Name: Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Naucz się oceniać właściwości przeciwzakrzepowe komórek śródbłonka z wykorzystaniem nieantykoagulowanej krwi pełnej i hodowli 3D. Ta metoda pozwala badać mechanizmy krzepnięcia w badaniach kardiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (SNSF, Grant No. 320030_156193). Autorzy dziękują dr Benoît Werlenowi za dostarczenie kulek do mikronośników Biosilon. Dziękujemy również prof. Hansowi Peterowi Kohlerowi i prof. André Haeberliemu za pomoc w skonfigurowaniu modelu koralików do mikronosidełka.

Niemieckie świnie rasy lokalnej (dziki typ wyhodowany w lokalnym gospodarstwie i transgeniczny wyhodowany w Instytucie Molekularnej Hodowli Zwierząt i Biotechnologii, Uniwersytet Ludwika i Maksymiliana, Monachium, Niemcy), o wadze od 30 kg do 40 kg, zostały użyte w tym badaniu. Wszystkie zwierzęta były trzymane w standardowych warunkach, z wodą i jedzeniem ad lib. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) oraz Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, a także szwajcarskim prawem ochrony zwierząt. Wszystkie badania na zwierzętach były zgodne z wytycznymi ARRIVE. Komitet ds. Doświadczeń na Zwierzętach Kantonalnej Służby Weterynaryjnej (Kanton Berno, Szwajcaria) zatwierdził wszystkie procedury na zwierzętach, nr zezwolenia. BE70/14. Protokoły eksperymentalne zostały dopracowane zgodnie z zasadami 3R i zastosowano najnowocześniejsze znieczulenie i leczenie bólu w celu zminimalizowania liczby zwierząt i zmniejszenia narażenia zwierząt na stres i ból podczas eksperymentów.
Krew została pobrana od zdrowych osób za pomocą nakłucia żyły w systemie zamkniętym, zgodnie ze szwajcarską jurysdykcją i wytycznymi etycznymi Szpitala Uniwersyteckiego w Bernie. Wyrażenie "krew niezakrzepliwa" oznacza, że krew nie była leczona żadnym antykoagulantem.
Następujące kroki są wykonywane w sterylnych warunkach. Wymagana jest znajomość podstawowej techniki sterylnej hodowli komórkowych.
1. Izolacja PAEC
UWAGA: Segmenty aorty piersiowej o długości od 6 do 10 cm zostały pobrane od poddanych eutanazji niemieckich świń rasy Landrace w wieku od 3 do 6 miesięcy (używane do innych eksperymentów in vivo) i natychmiast przeniesione do szklanej butelki o pojemności 500 ml zawierającej pożywkę transportową (DMEM + 1% penicyliny/streptomycyny).
<ol>
	<li>Wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę fibronektyną 12,5 μg/ml w PBS 1x i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Wstępnie podgrzany sterylny PBS 1x i pożywka do hodowli komórkowych (DMEM).</li>
	<li>Wyjmij aortę świni z podłoża transportowego.</li>
	<li>Umieść aortę na płytce styropianowej.</li>
	<li>Wcześniej delikatnie spłucz ciepłym PBS.</li>
	<li>Przetnij aortę wzdłuż i przymocuj ją igłami.</li>
	<li>Dodaj ciepłą pożywkę do hodowli komórkowych na wewnętrznej powierzchni naczynia.</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórek fibronektyny i dodać świeżą pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM uzupełniony 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka).</li>
	<li>Namocz jeden wacik w pożywce do hodowli komórkowych. Przetrzyj wacik na samej górze wewnętrznej powierzchni naczynia delikatnie i powoli w tym samym kierunku.</li>
	<li>Przetrzyj komórki w jednym dołku z 6-dołkową płytką runda po rundzie.</li>
	<li>Zrób to samo z pozostałymi studzienkami.</li>
	<li>Sprawdzić komórki pod mikroskopem i umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zmień podłoże drugiego dnia i zmieniaj je ponownie co 2 - 3 dni.</li>
	<li>Kiedy komórki mają się zlewać, trypsynizuj komórki i umieszczaj je w kolbie T75 (PAEC P1).</li>
</ol>
2. Charakterystyka PAEC
<ol>
	<li>Wstępnie pokryć 8-dołkowe szkiełko domowe fibronektyną 12,5 μg/ml w PBS 1x i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Wysiać 5 x 104 komórek/basenik i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS++ (PBS uzupełniony o CaCl2 i MgCl2), 300 μL/studzienkę.</li>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 3,7% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, 200 μl/studzienkę.</li>
