Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Ogólnym celem tego testu elektrochemiluminescencyjnego jest wykrycie atutoprzeciwciał wysp trzustkowych w autoimmunologicznej cukrzycy typu pierwszego, z wysoką czułością i wysoką swoistością. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cukrzycy typu pierwszego, takie jak czas inicjacji autoimmunizacji wysp trzustkowych i przewidywanie wysokiego ryzyka cukrzycy typu pierwszego. Główną zaletą tej techniki jest bardziej czułe, bardziej specyficzne dla choroby i nieradioaktywne w porównaniu z obecnymi standardowymi testami radioaktywnymi.

Implikacje tej techniki rozciągają się na przewidywanie i diagnozowanie cukrzycy typu pierwszego, ponieważ te autoprzeciwciała wysp trzustkowych pojawiają się miesiące lub lata przed objawową chorobą kliniczną. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w predykat cukrzycy typu pierwszego, może być również stosowana do badania innych chorób autoimmunologicznych, takich jak autoprzeciwciała przeciwko transglutaminazie w celiakii, TPO i tyreoglobulina w autoimmunologicznej chorobie tarczycy i kilku innych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że technika ta opiera się na wysokiej czułości i nieradioaktywności.

W przeciwieństwie do konwencjonalnej metody ELISA, która nie działa dobrze w przypadku wykrywania autoprzeciwciał wysp trzustkowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ test autoprzeciwciał insulinowych z leczeniem kwasem w surowicy jest trudny do opisania w tekście. Procedurę zademonstruje Yong Gu, doktor habilitowany z mojego laboratorium.

Najpierw wymieszaj ludzki autoantygen wysp trzustkowych z biotyną lub SULFO-TAG w stosunku od jednego do pięciu molowców w probówce. I przykryj rurkę folią aluminiową, ponieważ obie metki są wrażliwe na światło. Następnie inkubuj probówkę przez godzinę w temperaturze pokojowej.

W międzyczasie, gdy trwa inkubacja, zalać kolumnę wirową dwukrotnym buforem fosforanowym soli fizjologicznej. Następnie odwiruj kolumnę pod ciśnieniem 1000 razy większym niż grawitacja przez dwie minuty za każdym razem. Następnie odwiruj mieszaninę znaczników autoantygenu w kolumnie wirowej przy 1,000 razy grawitacji przez dwie minuty.

Następnie podwielokrotność i przechowywanie znakowanego antygenu w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Następnie użyj racjonalnego stężenia antygenu znakowanego biotyną SULFO-TAG na podstawie testu szachownicy dla buforu antygenowego, aby przygotować trzy mililitry roztworu antygenu na 96-dołkową płytkę. Następnie do każdej studzienki dodaj cztery mikrolitry surowicy i dostosuj końcową objętość do 20 mikrolitrów za pomocą jednokrotnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów znakowanego roztworu antygenu do każdej studzienki. I przykryj płytkę folią uszczelniającą, aby zapobiec światłu. Następnie przenieś płytkę na shaker w temperaturze pokojowej na dwie godziny.

Gdy shaker się zatrzyma, pozostaw talerz w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce na 18 do 24 godzin. Teraz wymieszaj 15 mikrolitrów surowicy z 18 mikrolitrami 0,5 molowego kwasu octowego dla każdej próbki i inkubuj to samo w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Na podstawie testu szachownicy należy użyć racjonalnego stężenia antygenu znakowanego biotyną SULFO-TAG do przygotowania roztworu antygenu.

Następnie podwielokrotność 35 mikrolitrów buforu antygenowego do każdej studzienki nowej płytki PCR. Tuż przed zakończeniem inkubacji mieszaniny surowicy dodać 3,8 mikrolitra jednego molowego buforu Tris o pH dziewięć, wzdłuż każdej studzienki na płytce antygenowej. Po zakończeniu inkubacji szybko przenieś 25 mikrolitrów surowicy poddanej działaniu kwasu octowego do każdej studzienki płytki antygenowej i wymieszaj roztwór.

Następnie przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła i umieść na shakerze w temperaturze pokojowej na dwie godziny. Po zakończeniu przenieś płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do lodówki i inkubuj przez 18 do 24 godzin. Wyjmij płytkę streptawidyny z lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i pozwól jej osiągnąć temperaturę pokojową.

Po osiągnięciu przez płytkę streptawidyny temperatury pokojowej dodać 150 mikrolitrów 3% blokera A do każdej studzienki i przykryć płytkę PCR folią uszczelniającą i inkubować w lodówce przez noc. Następnego dnia wyjmij płytkę streptawidyny z lodówki i wyrzuć bufor z studzienek. Następnie osusz talerz, kładąc go do góry nogami na ręcznikach papierowych, aby pozostały bufor nasiąkł.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów jednorazowego buforu PBST, aby umyć studzienkę przez trzy kolejne płukania. Następnie przenieś 30 mikrolitrów inkubacji antygenu surowicy do każdej studzienki płytki streptawidyny i przykryj płytkę folią, aby uniknąć światła. Następnie przenieś płytkę na shaker w temperaturze pokojowej na godzinę.

Po godzinie wyrzucić inkubację antygenu surowicy z płytki i dodać 150 mikrolitrów jednokrotnego buforu PBST, aby przemyć studzienkę trzy razy. Po zakończeniu mycia dodaj 150 mikrolitrów buforu odczytowego do każdej studzienki, aby odczytać na czytniku płytkowym. Przed analizą jakichkolwiek nieznanych próbek, punkt odcięcia testu dla każdego testu autoprzeciwciał został ustalony poprzez przetestowanie około 100 pacjentów z cukrzycą typu pierwszego i około 100 zdrowych osób z grupy kontrolnej.

Następnie wykreślono krzywą ROC w celu wyznaczenia optymalnego wskaźnika górnej granicy normy dla testu, który wynosił 0,023, tak aby uzyskać najlepszą czułość i swoistość. Następnie wynik nieznanej próbki obliczono za pomocą równania wyprowadzonego z wysokich dodatnich, niskich dodatnich i ujemnych wzorców kontroli. Następnie wykreślono wykres w celu określenia sygnałów uzyskanych w teście autoatibody wysp trzustkowych podczas inkubacji przeciwciała monoklonalnego insuliny z normalną surowicą ludzką w obecności i bez leczenia kwasem.

Wykres pokazuje, że sygnał jest wyraźnie zablokowany po dodaniu normalnej surowicy przy braku leczenia kwasem. Wręcz przeciwnie, uzyskany sygnał jest porównywalnie wyższy, gdy surowica jest poddawana działaniu kwasu przed inkubacją z przeciwciałem monoklonalnym insuliny. Podobny wykres został również wykreślony w celu określenia sygnałów uzyskanych przy użyciu surowic pacjenta zagranicznego w obecności i bez leczenia kwasem.

Traktowanie surowicy pacjenta kwasem przed inkubacją z przeciwciałem znacznie zwiększa sygnały w teście autoprzeciwciał wysp trzustkowych w porównaniu z brakiem leczenia. Po opanowaniu tej techniki można ją łatwo wykonać dla kilkuset próbek w ciągu jednego dnia, jeśli jest odpowiednio uformowana. Próbując tej procedury, należy pamiętać o wykonaniu testu szachownicy dla każdego testu autoprzeciwciał, aby zoptymalizować stan testu.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się autoimmunologiczną cukrzycą typu 1 do przewidywania i zapobiegania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo wykonać ten test. Nie zapominaj, że praca z próbkami surowicy może być niebezpieczna i zaraźliwa.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą.