Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro

Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu ważnych pytań w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego dotyczących wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej na różne etapy fizjologiczne i rozwojowe serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę porównawczą między matrycami zewnątrzkomórkowymi płodu i dorosłego człowieka poprzez zastosowanie podobnej metody decelularyzacji do obu typów tkanek. Tak więc metoda ta została z powodzeniem zastosowana do innych narządów, takich jak resekcje chirurgiczne u pacjentów z rakiem, ułatwiając badanie macierzy zewnątrzkomórkowej w różnych kontekstach.

Zacznij od krótkiego opłukania serc płodu i dorosłej myszy lodowatym PBS. Następnie umieść tkanki pod mikroskopem preparacyjnym i użyj prostych małych nożyczek, aby usunąć przedsionki, prawą komorę i przegrody z serc dorosłych myszy. Przenieś lewą komorę na nową szalkę Petriego i podziel wolną ścianę lewej komory na podłużne paski o grubości dwóch milimetrów.

Zastosowanie eksplantatów lewej komory dorosłej myszy o jednorodnej wielkości ma zasadnicze znaczenie dla stałej skuteczności decelularyzacji. Użyj skalpela i ząbkowanej pęsety z zakrzywioną końcówką, aby usunąć mięsień brodawkowaty, a następnie użyj siatki dwa na dwa milimetry, aby dalej zmielić paski na mniejsze fragmenty tkanki. Gdy cała tkanka zostanie zmielona, krótko opłucz kawałki wystarczającą ilością PBS, aby przykryć eksplantaty.

I przenieś serca płodu i kawałki dorosłej tkanki serca do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych zawierających 250 mikrolitrów optymalnej temperatury cięcia lub związku OCT na probówkę. Następnie zamroź próbki tkanki serca w izopentanie chłodzonym suchym lodem w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby zdecelularyzować tkanki kriokonserwowane, umieść zamrożone próbki na szalce Petriego zawierającej wystarczającą ilość PBS, aby całkowicie pokryć eksplantaty.

Po stopieniu OCT zanurzyć próbki w nowej szalce Petriego PBS i umyć próbki trzy razy na wytrząsarce przez 10 do 15 minut przy 60 obr./min na mycie. Po ostatnim płukaniu dodaj jeden mililitr działającego buforu hipotonicznego do każdej studzienki sterylnej 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i użyj cienkich kleszczyków, aby przenieść jeden fragment do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 18 godzin, przy 165 obr./min, a następnie trzy jednogodzinne płukania w jednym mililitrze PBS na studzienkę, na pranie.

Po ostatnim myciu dodaj jeden mililitr świeżo przygotowanego roztworu dodecylosiarczanu sodu lub SDS do każdej studzienki na 24-godzinną inkubację w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnego dnia przepłukać próbki trzema 20-minutowymi płukaniami w jednym mililitrze hipotonicznego buforu do płukania na przemycie, a następnie dodać jeden mililitr roztworu do traktowania DNazy do każdej studzienki na trzygodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji próbki pozbawione komórek powinny stracić konsystencję podobną do żelatyny.

Następnie przemyj fragmenty tkanki trzykrotnie jednym mililitrem PBS przez 20 minut na pranie, a następnie przemyj przez noc w jednym mililitrze świeżego PBS na studzienkę w temperaturze pokojowej i 60 obr./min. Aby ocenić usunięcie resztek komórkowych z tkanki pozbawionej komórek, następnego ranka utrwal próbki w jednym mililitrze świeżo przygotowanego 10% neutralnego buforu o formule uzupełnionej 0,03% wodnej eozyny na studzienkę przez 2,5 do trzech godzin w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyć próbki w jednym mililitrze PBS na studzienkę.

I użyj jednorazowej formy do próbek winylu, aby zakapsułkować pozbawione komórek fragmenty w żelu do przetwarzania histologicznego zgodnie ze specyfikacjami producenta. Następnie należy przenieść kapsułkowane fragmenty do kasety z zabudową do przetwarzania biopsji. I przetworzyć próbki do zatopienia parafiny poprzez kolejne 30-minutowe inkubacje w rosnących stężeniach etanolu, izoparafinowego roztworu węglowodorów alifatycznych i dwóch wynurzających się parafin o temperaturze 56 stopni Celsjusza.

Po pojawieniu się drugiej parafiny umieść próbki w bloku parafinowym i za pomocą mikrotomu uzyskaj skrawki o grubości trzech mikrometrów. Następnie sprawdź skuteczność decelularyzacji, barwiąc skrawki hematoksyliną i eozyną oraz trichromowymi barwnikami Massona zgodnie ze standardowymi protokołami. Po całonocnym płukaniu PBS z wstrząsaniem dodać 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego DPBS, uzupełnionego 2,5 mikrograma na mililitr roztworu antybiotyku amfoterycyny B 1% do każdego rusztowania.

I przechowuj próbki przez jeden do siedmiu dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed umieszczeniem komórek należy zastąpić roztwór DPBS 500 mikrolitrami podstawowego podłoża komórkowego uzupełnionego antybiotykami. I inkubować rusztowania przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji użyj mikroskopu, aby dodać czterolitrową kroplę DPBS do środka jednego dołka 96-dołkowej płytki na rusztowanie. I użyj cienkiej prostej pęsety, aby przenieść jedno rusztowanie bezkomórkowe na wierzch każdej kropli. Usuń wszelkie dodatkowe DPBS przez aspirację i upewnij się, że rusztowanie nie jest złożone ani pomarszczone.

Gdy rusztowania wyschną na krawędziach, powoli umieść zawiesinę pojedynczych komórek będących przedmiotem zainteresowania na szczycie każdego rusztowania. Embrionalne tkanki pozbawione komórek w dniu 18 charakteryzują się wysoce przezroczystą strukturą, podczas gdy dorosłe eksplantaty wykazują półprzezroczysty lub biały wygląd. Hematoksylina i eozyna oraz barwienie trichomami Massona potwierdzają skuteczne usuwanie komórek przez obecność porowatej siatki.

Materiał jądrowy jest redukowany o około 99,8% po decelularyzacji, w porównaniu z tkankami niemanipulowanymi, co jest niezbędne do uniknięcia wywołania niepożądanej reakcji zapalnej po implantacji. Żywotność komórek w rusztowaniach osadzonych może być monitorowana podczas hodowli in vitro poprzez barwienie kalceiną. Końcowa analiza repopulacji komórek i rozmieszczenia na rusztowaniach może być również przeprowadzona po przetworzeniu parafiny, jak zaobserwowano na tych reprezentatywnych obrazach centralnego przekroju biorusztowania.

Technika ta utorowała więc drogę naukowcom do badania bioaktywnych właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej z serc płodów i dorosłych myszy, ale także innych tkanek.