	<li>Umyj komórki 3 razy PBS++, 300 μL/studzienkę.</li>
	<li>Dodać 300 μL PBS 1x-3% BSA (bufor blokujący) i pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastosować przeciwciała pierwszorzędowe (anty-VE-kadheryna, anty-CD31, anty-vWF) rozcieńczone w detergentzie PBS 1x-1%BSA-0,05%, 160 μL/basenik i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3 razy preparatem PBS++ (200 μL/dołek).</li>
	<li>Zastosować przeciwciała drugorzędowe i DAPI rozcieńczone w detergentzie PBS 1x-1%BSA-0,05%, 160 μL/studzienkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć 3 razy preparatem PBS++ (200 μL/dołek).</li>
	<li>Zamontuj szkiełka z podłożem montażowym na bazie glicerolu i sprawdź ekspresję markerów komórek śródbłonka pod mikroskopem fluorescencyjnym. 
	UWAGA: Hodować komórki śródbłonka aorty świń w kolbie T175 (pożywka DMEM o niskiej zawartości glukozy + 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka) aż do osiągnięcia 90% konfluencji. (gęstość wysiewu 1 x 106 komórek, 90% konfluencji odpowiada w przybliżeniu 5 x 106 komórek).</li>
</ol>
3. Powlekanie kulek Microcarrier
<ol>
	<li>Wymieszaj 7 ml kulek mikronośnikowych z 42 ml roztworu kolagenu w probówce o pojemności 50 ml (100 μg/ml, rozcieńczony w 0,2% roztworze kwasu octowego) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć kulki dwa razy 25 ml PBS o pH 7,4 (dodać 25 ml PBS, dobrze wymieszać pipetą i poczekać, aż kulki się osiajdą, a następnie odrzucić supernatant i powtórzyć) i jeden raz 25 ml pożywki DMEM.</li>
	<li>Przykryj kulki w probówce o pojemności 50 ml 10 ml pożywki 199 uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i 25 μl heparyny (5000 IU / ml) i pozostaw równowagę przez 10 minut przed dalszym użyciem.</li>
</ol>
4. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z kolby T175 zawierającej PAEC i dodać 5 ml PBS o pH 7,4.</li>
	<li>Usunąć PBS z kolby T175.</li>
	<li>Dodać 5 ml trypsyny-0,05% EDTA i inkubować przez 3 - 4 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać komórki, przepłukując kolbę 15 ml pożywki do hodowli komórkowych i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1 200 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej, usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych.</li>
</ol>
5. Umieszczanie komórek w kolbie mieszadła
<ol>
	<li>Dodać 20 ml pożywki do hodowli komórkowych do zawiesiny komórek i ponownie zawiesić.</li>
	<li>Dodać 20 ml pożywki do hodowli komórkowych (bez komórek) do kolby z mieszadłem magnetycznym o pojemności 500 ml.</li>
	<li>Dodaj komórki do umytych kulek mikronośnika z kroku 3.3 i dokładnie wymieszaj za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę kulek/komórek do magnetycznej kolby obrotowej.</li>
	<li>Przepłucz probówkę o pojemności 50 ml 10 ml pożywki do hodowli komórkowych, aby zebrać pozostałe komórki.</li>
	<li>Dodać dodatkowe 85 ml pożywki do hodowli komórkowych do kolby przędzalniczej i umieścić ją na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (100 x g, odstęp między mieszaniami: 3 minuty co 45 minut).</li>
	<li>Dodać 50 ml pożywki do hodowli komórkowych (całkowita objętość 200 ml) i kontynuować mieszanie przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (100 x g, odstęp między mieszaniami: 3 minuty co 45 minut).</li>
	<li>Dodawać bezbarwną pożywkę RPMI (uzupełnioną 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i 25 μl heparyny), aż do osiągnięcia 320 ml całkowitej objętości.</li>
	<li>Wymieniaj pożywkę co 48 godzin: Usuń 100 ml starej pożywki i dodaj 100 ml świeżej, uzupełnionej bezbarwnej pożywki RPMI.</li>
	<li>Hoduj komórki przez 5 do 7 dni. Czas zależy od stanu konfluencji koralików pokrytych komórkami.</li>
</ol>
6. Weryfikacja konfluencji
<ol>
	<li>Za pomocą pipety zbierz 200 μl kulek pokrytych komórkami i przenieś je do probówki polipropylenowej.</li>
	<li>Umyj kulki 3 razy 600 μL PBS 1x (dodaj PBS, przechyl probówkę i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć oderwania się komórek, poczekaj, aż kulki się uspokoją, wyrzuć PBS i powtórz).</li>
