Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC

Przedstawiamy protokół do badania wzajemnych oddziaływań między napromieniowanym promieniowaniem rentgenowskim Caco-2 a komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC). Protokół rozpoczyna się od napromieniania Caco-2 i ustanowienia kokultury z PBMC; następnie regularnie przez 48 godzin mierzy się przeznabłonkowy opór elektryczny, a western blot wykonuje się zarówno w Caco-2, jak i PBMC.

Ogólnym celem tego protokołu kokultury jest pomiar wpływu promieniowania jonizującego na przepuszczalność jednowarstwowej warstwy komórek nabłonka Caco-2 i funkcję ścisłego połączenia w obecności lub braku komórek jednojądrzastych krwi obwodowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii radiacyjnej i radioimmunoterapii dotyczące możliwych efektów synergicznych między ekspozycją na promieniowanie jonizujące a funkcjami komórek odpornościowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że różne bodźce i populacje komórek mogą być testowane i obserwowane zjawiska rozłączone za pomocą doraźnych pomiarów uzupełniających.

Procedury radioterapii mają na celu uwzględnienie monowarstwy komórek Caco-2, ponieważ objętość guza jest napromieniana odpowiednią wiązką i dokładną dozymetrią, tak jak ma to miejsce w przypadku radioterapii u pacjenta. Na tydzień przed ich napromieniowaniem wysiewaj pięć razy 10 do piątej komórki Caco-2 w dwóch mililitrach kompletnej pożywki do jednego sterylnego wkładki do hodowli komórkowej o średnicy jednego mikrometra na studzienkę w sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej. Dodaj trzy mililitry świeżej, kompletnej pożywki do dolnej komory każdej studzienki i umieść komórki w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% Co2 na siedem dni.

W ostatnim dniu inkubacji dodaj 25 mililitrów Ficollu do 50-mililitrowej stożkowej probówki. I ostrożnie ułóż 25 mililitrów świeżo zebranej pełnej krwi na Ficoll. Oddzielić komórki przez wirowanie w gradiacji gęstości.

I użyj pipety Pasteura, aby przenieść komórki jednojądrzaste krwi obwodowej lub PBMC na granicy faz do nowej 15-mililitrowej stożkowej probówki. Następnie umyj izolowany PBMC w dwóch 10-mililitrowych płukaniach PBS. I hodować PBMC w świeżej, kompletnej pożywce przez nie więcej niż trzy do pięciu godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Ustaw energię promieniowania rentgenowskiego fotonów na szczyt wynoszący sześć megawoltów. I umieść hodowlę komórkową Caco-2 na arkuszu pleksi o grubości 1,4 centymetra w obrębie trajektorii promieni rentgenowskich i 100 centymetrów od źródła promieniowania. Następnie umieść bolus o grubości 0,57 centymetra na każdej próbce, aby zagwarantować równowagę składowej promieniowania rozproszonego wstecznie i naładowanych cząstek.

Do napromieniowania komórek należy użyć płaskiego i symetrycznego pola promieniowania o wymiarach 20 na 20 centymetrów kwadratowych oraz dawki wynoszącej trzy graye na minutę. Aby ocenić aktywność metaboliczną i żywotność komórek Caco-2, wysiewaj dwa razy 10 do piątego komórki Caco-2 w każdym dołku 24-dołkowej płytki 24 godziny przed ich napromieniowaniem w 1,25 mililitra kompletnej pożywki. Następnie należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 21 godzin.

Następnego dnia dodaj 100 mikrolitrów po pięć miligramów na mililitr roztworu MTT do każdej studzienki i inkubuj komórki przez kolejne trzy godziny. Po umyciu komórek jednym mililitrem PBS, dodaj 500 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do każdej studzienki, aby rozpuścić wszelkie kryształy formazanu uwolnione przez komórki Caco-2 i oceń absorbancję za pomocą czytnika płytek wielodołkowych przy lambdzie 570 nanometrów. Aby ocenić żywotność komórek Caco-2, umyj komórki jednym mililitrem PBS na studzienkę, a następnie odłącz komórki 100 mikrolitrami roztworu trypsyny-EDTA przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Zatrzymaj reakcję za pomocą 500 mikrolitrów kompletnej pożywki i przenieś komórki do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych w celu odwirowania. Ponownie zawiesić granulki w 50 mikrolitrach PBS na probówkę i wymieszać powstałe zawiesiny komórek z równą objętością roztworu barwnika żywotności błękitu trypanowego. Po trzech minutach w temperaturze pokojowej policz liczbę żywotnych niebarwionych i nieżywotnych barwionych komórek w hemocytometrze.

