4.7: Wprowadzenie do endocytozy i egzocytozy

Szlaki endocytarne i egzocytarne mają kluczowe znaczenie dla homeostazy komórkowej, funkcji tkanek i ogólnego przeżycia komórek. Mówiąc najprościej, endocytoza to proces, który komórka wykorzystuje do pobierania cząsteczek z przestrzeni zewnątrzkomórkowej poprzez zawijanie wokół niej błony i tworzenie pęcherzyka. Egzocytoza to proces odwrotny, który wykorzystuje pęcherzyki do uwalniania substancji do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Sugeruje się, że procesy te odgrywają kluczową rolę w wydzielaniu hormonów, internalizacji receptorów błonowych, pochłanianiu patogenów i komunikacji neuronalnej.

Dzisiaj prześledzimy niektóre z przełomowych odkryć w dziedzinie endocytozy i egzocytozy, podkreślimy niektóre z pytań, na które nie ma odpowiedzi, przedstawimy godne uwagi metody, które są obecnie stosowane, a na koniec przyjrzymy się kilku konkretnym eksperymentom przeprowadzonym w celu lepszego zrozumienia tych procesów.

Przyjrzyjmy się ponownie niektórym doniosłym odkryciom, które doprowadziły do obecnego zrozumienia endocytozy i egzocytozy.

Pierwsza dokumentacja związana z endocytozą może pochodzić z 1882 roku, kiedy to Ilya Metchnikov, używając mikroskopu świetlnego, zaobserwował, że określone komórki pochłaniają atakujące patogeny. Nazwał ten proces "fagocytozą", w której komórki pochłaniają patogen poprzez tworzenie pęcherzyków. Prawie pół wieku później, w 1931 roku, Warren Lewis zaobserwował podobny proces tworzenia pęcherzyków, gdy komórki pobierały płyn. Nazwał to zachowanie "pinocytozą".

Później, w 1953 roku, George Palade, badając strukturalną i funkcjonalną organizację komórki, odkrył "jaskiniowe" wgłębienia błon i nazwał je kaweolami. Wywnioskował, że muszą one być potrzebne do pobrania komórek. Wkrótce potem, w 1955 roku, laureat Nagrody Nobla Christian de Duve ukuł termin endocytoza, który obejmował "fagocytozę" i "pinocytozę". Jednak historia endocytozy jeszcze się nie skończyła.

W 1975 roku Michael Brown i Joseph Goldstein wraz z ekspertem w dziedzinie mikroskopii elektronowej Richardem Andersonem zaobserwowali, że gdy lipoproteina o niskiej gęstości lub LDL wiąże się z receptorem na powierzchni komórki, prowadzi to do powstania "pokrytych dołów". Doły te są następnie internalizowane, a receptory LDL endocytozy. Było to odkrycie trzeciego typu, zwanego "endocytozą za pośrednictwem receptora". W tym samym roku Barbara Pearse wyizolowała główne białko płaszcza, cząsteczkę triskelionu, i nazwała ją klatryną. Dlatego proces ten jest również nazywany "endocytozą za pośrednictwem klatryny".

To wszystko, jeśli chodzi o endocytozę. Porozmawiajmy teraz o tym, jak dowiedzieliśmy się o egzocytozie. W 1980 roku grupa Randy'ego Schekmana wygenerowała mutanty drożdży, które miały niedobór wydzielania i ujawniła obecność krytycznych genów kodujących białka niezbędne do egzocytozy.

W 1993 roku James Rothman zidentyfikował niektóre z tych białek i na podstawie ich chemicznej natury nazwano je SNARE. W swojej przełomowej "hipotezie SNARE" zaproponował, że te spiralne struktury łączą się ze sobą, powodując zbliżenie błon z wystarczającą siłą, aby się połączyć i wytworzyć egzocytozę.

Mniej więcej w tym samym czasie Thomas Südhof ustalił, że proces ten jest również ściśle kontrolowany w neuronach przez białka wyczuwające wapń zwane synaptotagminami, które sprzyjają i dokładnie synchronizują fuzję pęcherzyków w celu uwolnienia neuroprzekaźników. Naukowcy ci wspólnie otrzymali Nagrodę Nobla w 2013 roku.

Pomimo rozmachu tych odkryć, pozostaje wiele intrygujących zagadek. Rzućmy okiem na niektóre z pytań, które są dziś badane.

Naukowcy zaczynają zastanawiać się, w jaki sposób funkcje endocytozy i egzocytozy wykraczają poza pozyskiwanie i wydzielanie substancji. Na przykład, w jaki sposób neuroprzekaźniki są stale uwalniane przez pęcherzyki łączące się z błoną komórkową bez katastrofalnego wzrostu rozmiaru komórki? Próbują zidentyfikować sygnały, które powodują, że komórki internalizują błonę, aby zrównoważyć ekspansję i recykling zasobów.