	<li>Utrwal kulki na 10 minut, dodając 200 μl kwasu parapikrynowego.</li>
	<li>Przemyć 3 razy 600 μl PBS 1x.</li>
	<li>Dodać DAPI rozcieńczony w PBS 1x i inkubować przez 10 min.</li>
	<li>Przenieś koraliki na szkiełko podstawowe i nałóż szkiełko nakrywkowe za pomocą medium montażowego na bazie glicerolu.</li>
	<li>Wizualizuj koraliki pod mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
7. Procedura eksperymentalna
<ol>
	<li>Usunąć kulki pokryte komórkami z kolby mieszadła magnetycznego (procedury nie muszą być wykonywane w sterylnych warunkach) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść je do okrągłodennych probówek polipropylenowych o pojemności 12 ml.</li>
	<li>Pozwól kulkom osiąść (około 1 - 2 minut) i usuń nadmiar podłoża.</li>
	<li>Dodaj więcej koralików do probówek, aż każda probówka będzie zawierała dokładnie 2 ml kulek.</li>
	<li>Dodaj 5 ml przezroczystego RPMI do każdej probówki i dokładnie wymieszaj za pomocą 10 ml pipety serologicznej.</li>
	<li>Pozwól koralikom się uspokoić i usuń nadmiar medium.</li>
	<li>Powtórz procedurę prania jeszcze raz z RPMI i usuń cały nadmiar medium.</li>
</ol>
8. Inkubacja z krwią niezakrzepłą
<ol>
	<li>Ostrożnie i powoli (bez użycia dyszy lub odkurzaczy) pobierz krew od zdrowego ochotnika i zbierz ją do 9 ml neutralnych probówek polipropylenowych (bez antykoagulantu).</li>
	<li>Powoli przenieś 8 ml krwi za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do każdej z probówek polipropylenowych zawierających 2 ml kulek pokrytych komórkami (całkowita objętość wyniesie 10 ml). Zawsze unikaj nieostrożnego obchodzenia się z krwią lub kulkami, aby uniknąć przedwczesnej aktywacji EC. Zabieg trwa 1 - 2 min.</li>
	<li>Ostrożnie przechyl mieszaninę krwi i kulek, aby zapewnić równomierne wymieszanie i uszczelnij nakrętkę folią parafinową.</li>
	<li>Umieść probówki na poziomym stole uchylnym (tylko z delikatnymi ustawieniami przechylania) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i zapisuj czasy krzepnięcia.
	<ol>
		<li>W ustalonych odstępach czasu, np. po 10, 20, 30, 50, 70, 90 minutach, należy usunąć co najmniej 1,5 - 2 ml mieszaniny krwi-granulek do analizy surowicy lub osocza. 
		UWAGA: dla 6 punktów czasowych sugerujemy posiadanie więcej niż 3 powtórzeń w jednej grupie komórek, ponieważ pobieranie krwi będzie wykonywane w różnych probówkach.</li>
		<li>W celu zebrania surowicy pozostaw krew do krzepnięcia. Aby pobrać osocze, dodaj EDTA lub cytrynian do probówek o pojemności 2 ml przed dodaniem próbek krwi.</li>
		<li>Przechowywać probówki na lodzie, odwirowywać przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać surowicę/osocze w temperaturze 80 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat materiałów znajdują się w Tabeli materiałów</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li>
<li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li>
<li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li>
<li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li>
<li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation%3A+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li>
<li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li>
<li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+composition%2C+functions%2C+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li>
<li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li>
<li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium%3A+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li>
<li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li>
<li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj model nadaje się do badań związanych z krzepnięciem, umożliwiając analizę różnych aspektów krzepnięcia i jego interakcji z EC.8 W badaniach nad ksenotransplantacją jest to użyteczny system do testowania właściwości przeciwzakrzepowych różnych genetycznie zmodyfikowanych EC świń po inkubacji z ludzką krwią 9.
Najbardziej krytycznymi krokami protokołu są te zapewniające pełne pokrycie komórek (zbieganie się) mikrogranulkami prze...

