch mililitrów mieszaniny kulek krwi do analizy surowicy lub osocza. W celu pobrania surowicy pozostaw krew do koagulacji.

Na koniec odwirować probówki o stężeniu 2 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przechowuj serum lub osocze w temperaturze 80 stopni Celsjusza do momentu użycia. Kulki mikronośnikowe barwione na CD31 i jądra wyraźnie wykazują zbieżność.

Obserwacja wzrokowa wykazała, że wydłużenie czasu krzepnięcia można zaobserwować, jeśli na powierzchni kulek mikronośnika obecna jest monowarstwa EC. Znaczne wydłużenie czasu krzepnięcia zaobserwowano, gdy komórki śródbłonka aorty świń, PAEC GalTKO/hCD46/hTBM, były obecne na kulkach mikronośnika, co sugeruje skuteczną modulację zarówno układu dopełniacza, jak i krzepnięcia. Po opanowaniu, inkubację kulek pokrytych komórkami śródbłonka z nieantykoagulowaną ludzką krwią można przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin.

Rzeczywisty czas trwania eksperymentu zależy głównie od czasu krzepnięcia, który jest obserwowany w eksperymencie. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o całkowitym pokryciu mikrokulek komórkami śródbłonka i zapobiec przedwczesnej aktywacji ludzkiej krwi.