Aby ocenić przeznabłonkową oporność elektryczną lub TEER komórek Caco-2, natychmiast po przeniesieniu napromieniania połowę hodowli komórkowej Caco-2 wprowadza się do nowej płytki z trzema mililitrami świeżej kompletnej pożywki w każdym dołku, a połowę wstawionych kultur do nowej płytki wysiewanej dwa razy 10 do szóstego PBMC na trzy mililitry kompletnej pożywki na studzienkę. Następnie co godzinę umieszczać elektrodę pałeczkową TEER we wkładzie do hodowli komórkowej przez pierwsze sześć godzin, a następnie co trzy godziny do 48 godzin po napromieniowaniu. W przypadku analizy Western blot, 48 godzin po ich napromieniowaniu liza komórek Caco-2 i PBMC z 40 mikrolitrami na jeden razy 10 do szóstych komórek buforu lizy komórek.

Podczas lizy i skrobania komórek Caco-2 należy uważać, aby nie odłączyć porowatej błony od wkładki, co może spowodować utratę lizatu komórkowego i stronniczy wynik. Przechowuj próbki zlizowanych komórek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po ilościowym określeniu całkowitej ilości białka w każdej próbce do lizy komórek metodą kwasu bicynkowego, dodać równe objętości buforu próbki Laemmli uzupełnionego beta-merkaptoetanolem do każdej całkowitej próbki białka w oddzielnych probówkach do mikrowirówek.

Podgrzewać próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zbierz zdenaturowane białka przez odwirowanie i załaduj równe całkowite objętości białka z każdej próbki do 4 do 20% prefabrykowanego żelu. Próbki należy badać przez godzinę pod napięciem 120 woltów.

Następnie użyj półsuchego systemu transferu elektrycznego, aby przenieść białka na membranę z polifluorku winylidenu. Następnie umieść membranę w pojemniku i zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w PBS uzupełnionym 0,2%Tween 20 przez 60 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Pod koniec inkubacji blokującej przemyć membranę trzykrotnie 10 mililitrami 0,2% PBS Tween 20 przez pięć minut na pranie i oznaczyć membranę odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.

Po całonocnej inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem, przemyć membranę trzykrotnie 0,2% PBS Tween 20, jak właśnie wykazano, i inkubować błonę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową przez 60 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Po trzech płukaniach PBS inkubować membranę z zestawem ulepszonego roztworu chemiluminescencyjnego. Następnie zobrazuj powstałą kliszę za pomocą odpowiedniego systemu skanowania i określ ilościowo wyniki za pomocą odpowiedniego programu do analizy obrazu.

Napromienianie do 10 grejów nie zmienia aktywności metabolicznej komórek Caco-2 po 24 lub 48 godzinach od napromieniania, chociaż żywotność komórek zmniejsza się z czasem przy obu dawkach. Ocena TEER niehodowanych komórek Caco-2 po ekspozycji na dwa graje napromieniowania ujawnia spójne wartości TEER do 48 godzin po napromieniowaniu. Jednak po 10 szarych napromieniowaniach komórki wykazują przedłużony spadek TEER, rozpoczynający się po trzech godzinach od napromieniowania.

Kokultura z PBMC powoduje zmniejszenie TEER, które jest widoczne od trzech godzin po napromienianiu w obu dawkach do 30 godzin po napromienianiu, w którym to momencie wartości TEER wydają się pozostawać względnie stałe. Analiza Western blot białek połączeń ścisłych nie wykazuje różnic w ekspresji Claudin-1 lub Okludyny w odpowiedzi na napromieniowanie i/lub kokulturę PBMC, podczas gdy duże wahania obserwuje się w różnych białkach rusztowania. Co więcej, białko całkowite NF-kappa B nie ulega zmianie przy żadnej dawce napromieniania, podczas gdy poziom białka XIAP jest czterokrotnie zwiększony przy obu dawkach.

Korzystając z tej procedury, można dodać inne bodźce biologiczne, takie jak enterobakterie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób różne bodźce biologiczne mogą modyfikować reakcję dobrej monowarstwy na ekspozycję na promieniowanie jonizujące. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć wpływ promieniowania jonizującego i komórek odpornościowych na przepuszczalność komórek Caco-2 i ekspresję kompleksu połączeń ścisłych.