Śródbłonek naczyniowy składa się z monowarstwy komórek śródbłonka (EC), które wyściełają światło naczyń krwionośnych. W stanie fizjologicznym spoczynkowe EC są odpowiedzialne za utrzymanie środowiska przeciwzakrzepowego i przeciwzapalnego. 1 Odbywa się to za pośrednictwem ekspresji białek przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych na powierzchni EC. Na przykład aktywacja EC spowodowana uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym lub odrzuceniem naczyniowym (kseno)przeszczepionych narządów powoduje zmianę powierzchni śródbłonka ze stanu przeciwzakrzepowego i przeciwzapalnego na stan prokoagulacyjny i prozapalny. 1
Aby zbadać fascynującą i złożoną interakcję między śródbłonkiem a czynnikami krzepnięcia, wysoce pożądane są modele in vitro, które jak najwierniej naśladują sytuację in vivo. Powszechnym ograniczeniem charakteryzującym konwencjonalne testy krzepnięcia in vitro jest stosowanie krwi przeciwzakrzepowej, co sprawia, że analiza efektów za pośrednictwem krzepnięcia jest uciążliwa, a nawet ponowne zwapnienie cytrynianu krwi pełnej nie może odtworzyć wyników możliwych do uzyskania przy użyciu świeżej, nieantykoagulowanej krwi. 2 Poza tym, w tradycyjnych systemach hodowli komórkowych z płaskim łożem niemożliwe jest wykorzystanie właściwości przeciwzakrzepowych śródbłonka, ponieważ nie można osiągnąć wystarczającej powierzchni komórek śródbłonka na objętość krwi. Prezentowany tutaj model pokonuje te ograniczenia poprzez hodowlę EC na powierzchni sferycznych kulek mikronośnika, dzięki czemu można osiągnąć stosunek powierzchni EC do krwi wynoszący >16 cm2/ml, co jest podobne do sytuacji w małych tętniczkach lub żyłach, i które zostało opisane jako wystarczające, aby umożliwić "naturalną" antykoagulację krwi przez powierzchnię EC. 3,4 W tym ustawieniu można używać krwi pełnej bez dodatku antykoagulantów. Podczas eksperymentu można pobrać próbki krwi, a cytokiny, czynniki krzepnięcia i rozpuszczalne markery aktywacji dopełniacza mogą być wykryte i określone ilościowo. Ponadto kulki mikronośnikowe pokryte EC mogą być analizowane pod kątem odkładania się dopełniacza i immunoglobuliny, a także ekspresji markerów aktywacji EC za pomocą mikroskopii konfokalnej. Innym ciekawym zastosowaniem jest testowanie leków, które mają zapobiegać aktywacji komórek śródbłonka, a co za tym idzie krzepnięcia. 5 Chociaż ten model nie może całkowicie zastąpić eksperymentów na zwierzętach, oferuje metodę testowania konkretnych hipotez funkcjonalnych ex vivo przy użyciu komórek, a tym samym zmniejsza liczbę zwierząt wykorzystywanych w podstawowych badaniach nad uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym lub (kseno)transplantacją.
Opisany model został użyty do naśladowania warunków ksenotransplantacji, w których komórki śródbłonka aorty świńskiej (PAEC) są hodowane na mikronośnikach i inkubowane z całą, nieantykoagulowaną ludzką krwią. Różne transgeniczne PAEC, zawierające kilka ludzkich genów, takich jak CD46 do regulacji układu dopełniacza i/lub trombomodulina (hTBM) do regulacji układu krzepnięcia, analizowano pod kątem ich właściwości przeciwzakrzepowych. Systemy aktywacji komórek śródbłonka, dopełniacza i krzepnięcia są ściśle kontrolowane i wzajemnie połączone. 6 Dlatego ważne jest zrozumienie, jak zachowują się różne komórki transgeniczne po ekspozycji na ludzką krew w odniesieniu do ekspresji cząsteczek adhezyjnych i uwalniania cytokin, zrzucania glikokaliksu i utraty białek przeciwzakrzepowych. 7

<table><tbody><tr><td>PAEC</td><td></td><td></td><td>Wyizolowany z aorty świni w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Kulki Microcarrier (Biosilon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160-250</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, bydlęcy</td><td>Gibco</td><td>A10644-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma</td><td>M7528</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Rurki neutralne</td><td>Sarstedt</td><td>02.1726.001</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polipropylenowe</td><td>Simport</td><td>T406-2A</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło</td><td>Tecnomara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło biologiczne</td><td>Brouwer</td><td>MCS-104S</td><td></td></tr><tr><td>Rat anty CD31</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB33871</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Kozia anty-szczurza IgG-Cy3</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-166-003</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Kozia anty VE-kadheryna</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6458</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Królik anty vWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Dk anty Gt IgG &ndash; Sondy</td><td>molekularne</td> Alexa 488 <td>A11055</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Koza anty Królik - FITC</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-25MG-F</td><td>Rozcieńczenie 1 i mikro; g / ml</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Stężenie: 10% w pożywce do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Adapter</td><td>Sarstedt</td><td>14.1205</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Obraz J</td><td></td><td>Dostępne bezpłatnie pod adresem: https://imagej.net</td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>2 ml w 500 ml DMEM</td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Stężenie: 1% w pożywce do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>Stężenie: 1% w pożywce do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Heparinun natricum</td><td>Drossa Pharm AG</td><td></td><td>Stężenie magazynowe: 5000 U.I./ ml</td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie komorowe</td><td>Bioswisstec AG</td><td>30108</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2H2O</td><td>Merck</td><td>2382.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x6 H2O</td><td>Merck</td><td>1.5833.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Axon Lab AG</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe do gliceryny</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3d i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, komórki śródbłonka są kluczowe dla naturalnej antykoagulacji krążącej krwi. W konsekwencji aktywacja komórek śródbłonka prowadzi do krzepnięcia krwi. Zjawisko to obserwuje się w wielu sytuacjach klinicznych, takich jak przeszczepianie narządów w obecności wstępnie uformowanych przeciwciał anty-donorowych, w tym ksenotransplantacja, a także w przypadku uszkodzenia niedokrwiennego/reperfuzyjnego. W celu ograniczenia eksperymentów na zwierzętach zgodnie ze standardami 3R (redukcja, zastąpienie i udoskonalenie), wysoce pożądane byłyby modele in vitro do badania wpływu aktywacji komórek śródbłonka na krzepnięcie krwi. Jednak powszechne płaskie systemy hodowli komórek śródbłonka zapewniają stosunek powierzchni do objętości wynoszący 1 - 5cm2 śródbłonka na ml krwi, co nie jest wystarczające do naturalnej antykoagulacji za pośrednictwem śródbłonka. Hodowla komórek śródbłonka na kulkach mikronośnika może zwiększyć stosunek powierzchni do objętości do 40 - 160 cm2/ml. Ten zwiększony stosunek jest wystarczający, aby zapewnić "naturalną" antykoagulację krwi pełnej, dzięki czemu można uniknąć stosowania antykoagulantów. W tym artykule opisano system oparty na mikronośnikach in vitro w celu zbadania wpływu modyfikacji genetycznej komórek śródbłonka świń na krzepnięcie całej, nieantykoagulowanej krwi ludzkiej. W opisanym teście pierwotne komórki śródbłonka aorty świń, typu dzikiego (WT), lub transgeniczne dla ludzkiego CD46 i trombomoduliny, hodowano na kulkach mikronośnika, a następnie wystawiono na działanie świeżo pobranej krwi ludzkiej niezakrzepowej. Model ten pozwala na pomiar i kwantyfikację uwalniania cytokin, a także markerów aktywacji dopełniacza i krzepnięcia w osoczu krwi. Ponadto za pomocą mikroskopii konfokalnej wykonano obrazowanie aktywowanych komórek śródbłonka oraz odkładanie immunoglobulin, białek dopełniacza i białka krzepnięcia na śródbłonkowych kulkach. Test ten może być również wykorzystany do testowania leków, które mają zapobiegać aktywacji komórek śródbłonka, a tym samym krzepnięciu. Oprócz możliwości zmniejszenia liczby zwierząt wykorzystywanych do takich badań, opisany test jest łatwy do wykonania i konsekwentnie powtarzalny.