Innym interesującym tematem jest: jakie składniki składają się na wyrafinowaną maszynerię molekularną, która napędza te procesy? Na przykład fagocytoza wymaga dużych deformacji błony, aby otoczyć atakujące patogeny. Naukowcy badają, w jaki sposób białka cytoszkieletu, takie jak aktyna, przyczyniają się do radykalnej przebudowy błony.

Wreszcie, ponieważ nieprawidłowa endocytoza i egzocytoza mogą prowadzić do poważnych chorób, naukowcy są zainteresowani zrozumieniem, co powoduje tę dysregulację. Jednym z badanych białek jest α-synukleina, której wydzielanie z neuronów jest zaangażowane w postępującą śmierć pobliskich neuronów. Zrozumienie jego egzocytozy może dostarczyć cennych informacji na temat leczenia chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Parkinsona.

Teraz, gdy rozważyliśmy niektóre z kluczowych pytań, które są badane, zobaczmy, jakie narzędzia są dostępne, aby na nie odpowiedzieć.

Naukowcy wykorzystują test biotynylacji komórek do śledzenia endocytozy białek powierzchniowych komórek. Proces ten polega na znakowaniu białka powierzchniowego fluorescencyjnie znakowaną biotyną, a następnie umożliwieniu komórce poddania się endocytozie. Po tym można przeprowadzić analizę plam immunologicznych, ujawniającą internalizację białek.

Aby określić ilościowo recykling pęcherzyków neuronalnych, wielu naukowców znakuje komórki cząsteczkami fluorescencyjnymi specyficznymi dla błony, takimi jak barwniki FM. Barwniki te stabilnie wiążą się z zewnętrznym płatkiem i są internalizowane tylko przez endocytozę. Po sekwencyjnej stymulacji są one poddawane egzocytozy. Analiza uwalniania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego pozwala na głębszy wgląd w cały proces recyklingu.

Często, aby manipulować i zrozumieć wkład składników, które umożliwiają egzocytozę, naukowcy przeprowadzają testy fuzji. Przygotowuje się dwa zestawy pęcherzyków z wyraźną zawartością barwnika fluorescencyjnego i pozostawia do połączenia. Fuzja między nimi prowadzi do powstania nowego produktu, który może być monitorowany za pomocą czytnika mikropłytek.

Wreszcie, zaawansowane metody obrazowania, w tym obrazowanie fluorescencyjne i obrazowanie fluorescencji żywych komórek, dają naukowcom wyjątkową okazję do zobrazowania struktur morfologicznych i zdarzeń molekularnych endocytozy i egzocytozy.

Na koniec przyjrzyjmy się kilku konkretnym sposobom, w jakie naukowcy wdrażają te narzędzia w dzisiejszych laboratoriach.

Biolodzy komórkowi są zainteresowani badaniem, w jaki sposób egzocytoza pomaga leczyć uszkodzone błony. W tym przypadku naukowcy najpierw uszkodzili komórki w roztworze barwników FM, tocząc po nich szklane kulki. Późniejsze obrazowanie fluorescencyjne pokazuje, że jeśli tempo egzocytozy jest szybkie, szybko uszczelni błonę i zatrzyma przeciekanie FM do komórki. Kiedy egzocytoza jest powolna, powoduje rozległe wewnątrzkomórkowe barwienie FM.

Naukowcy mogą wykorzystać testy fuzyjne do modelowania udziału określonych białek fuzyjnych. W tym przypadku naukowcy wykazywali ekspresję różnych białek błonowych związanych z pęcherzykami lub "VAMP", które są białkami SNARE, na powierzchni dwóch pul komórek. Następnie pozwolono na fuzję, a wynik określono ilościowo za pomocą spektrometru. Korzystając z tej konfiguracji, naukowcy byli w stanie porównać wydajność fuzji wielu VAMP.

Wreszcie, naukowcy starają się zrozumieć endocytozę receptorów powierzchniowych komórek w odpowiedzi na lek. W tym przypadku naukowcy potraktowali fluorescencyjnie znakowane komórki lekiem i zobrazowali endocytozę leczniczą receptora zachodzącą w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii poklatkowej.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do endocytozy i egzocytozy. W tym filmie dokonaliśmy przeglądu najważniejszych wydarzeń historycznych, począwszy od odkrycia fagocytozy, a skończywszy na zdefiniowaniu mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników. Następnie przedstawiliśmy kilka kluczowych pytań, które są zadawane. Przyjrzeliśmy się również najważniejszym strategiom badawczym i omówiliśmy niektóre z ich obecnych zastosowań. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!