Po 7 – 10 dniach hodowli w kolbie z mieszadłem (Rysunek 1) komórki osiągnęły konfluencję, pokrywając całą powierzchnię mikronośników (Rysunek 2). Weryfikacja stanu konfluencji jest istotnym etapem, ponieważ niekonfluencyjna warstwa EC na mikrokulkach doprowadzi do wyraźnego skrócenia czasu krzepnięcia, gdyż powierzchnia mikronośników jest silnie prokoagulacyjna (czas krzepnięcia: 4 ± 1 min) (Rysunek 3</strong...

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Ogólnym celem tego testu jest ocena właściwości przeciwzakrzepowych komórek śródbłonka z wykorzystaniem pełnej krwi nieprzeciwzakrzepowej. Metoda ta może być stosowana do odpowiedzi na pytania badawcze związane z badaniami nad układem sercowo-naczyniowym, transportem oraz chirurgią. W zasadzie może być wykorzystana we wszystkich zagadnieniach dotyczących przeciwodporności oraz aktywacji komórek śródbłonka.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania krwi pełnej bez przeciwkrzepliwo, ponieważ przeciwkrzepliwość jest zapewniona przez komórki śródbłonka. Aby rozpocząć protokół, wymieszaj 7 ml kulek mikronośników z 42 ml roztworu koagulanta w probówce o pojemności 50 ml i inkubuj kulki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyj kulki 25 ml solistkiego buforu fosforanowego (PBS), płucząc je poprzez pipetowanie w górę i w dół.Należy odczekać, aż kuleczki opadną na dno probówki, przed odlaniem supernatantu i powtórzeniem czynności. Następnie kuleczki należy wypłukać raz, używając 25 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle'a Dulbecco, DMEM. Potem kuleczki należy przykryć 10 ml pożywki 199 i pozostawić je na 10 minut w celu równowagi przed dalszym użyciem.Usunąć pożywkę hodowlaną z kolby T175 zawierającej PAEC i dodać pięć mililitrów PBS. Następnie usunąć PBS z kolby T175 i zastąpić go pięcioma mililitrami trypsyny z 0,05% EDTA. Inkubować komórki od trzech do czterech minut w temperaturze 37 °C.Zebrać komórki, płucząc kolbę 15 mililitrami pożywki do hodowli komórkowej, a następnie przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 mililitrów. Odwirować komórki, po wirowaniu usunąć nadmiar pożywki i resuspenderć osad w pięciu mililitrach pożywki do hodowli komórkowej. Dodać 20 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej do zawiesiny komórkowej i ponownie resuspenderć komórki.Do kolby z mieszadłem magnetycznym o pojemności 500 ml dodać 20 ml pożywki do hodowli komórkowej bez komórek. Dodać komórki do wypłukanych kulek mikronośników i ostrożnie wymieszać roztwór za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml. Przenieść mieszaninę kulek z komórkami do kolby z mieszadłem magnetycznym.Przepłucz probówkę 10 mililitrami pożywki do hodowli komórek, aby zebrać pozostałe komórki. Dodaj kolejne 85 mililitrów pożywki do hodowli komórek do kolby z mieszadłem. Umieść kolbę w inkubatorze na noc, w temperaturze 37 °C na wytrząsarce.Dodać 50 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej, aby uzyskać całkowitą objętość 200 mililitrów. Kontynuować mieszanie przez kolejne 24 godziny na wytrząsarce. Dodać bezbarwną pożywkę RPMI (Rockefeller Park Memorial Institute), aż do osiągnięcia całkowitej objętości 320 mililitrów.Co 48 godzin należy usunąć 100 ml starej pożywki i dodać 100 ml świeżej, bezzbarwnej pożywki RPMI z dodatkami. Komórki należy hodować przez pięć do siedmiu dni, w zależności od stopnia konfluencji komórek na powlekanych kuleczkach. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml należy usunąć powlekane komórkami kuleczki z kolby z mieszadłem magnetycznym i przenieść je do probótek z polipropylenu o okrągłym dnie o pojemności 12 ml.Po jednej lub dwóch minutach, gdy kuleczki opadną na dno, należy usunąć nadmiar medium. Dodaj kolejne kuleczki do probówek, aż w każdej z nich znajdzie się dokładnie 2 mm kuleczek. Następnie do każdej probówki dodaj 5 mL czystego RPMI i ostrożnie wymieszaj roztwór za pomocą pipety serologicznej o objętości 10 mL.Pozostawć kuleczki do osadzenia się i usunąć nadmiar medium. Powtórzyć procedurę płukania jeszcze raz za pomocą RPMI i usunąć całe nadmiarowe medium. Ostrożnie i powoli pobrać krew od zdrowego ochotnika i zebrać ją do neutralnej probówki polipropylenowej o pojemności dziewięciu mililitrów, bez przeciwzakrzepowego.Powoli przenieś osiem mililitrów krwi do każdej z probówek polipropylenowych zawierających dwa mililitry kulek pokrytych komórkami, tak aby uzyskać całkowitą objętość 10 mililitrów. Należy ostrożnie obchodzić się z krwią i kulkami, aby uniknąć przedwczesnej aktywacji EC. Ostrożnie przechyl mieszaninę krwi i kulek, aby zapewnić równomierne wymieszanie, a następnie zabezpiecz korek folią parafinową.Umieść probówki na poziomym stolem przechylnym przy łagodnych ustawieniach, w inkubatorze w temperaturze 37 °C i zarejestruj czasy krzepnięcia. W ustalonych odstępach czasu pobierz co najmniej 1,5 do 2 mL mieszaniny krwi z koralikami w celu analizy surowicy lub osocza. W przypadku pozyskiwania surowicy pozostaw krew do skrzepnięcia.Na koniec odwiruj probówki z prędkością 2 500 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przechowuj surowicę lub osocze w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Kuleczki mikronośników barwione na CD31 i jądra komórkowe wyraźnie wykazują konfluencję.Obserwacja wizualna pozwoliła ustalić, że wydłużenie czasu krzepnięcia można zaobserwować w przypadku obecności monowarstwy EC na powierzchni kulek mikronośników. Znaczny wzrost czasu krzepnięcia odnotowano przy obecności świńskich komórek śródbłonka aorty, PAEC GalTKO/hCD46/hTBM, na kuleczkach mikronośników, co sugeruje skuteczną modulację zarówno układu dopełniacza, jak i układu krzepnięcia. Po opanowaniu techniki inkubacja kuleczek pokrytych komórkami śródbłonka z nieantykoagulowaną ludzką krwią może zostać przeprowadzona w ciągu około sześciu godzin.Rzeczywisty czas trwania eksperymentu zależy głównie od czasu krzepnięcia, który jest obserwowany podczas doświadczenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić całkowite pokrycie mikrokulek komórkami śródbłonka oraz zapobiec przedwczesnej aktywacji ludzkiej krwi.

assessment-anticoagulant-anti-inflammatory-properties-endothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę hodowli monowarstwy komórek śródbłonka na całej wewnętrznej powierzchni 3D urządzenia mikrofluidycznego z kanałami o rozmiarze mikro-naczyniowym (&lt;30 μm). Ten model mikro-naczyniowy in vitro umożliwia badanie interakcji biofizycznych między komórkami krwi, komórkami śródbłonka a czynnikami rozpuszczalnymi w chorobach hematologicznych.

Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Brakuje dostępu do wiarygodnych modeli do badania interakcji naczyniowych krwi u ludzi. Przedstawiamy model in vitro hodowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka w połączeniu z ludzką krwią pełną w celu zbadania interakcji komórkowych zarówno we krwi (ELISA), jak i w przedziale naczyniowym (mikroskopia).

Nowatorski model in vitro do badania interakcji między ludzką krwią pełną a śródbłonkiem

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

Ten manuskrypt opisuje zastosowanie transgenicznych myszy reporterowych i różnych dróg podawania barwników fluorescencyjnych w nadciśnieniu wywołanym angiotensyną II za pomocą przyżyciowej mikroskopii wideo naczyń krwionośnych do oceny aktywacji komórek odpornościowych i ich zdolności do zwijania się i przylegania do śródbłonka.

Wizualizacja wałowania i adhezji leukocytów u myszy z infuzją angiotensyny II: techniki i pułapki

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy nowy protokół do badania i mapowania celowego osadzania nośników leków na komórkach śródbłonka w sfabrykowanych, rzeczywistych rozmiarach, trójwymiarowych modelach tętnic ludzkich pod przepływem fizjologicznym. Przedstawiona metoda może posłużyć jako nowa platforma do celowania w nosicieli leków w obrębie układu naczyniowego.

Modele tętnicze in vitro 3D z hodowlą komórkową do badania kierowania leków naczyniowych pod przepływem

Naucz się oceniać właściwości przeciwzakrzepowe komórek śródbłonka z wykorzystaniem nieantykoagulowanej krwi pełnej i hodowli 3D. Ta metoda pozwala badać mechanizmy krzepnięcia w badaniach kardiologicznych.

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal

Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów