Name: Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj testy elektrochemiluminescencyjne do wykrywania autoprzeciwciał wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1. Ta metoda oferuje wysoką czułość i swoistość, umożliwiając wczesną predykcję choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez DK32083 grantu NIH, JDRF Grant 2--2015-51-Q-R.

1. Przygotowanie bufora
<ol>
	<li>Bufor do znakowania (2x PBS, pH 7,9): W 400 ml destylowanej wody dejonizowanej (DD) dodaj 100 ml 10x PBS, dostosuj pH do 7,9 za pomocą NaOH.</li>
	<li>3 mM biotyny: Rozpuść 1 mg biotyny w 588 μl buforu znakującego.</li>
	<li>3 mM znacznika Sulfo: Rozpuść 150 nmol znacznika Sulfo w 50 μl buforu do znakowania.</li>
	<li>Bufor antygenowy (5% BSA): W 500 ml 1x PBS dodaj 25 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Przygotować 0,5 M roztwór kwasu octowego.</li>
	<li>1,0 M buforu Tris-HCl pH 9,0: Przygotuj 1 M bufor Tris-HCl i dostosuj pH do 9,0 za pomocą HCl.</li>
	<li>Bufor powlekający (3% Bloker A): W 500 ml 1x PBS dodać 15 g Blockera A.</li>
	<li>Bufor do płukania (0,05 % Tween 20, PBST): W 5000 ml 1x PBS dodaj 2,5 ml Tween 20.</li>
	<li>Bufor odczytu (2x bufor do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym): W 500 ml wody DD dodać 500 ml 4x buforu do odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym (tabela materiałów).</li>
	<li>Przechowuj biotynę i sulfo-tag w zamrażarce w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Zarówno roztwory Biotyny, jak i Sulfo-znacznika powinny być zawsze świeżo przygotowane tuż przed procedurą etykietowania.</li>
</ol>
2. Oznacz autoantygen ludzkich wysp trzustkowych za pomocą biotyny i znacznika Sulfo
Uwaga: Wysokie stężenie antygenu, ≥0,5 mg/ml, jest zalecane dla bardziej efektywnej reakcji znakowania.
<ol>
	<li>Określ stosunek molowy ludzkiego autoantygenu wysp trzustkowych dla biotyny i znacznika sulfo.
	<ol>
		<li>Liczbę molową antygenu należy uzyskać, dzieląc masę antygenu przez masę cząsteczkową.</li>
		<li>Dla antygenu o mniejszej masie cząsteczkowej (≤10 kd) należy zastosować stosunek molowy 1:5, a dla antygenu o większej masie cząsteczkowej (>50 kd) stosunek molowy 1:20.</li>
		<li>Oblicz objętość biotyny lub sulfo-znacznika, dzieląc liczbę molową przez jej stężenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj ludzki autoantygen wysp trzustkowych z biotyną lub znacznikiem sulfo o stosunku molowym 1:5, 
	UWAGA: Białko w systemach buforowych tris lub glicyny należy wymienić na bufor 2x PBS o pH 7,9 za pomocą kolumny wirowania według wielkości.</li>
	<li>Ponieważ Biotyna i Sulfo-tag są wrażliwe na światło, przykryj probówki reakcyjne folią aluminiową. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Podczas inkubacji należy zalać kolumnę wirową, trzykrotnie dozując 2x bufor PBS do kolumny. Odwirować roztwór o stężeniu 1000 x g przez 2 minuty za każdym razem. 
	UWAGA: Obecnie reakcja etykietowania, polegająca na mostkowaniu, nadal występuje i musi zostać zatrzymana.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję znakowania, oczyszczając znakowany autoantygen ludzkich wysp trzustkowych. Aby oczyścić, przepuścić autoantygen przez kolumnę wirową i odwirować kolumnę przy 1000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Oznaczyć znakowane stężenie antygenu (μg/μl) za pomocą ilości białka antygenu i objętości końcowej. 
	UWAGA: W przybliżeniu po każdym przejściu kolumny wirowania nastąpi 90 - 95% retencji znakowanego antygenu.</li>
	<li>Podwielokrotnić znakowany antygen i przechowywać znakowany antygen w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Zdefiniuj najlepsze stężenia i proporcje dla dwóch znakowanych antygenów do testu (test Checker Board)
<ol>
	<li>Przygotować dwie próbki surowicy, jedną wysoce dodatnią i jedną ujemną, o całkowitej objętości 200 μl dla każdej.</li>
	<li>Podaniec 4 μl surowicy i dodawać 1x PBS, aż ostateczna objętość wyniesie 20 μl na basenik dla 96-dołkowej płytki PCR. Użyj połowy płytki dla próbki o wysokim dodatnim wyniku, a drugiej połowy dla próbki ujemnej, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.</li>
	<li>Dodać 10 μl biotyny i 10 μl antygenu znakowanego sulfoznacznikiem i przeprowadzić seryjne rozcieńczenia dla dwóch różnie znakowanych antygenów, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 2A. Uruchomić poziome rozcieńczenie szeregowe dla jednego znakowanego antygenu i pionowe rozcieńczenie szeregowe dla drugiego znakowanego antygenu.</li>
	<li>Kontynuować pozostałe etapy oznaczania opisane w ppkt 5.3–9.1.</li>
	<li>Oblicz stosunek sygnałów z próbki o wysokim poziomie dodatnim do każdego z odpowiadających im sygnałów z próbki ujemnej pokazanej na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 2B.</li>
	<li>Zidentyfikuj najlepsze stężenia antygenów znakowanych biotyną i sulfo, wybierając punkt o najwyższym lub prawie najwyższym stosunku dodatnim do ujemnego. Weź pod uwagę niski sygnał tła z próbki ujemnej, aby określić stosunek. 
	Uwaga: Dzień testu 1 obejmuje etapy od 4 do 6.</li>
</ol>
4. Przygotuj bufor antygenowy, używając odpowiedniego stężenia antygenu znakowanego biotyną/sulfoznacznikiem
<ol>
	<li>Wybierz racjonalne stężenie każdego antygenu na podstawie testu szachownicy.</li>
	<li>Przygotować 3 ml roztworu antygenu na płytkę, stosując racjonalne stężenie antygenu znakowanego biotyną/sulfoznacznikiem dla buforu antygenowego.</li>
</ol>
5. Inkubuj próbki surowicy z oznakowanym antygenem
Uwaga: W tej sekcji są dwa protokoły, jeden bez leczenia kwasem w surowicy, a drugi z leczeniem kwasem w surowicy. Wszystkie testy autoprzeciwciał na wyspach trzustkowych, z wyjątkiem testu IAA, wykorzystują zwykły protokół bez leczenia kwasem w surowicy od kroków 5.1 do 5.5, podczas gdy test IAA pomija te kroki i stosuje protokół z leczeniem kwasem surowicy od kroków 5.6 do 5.9.
<ol>
	<li>Podaniec 4 μl surowicy i dodawać 1x PBS, aż ostateczna objętość wyniesie 20 μl na basenik dla 96-dołkowej płytki PCR.</li>
	<li>Dodać 20 μl znakowanego roztworu antygenu do dołka.</li>
	<li>Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.</li>
	<li>Umieść płytkę na wytrząsarce (niska prędkość) przy RT na 2 godziny.</li>
	<li>Umieścić płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C i inkubować przez noc (18 - 24 h). 
	Uwaga: Poniższy protokół kroków od 5.6 do 5.9 jest przeznaczony tylko dla testów IAA i innych testów autoprzeciwciał, pomiń te kroki.</li>
	<li>Zmieszać 15 μl surowicy z 18 μl 0,5 M kwasu octowego dla każdej próbki surowicy. Inkubować tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 45 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór antygenu o racjonalnym stężeniu antygenu znakowanego biotyną i sulfoznacznikiem, w oparciu o test szachownicy, używając buforu antygenowego. W każdym dołku podwielokrotność 35 μl buforu antygenowego, zawierającego biotynę i antygen znakowany sulfoznacznikiem, na nową płytkę PCR.</li>
	<li>Przed zakończeniem 45-minutowej inkubacji (etap 5.6) dodać 8,3 μl 1 M buforu Tris pH 9,0 z boku każdej studzienki na płytce antygenowej (krok 5.6). Ważne jest, aby ograniczyć mieszanie się buforu Tris z antygenem. Natychmiast przenieść 25 μl surowicy, którą w kroku 5.6 potraktowano kwasem, do każdej studzienki i wymieszać roztwór. Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła.</li>
	<li>Umieść płytkę na wytrząsarce (niskie obroty) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Umieść płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C i pozostaw płytkę do inkubacji przez noc (18 - 24 godziny).</li>
</ol>
6. Przygotuj płytkę ze streptawidyną
<ol>
	<li>Wziąć płytkę ze streptawidyną z lodówki o temperaturze 4 °C i pozostawić ją do zamontowania w temperaturze RT.</li>
	<li>Gdy płytka streptawidyny znajdzie się w temperaturze pokojowej, dodaj 150 μl 3% blokera A do każdej studzienki.</li>
	<li>Przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą.</li>
	<li>Inkubować płytkę w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc. 
	nuta: Dzień testu 2 obejmuje etapy od 7 do 9.</li>
</ol>
7. Surowica/antygen transferowy inkubuje się na płytkę streptawidyny
<ol>
	<li>Następnego dnia wyjmij płytkę ze streptawidyną z lodówki i wyrzuć bufor z płytki. Rozłóż na stole suche ręczniki papierowe i postukaj talerzem do góry nogami, aż w studzienkach nie będzie już bufora.</li>
	<li>Napełnij pustą płytkę streptawidyny 150 μl PBST na studzienkę i wyrzuć PBST z płytki, co daje łącznie trzy prania.</li>
	<li>Przenieść 30 μl inkubacji surowicy/antygenu na dołek do płytki streptawidyny.</li>
	<li>Przykryj talerz folią, aby uniknąć światła. Potrząsaj płytką na niskim poziomie w temperaturze RT przez 1 godzinę.</li>
</ol>
8. Umyj płytkę i dodaj bufor do odczytu
<ol>
	<li>Wyrzuć inkubatory z płytki. Dodać 150 μl PBST do dołka i wyrzucić PBST z płytki, w sumie trzy prania.</li>
	<li>Po umyciu dodać 150 μl do studzienki buforu odczytowego. 
	UWAGA: Ważne jest, aby nie dopuścić do powstania pęcherzyków powietrza w roztworze, ponieważ wpłynie to na sposób odczytywania tabliczki na czytniku płytek.</li>
</ol>
9. Odczyt tabliczki i analiza danych
<ol>
	<li>Policz tabliczkę na czytniku płyt. Wartości przeciwciał są wyświetlane jako liczby na sekundę (CPS).</li>
	<li>Przekaż poziomy przeciwciał otrzymane z czytnika płytek jako wskaźnik względny. Oblicz indeks z następującego równania: 
	Wartość indeksu = [CPS (próbka) - CPS (kontrola ujemna)] / [CPS (kontrola dodatnia) - CPS (kontrola ujemna)].</li>
	<li>Zidentyfikuj pozytywne i ujemne wyniki przeciwciał za pomocą wartości odcięcia dla dodatniości, zdefiniowanej na podstawie 99. percentyla 100 zdrowych osób kontrolnych (osoby bez cukrzycy bez znanych chorób autoimmunologicznych i które nie mają historii cukrzycy w rodzinie).</li>
</ol>

<ol><li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+presymptomatic+type+1+diabetes%3A+a+scientific+statement+of+JDRF%2C+the+Endocrine+Society%2C+and+the+American+Diabetes+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li>
<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li>
<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(13)60591-7/abstract">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li>
<li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25665818">TEDDY Study Group. Predictors of progression from the appearance of islet autoantibodies to early childhood diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY).</a> Diabetes Care. 38 (5), 808-813 (2015).</li>
<li>Krischer, J. P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4393776/">TEDDY Study Group. The 6 year incidence of diabetesassociated autoantibodies in genetically at-risk children: the TEDDY study.</a> Diabetologia. 58 (5), 980-987 (2015).</li>
<li>Achenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+of+type+1+diabetes+risk+on+the+basis+of+islet+autoantibody+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Stratification of type 1 diabetes risk on the basis of islet autoantibody characteristics.</a> Diabetes. 53 (2), 384-392 (2004).</li>
<li>Achenbach, P., Bonifacio, E., Koczwara, K., Ziegler, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54 (Suppl. 2), S25-S31 (2005).</li>
<li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+of+islet+autoantibody+appearance+and+mean+levels+of+insulin%2C+but+not+GAD+or+IA-2+autoantibodies%2C+predict+age+of+diagnosis+of+type+1+diabetes%3A+diabetes+autoimmunity+study+in+the+young%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: diabetes autoimmunity study in the young.</a> Diabetes Care. 34 (6), 1397-1399 (2011).</li>
<li>Achenbach, P., Koczwara, K., Knopff, A., Naserke, H., Ziegler, A. G., Bonifacio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+high-affinity+immune+responses+to+%28pro%29insulin+anticipate+the+autoimmune+cascade+that+leads+to+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes.</a> J Clin Invest. 114 (4), 589-597 (2004).</li>
<li>Yu, L., Dong, F., Miao, D., Fouts, A. R., Wenzlau, J. M., Steck, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinsulin%2Finsulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Proinsulin/insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li>
<li>Yu, L., Miao, D., Scrimgeour, L., Johnson, K., Rewers, M., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk%3A+nonradioactive+bivalent+proinsulin%2Finsulin+autoantibody+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li>
<li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li>
<li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+%28ECL%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Methods Mol Biol. 1433, 85-91 (2016).</li>
<li>Myler, H. A., McVay, S., Kratzsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+PEG-hGH+detection+supporting+pharmacokinetic+evaluation+in+growth+hormone+deficient+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting PEG-hGH detection supporting pharmacokinetic evaluation in growth hormone deficient patients.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61 (2), 92-97 (2010).</li>
<li>Zhong, Z. D., Dinnogen, S., Hokom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+inhibition+of+drug+target+interference+in+immunogenicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays.</a> J Immunol Methods. 355 (1-2), 21-28 (2010).</li>
<li>Barker, J. M., Yu, J., Yu, L., Wang, J., Miao, D., Bao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody+%22subspecificity%22+in+type+1+diabetes%3A+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li>
<li>Triolo, T. M., Armstrong, T. K., McFann, K., Yu, L., Rewers, M. J., Klingensmith, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+autoimmune+disease+found+in+33%25+of+patients+at+type+1+diabetes+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Additional autoimmune disease found in 33% of patients at type 1 diabetes onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li>
<li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Neth J Med. 65 (7), 235-247 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Autoprzeciwciała wysp trzustkowych są obecnie najbardziej wiarygodnymi biomarkerami autoimmunizacji cukrzycy typu 1. Wskazują one początek autoimmunizacji specyficznej dla wysp trzustkowych i określają jawne ryzyko choroby. Test ECL dla autoprzeciwciał wysp trzustkowych został szeroko zwalidowany w wielu krajowych i międzynarodowych badaniach klinicznych dotyczących cukrzycy typu 1. Test wykazał zwiększoną czułość i swoistość w porównaniu z obecnymi "złotymi" standardami RBA. Test ECL wykazał swoją nadrzędną przewagę w zakresie wyższej swoistości choroby poprzez odróżnienie autoprzeciwciał wysp trzustkowych o wysokim powinowactwie i wysokim ryzyku od sygnałów niskiego ryzyka i niskiego powinowactwa generowanych przez RBA. Jest to szczególnie zauważalne u osób, które są tylko dodatnimi autoprzeciwciałami przeciwko pojedynczym wyspom trzustkowym i nigdy nie rozwinęły się do cukrzycy typu 1. Stwierdzono, że większość z tych autoprzeciwciał o niskim powinowactwie została utracona podczas badań kontrolnych przeprowadzonych w ciągu kilku miesięcy lub lat, zachowując się jako "przejściowo dodatnie". Jak wcześniej przypuszczano, te "pojedyncze" autoprzeciwciała o niskim powinowactwie prawdopodobnie powstały w wyniku immunizacji cząsteczką reagującą krzyżowo. Podczas gdy wyższe powinowactwo, autoprzeciwciała wysp trzustkowych wyższego ryzyka wynikały z immunizacji samymi antygenami wysp trzustkowych. Ponadto testy ECL wykazały zdolność do wyprzedzania czasu "serokonwersji" z obecnych standardowych testów wiązania promieniotwórczego (RBA) o lata u dzieci ze stanem przedcukrzycowym, u których od urodzenia obserwowano cukrzycę kliniczną. Trwające międzynarodowe badanie kliniczne "The Environmental Determinants of Diabetes in the Young" (TEDDY) opiera się na dokładnym wykrywaniu, aby określić czas i pojawienie się "serokonwersji" pierwszego autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym, aby wyznaczyć sam początek autoimmunizacji wysp trzustkowych i zidentyfikować czynniki środowiskowe. Możliwym powodem zwiększonej czułości w teście ECL jest to, że test obejmuje wszystkie klasy immunoglobulin: IgG, IgM, IgA lub IgE, a nie tradycyjne RBA lub ELISA, które opierają się tylko na wykryciu IgG.
W testach ECL, dla niektórych szczególnych autoprzeciwciał, takich jak IAA, wiązanie autoprzeciwciał z antygenem wydaje się być hamowane przez jakiś składnik obecny w normalnej ludzkiej surowicy. Aby usunąć lub uwolnić to hamowanie, konieczne było poddanie próbek surowicy działaniu kwasu przed inkubacją surowicy z antygenem. Jak pokazano w [Figura 5], test ECL-IAA, aktywność wiązania zarówno mysiego przeciwciała monoklonalnego insuliny, jak i autoprzeciwciał w surowicy pacjentów z antygenem została znacznie zwiększona. Zakwaszenie próbek surowicy, stosowane w testach przeciwciał, jest zwykle stosowane w celu odłączenia wcześniej istniejących związanych kompleksów. Mechanizm hamowania sygnałów IAA w próbkach surowicy ludzkiej i uwalniania przez zakwaszenie surowicy nie jest znany, ale metoda ta została zastosowana w innych testach opartych na ECL14,15.
W kilku przypadkach, podczas znakowania cząsteczek, zarówno biotyny, jak i znacznika sulfo, pozycje znakowania wewnątrz cząsteczek białka antygenu znajdują się na lub bardzo blisko kluczowych epitopów wiązania przeciwciał, co może zakłócać aktywność wiązania z przeciwciałami. Zmniejszy to czułość testu i może całkowicie go zniszczyć. W przypadku rutynowej procedury znakowania pożądana jest maksymalizacja lub nasycenie dla każdej cząsteczki białka antygenowego, aby wygenerować maksymalną aktywność lub sygnał na znakowaną cząsteczkę poprzez maksymalizację zdolności znakowania każdej możliwej pozycji znakowania. Znakowanie nienasycone powinno być przeprowadzane poprzez zmniejszenie stosunku molowego cząsteczek znakujących (biotyny i znacznika sulfo) do białka antygenu, jeśli znakowanie antygenu staje się możliwą przyczyną przerwania aktywności wiązania przeciwciał. Główne epitopy mogą być lepiej zarezerwowane, a przerwanie aktywności wiązania przeciwciał może zostać uwolnione przy użyciu strategii znakowania nienasyconego w większości przypadków.
Każdy test powinien zawierać wzorzec wewnętrzny o wysokiej kontroli dodatniej i ujemnej do obliczeń indeksu nieznanych próbek. Niski poziom kontroli dodatniej w pobliżu górnej granicy normalnych kontroli testu jest ważny, aby uwzględnić go przy monitorowaniu czułości testu. Laboratorium powinno przechowywać wystarczającą ilość podwielokrotności standardowych kontroli dodatnich i ujemnych do długotrwałego stosowania, a wszystkie podwielokrotności powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C. W celu zapewnienia jakości badania muszą być przeprowadzane w dwóch egzemplarzach dla każdej próbki, a każdy pozytywny wynik powinien być potwierdzony poprzez powtórzenie próbki w oddzielnym badaniu. Trzecie badanie jest konieczne, gdy drugi test potwierdzający nie zgadza się z pierwszym testem, a wyniki dwóch testów, które są zgodne (np. +,+ lub -,-), będą ostatecznym określeniem wyniku dodatniego lub ujemnego.
Dzięki platformie ustawionej do pojedynczych testów ECL, test multipleksowany może być rozszerzony na ich podstawie. Może jednocześnie oznaczać do 10 różnych autoprzeciwciał w jednym dołku przy użyciu niewielkiej ilości surowicy. Obecnie cztery autoprzeciwciała przeciwko wyspom trzustkowym, w tym IAA,, IA-2A i ZnT8A, mają równe znaczenie w przewidywaniu ryzyka progresji do T1D zarówno u krewnych pacjentów z cukrzycą typu 1, jak i w populacji ogólnej. Metody stosowane do badań przesiewowych tych 4 autoprzeciwciał przy użyciu obecnych pomiarów pojedynczych autoprzeciwciał są pracochłonne i nieefektywne, szczególnie w przypadku badań przesiewowych populacji na dużą skalę. Co ważne, nawet 40% pacjentów z cukrzycą typu 1 ma dodatkową chorobę autoimmunologiczną 16,17,18. Niestety, nie ma łatwego i niedrogiego narzędzia do badania przesiewowego pod kątem tych warunków. Multipleksowy test ECL jest nie tylko w stanie połączyć 4 obecne testy autoprzeciwciał głównych wysp trzustkowych w jeden, ale także jest w stanie połączyć więcej testów autoprzeciwciał z innych istotnych chorób autoimmunologicznych. Umożliwia to skuteczne przeprowadzanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku wielu chorób autoimmunologicznych jednocześnie w dużych populacjach. W multipleksowym teście ECL, jak pokazano na [Ryc. 6], każdy kompleks przeciwciało-antygen utworzony w fazie płynnej zostanie ograniczony do określonego miejsca źródła łącznika w tej samej studzience. Odbiornik sygnału na czytniku płytek jest w stanie rozpoznać sygnały z 10 różnych źródeł plamek. Jednak plamki o bardzo wysokim sygnale mogą generować wysokie tło testu i powodować zakłócenia w sąsiednich miejscach poprzez przesłuchy. Z tego powodu górny limit sygnałów dla każdego testu autoprzeciwciał powinien być ograniczony do mniej niż 20 000 zliczeń. Z naszego doświadczenia wynika, że autoprzeciwciała o niższym tle powinny być umieszczone stosunkowo daleko od tych miejsc, w których ich liczba jest wyższa, gdy projektowana jest mapa punktowa. W przypadku badań długoterminowych z wykorzystaniem multipleksowych testów ECL zaleca się stosowanie tego samego łącznika do tego samego testu autoprzeciwciał, aby zachować spójność testu.

Niedawno stworzono system klasyfikacji stopnia zaawansowania, aby pomóc w diagnozowaniu początkowych stadiów T1D u pacjentów. Dokładne wykrycie ludzkich autoprzeciwciał wysp trzustkowych odgrywa ważną rolę w identyfikacji i ocenie stopnia zaawansowania przedobjawowej cukrzycy typu 1, ponieważ obecność autoprzeciwciał wysp trzustkowych wskazuje na obecność autoimmunizacji komórek β. Szybkość, z jaką cukrzyca dotyka pacjentów od początkowego wystąpienia autoimmunizacji komórek β do objawowej choroby, związanej z liczbą i typem autoprzeciwciał wysp trzustkowych, jest zmienna2,3.
Wiek serokonwersji autoprzeciwciał, miano i powinowactwo autoprzeciwciał wysp trzustkowych mogą wpływać na tempo progresji do objawowej cukrzycy typu 14,5,6,7,8,9,10. Ostatnio opracowane testy ECL zostały szeroko zwalidowane, wykazały zwiększoną czułość i są bardziej specyficzne dla choroby10,11,12,13. Testy te poprawiają przewidywanie i ocenę stopnia zaawansowania cukrzycy poprzez wcześniejsze wykrywanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych. Dokładniej oznaczają one inicjację autoimmunizacji wysp trzustkowych i ignorują sygnały o niskim powinowactwie i niskim ryzyku, które nie mają związku z cukrzycą.
W teście ECL, autoprzeciwciała w surowicy, jeśli są obecne, łączą antygen sprzężony z Sulfo-tag z biotynylowanym antygenem wychwytywania w fazie płynnej. Po zmostkowaniu łącznik biotyny jest wychwytywany w fazie stałej i wykrywany przez ECL przez znacznik sulfo na płytce pokrytej streptawidyną (ryc. 1).
W tym przeglądzie, testy ECL pojedynczego przeciwciała z autoprzeciwciałami ludzkich wysp trzustkowych są głównie wykorzystywane. Pokrótce omówione zostaną multipleksowane testy przeciwciał oparte na pojedynczych testach ECL. Test multipleksowy można wykorzystać do identyfikacji wielu, do 10 autoprzeciwciał w jednym dołku, przy użyciu 15 μl surowicy. Ten prosty, wysokoprzepustowy test może być stosowany do jednoczesnych badań przesiewowych wielu autoprzeciwciał pod kątem wielu istotnych chorób autoimmunologicznych w populacji ogólnej.

<table><tbody><tr><td>Ludzkie rekombinowane białko proinsuliny (PINS)</td><td>AmideBio</td><td>Ludzka proinsulina, Rec</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie rekombinowane białko GAD65</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie rekombinowane białko IA-2</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka PCR&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Talerz pokryty streptawidyną</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna spinowa do wymiarowania Zeba</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>Twen-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-tag</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>Bloker A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr><td>4x Bufor odczytu T ze środkiem powierzchniowo czynnym</td><td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-PEG4-Biotyna</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)</td><td>Marka Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka streptawidyny</td><td>MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Kolumna odsalająca</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa wytrząsarka do płytek</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>MSD</td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z kubełkiem obrotowym</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Wskazanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych związanych z cukrzycą typu 1 (T1D) prowadzi do rozprzestrzeniania i powstrzymywania tej choroby w populacji ogólnej. Nowy test ECL to nieradioaktywny test fazy płynnej dla autoprzeciwciał wysp trzustkowych o wyższej czułości i swoistości niż obecny "złoty" standardowy test wiązania promieniotwórczego (RBA). Testy ECL mogą bardziej precyzyjnie określić początek przedobjawowej cukrzycy typu 1 poprzez odróżnienie autoprzeciwciał wysokiego ryzyka i wysokiego powinowactwa od autoprzeciwciał niskiego ryzyka i niskiego powinowactwa generowanych w RBA i konwencjonalnych testach immunoenzymatycznych (ELISA). Białko antygenowe użyte w tym teście ECL jest znakowane odpowiednio znacznikiem sulfo i biotyną. Każdy test autoprzeciwciał ECL, który wykorzystuje określone białko antygenowe, wymaga etapu optymalizacji, zanim będzie mógł zostać wykorzystany do zastosowań laboratoryjnych. Ten krok jest szczególnie istotny przy określaniu wymagań dotyczących leczenia kwasami w surowicy, stężeń i proporcji dwóch różnych antygenów znakowanych sulfoznacznikiem i biotyną. Aby wykonać test, próbki surowicy miesza się z białkiem antygenu wychwytującego sprzężonym z sulfo-znacznikiem i biotynylowanym w roztworze buforowanym fosforanem (PBS), zawierającym 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Następnie próbki są inkubowane przez noc w temperaturze 4 °C. Tego samego dnia przygotowuje się płytkę pokrytą streptawidyną z buforem blokującym i inkubuje przez noc w temperaturze 4 °C. Drugiego dnia umyj płytkę streptawidyny i przenieś mieszaninę surowicy i antygenu na płytkę. Umieścić płytkę na wytrząsarce do płytek, ustawić ją na niskich obrotach i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie płyta jest ponownie myta i dodawany jest bufor czytnika. Tabliczka jest następnie zliczana na czytniku płytek. Wyniki są przenoszone przez indeks, który jest generowany z próbek surowicy kontrolnej dodatniej i ujemnej wzorca wewnętrznego.

Rycina 2 przedstawia analizę szachownicową (checker board). Wykazano, że stężenia 250 ng/mL biotyny oraz 250 ng/mL antygenu znakowanego Sulfo-tag są najbardziej optymalnymi stężeniami do zastosowania w teście, biorąc pod uwagę sygnały z próbki silnie dodatniej kontroli, próbki kontroli ujemnej jako tła testu oraz stosunek sygnałów dodatnich do ujemnych. Przy zoptymalizowanych stężeniach tych dwóch znakowanych antygenów test przeprowadzono z próbkami surowicy od 100 nowo zdiagnozowanych pacjentów z T1D oraz 100 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Wartość wskaźnika 0,023 zdefiniowano jako punkt odcięcia (cut-off) testu dla wyników dodatnich. Reprezentuje to 85% czułości u pacjentów i 99% swoistości w grupie kontrolnej, co określono na podstawie krzywej charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) przedstawionej na Rycini 3A. Analiza nieznanych próbek została przeprowadzona z wykorzystaniem wewnętrznych standardów: silnie dodatnich, słabo dodatnich oraz próbek kontroli ujemnej. Wyniki zliczeń CPS przedstawiono w Tabeli 2A. Średnie wartości CPS dla kontroli silnie i słabo dodatnich wyróżniono na czerwono: 17903 [(19940+15866)/2] oraz 839 [(857+820)/2], natomiast kontrole ujemne wyróżniono na zielono: 168 [(170+165)/2]. Wskaźnik dla nieznanych próbek oblicza się według wzoru „(CPSpróbki-168)/(17903-168)”. Tabela 2B przedstawia obliczone wartości wskaźnika dla wszystkich próbek. Wartości wskaźnika większe od 0,023 zapisano na czerwono, co odpowiada wartościom CPS również zaznaczonym na czerwono w Tabeli 2A. Wartości te definiuje się jako wyniki dodatnie, które przekraczają 99-ty percentyl populacji zdrowej grupy kontrolnej. W przypadku zastosowania nieoptymalnego stężenia antygenu test będzie charakteryzował się wysokim tłem, co pokazano w Tabeli 2C. Niskie poziomy przeciwciał dodatnich zostaną pominięte, tak jak wartości A2, A5, D1 i H4 wyróżnione na szaro w Tabeli 2D.
<img alt="Schemat analizy elektrochemiluminescencyjnej; metoda wykrywania autoprzeciwciał przeciwinsulinowych z użyciem znaczników ECL." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ilustracja bivalentnego wychwytywania na płytce w pojedynczym teście ECL-IAA. Autoprzeciwciało przeciwko wysepkom trzustkowym w surowicy tworzy mostek między antygenem sprzężonym z Sulfo-tag a biotynilowanym antygenem wychwytującym, który jest wiązany w fazie stałej na płytce pokrytej streptawidyną. Detekcja wychwyconego na płytce antygenu sprzężonego z Sulfo-tag odbywa się za pomocą ECL. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Yu, et al.11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres krzywej ROC; czułość vs 1-swoistość; analiza wydajności klasyfikacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Krzywa ROC służąca do wyznaczenia punktu odcięcia dla dodatniego wyniku testu. Wybrano 99ty percentyl swoistości odpowiadający czułości 85%, który został przedstawiony jako wartość wskaźnika 0,023. Ta górna granica testu została wyznaczona na podstawie 100 zdrowych kontroli. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu MSD IAA, MoAb i surowice pacjentów, wykresy przedstawiające poziomy IAA w zależności od objętości próbki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ilustracja blokowania sygnałów ECL-IAA przez prawidłową ludzką surowicę. A: Sygnały z testów ECL-IAA z przeciwciałem monoklonalnym (MoAb) przeciw insulinie zostały drastycznie zablokowane po dodaniu prawidłowej ludzkiej surowicy. W porównaniu z MoAb w PBS, sygnał został częściowo przywrócony po poddaniu ludzkiej surowicy działaniu kwasu. B: Sygnały z testu ECL-IAA z 4 surowicami pacjentów uległy znacznemu wzmocnieniu po obróbce kwasem. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Yu, et al.11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat multipleksowego testu ECL z oznakowanymi antygenami, łącznikami streptawidynowymi i układem mikropłytki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Ilustracja multipleksowego testu ECL. Kompleksy przeciwciało-antygen tworzą się w fazie ciekłej z zastosowaniem specyficznych łączników. Specyficzne kompleksy przeciwciało-antygen-łącznik są unieruchamiane na poszczególnych miejscach dla konkretnych łączników w tej samej studzience. Czytnik płytek jest w stanie rozróżnić sygnały pochodzące z różnych punktów i podaje wartości CPS w 10 różnych kanałach. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela danych z testu ELISA przedstawiająca stężenia biotyny i SULFO-TAG wraz z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi." src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Test szachownicy (checker board assay) do wyznaczenia stężeń i stosunków antygenów znakowanych biotyną i Sulfo-tagiem. A: Surowe wartości zliczeń CPS dla płytki szachownicy z wysokopozytywnym surowicą na połowie płytki i surowicą negatywną na drugiej połowie. Stężenie antygenu biotynylowanego rozcieńczano szeregowo w poziomie, a stężenie antygenu znakowanego Sulfo-tagiem rozcieńczano szeregowo w pionie. B: Wartości stosunku zliczeń CPS z wysokopozytywnej surowicy do odpowiadających im zliczeń CPS z surowicy negatywnej. Podświetlone na żółto studzienki reprezentują najlepszy stosunek wyników pozytywnych do negatywnych w panelu B. Stosunek ten odpowiada stężeniom 250 ng/mL antygenu znakowanego biotyną oraz 250 ng/mL antygenu znakowanego Sulfo-tagiem w panelu A, przy akceptowalnie niskim zliczeniu CPS dla surowicy negatywnej. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.</a>
<img alt="Równania równowagi statycznej; tabela analizy danych; porównanie zbiorów danych numerycznych; badania edukacyjne." src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 2"> 
Tabela 2: Analiza wyników testu. A: Surowe wartości zliczeń CPS z płytki testowej, w której standardowe wysokie i niskie kontrole pozytywne zaznaczono na czerwono, a standardowe kontrole negatywne na zielono. Każda próbka została wykonana w dublecie. B: Obliczone wartości indeksu zgodnie z opisem w protokole testu. Każda wartość indeksu większa niż 0,023 została zdefiniowana jako wynik pozytywny i zaznaczona na czerwono. C: Surowe wartości zliczeń CPS z płytki testowej dla tego samego zestawu próbek przy zastosowaniu nieracjonalnego stężenia antygenu. Skutkowało to wysokim tłem, a niektóre niskie wyniki pozytywne, wykryte normalnie (jak pokazano w panelu B), zmieniły się w wyniki negatywne, zaznaczone na szaro w panelu D. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.</a>

Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Ogólnym celem tego testu elektrochemiluminescencyjnego jest wykrycie atutoprzeciwciał wysp trzustkowych w autoimmunologicznej cukrzycy typu pierwszego, z wysoką czułością i wysoką swoistością. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie cukrzycy typu pierwszego, takie jak czas inicjacji autoimmunizacji wysp trzustkowych i przewidywanie wysokiego ryzyka cukrzycy typu pierwszego. Główną zaletą tej techniki jest bardziej czułe, bardziej specyficzne dla choroby i nieradioaktywne w porównaniu z obecnymi standardowymi testami radioaktywnymi.Implikacje tej techniki rozciągają się na przewidywanie i diagnozowanie cukrzycy typu pierwszego, ponieważ te autoprzeciwciała wysp trzustkowych pojawiają się miesiące lub lata przed objawową chorobą kliniczną. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w predykat cukrzycy typu pierwszego, może być również stosowana do badania innych chorób autoimmunologicznych, takich jak autoprzeciwciała przeciwko transglutaminazie w celiakii, TPO i tyreoglobulina w autoimmunologicznej chorobie tarczycy i kilku innych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że technika ta opiera się na wysokiej czułości i nieradioaktywności.W przeciwieństwie do konwencjonalnej metody ELISA, która nie działa dobrze w przypadku wykrywania autoprzeciwciał wysp trzustkowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ test autoprzeciwciał insulinowych z leczeniem kwasem w surowicy jest trudny do opisania w tekście. Procedurę zademonstruje Yong Gu, doktor habilitowany z mojego laboratorium.Najpierw wymieszaj ludzki autoantygen wysp trzustkowych z biotyną lub SULFO-TAG w stosunku od jednego do pięciu molowców w probówce. I przykryj rurkę folią aluminiową, ponieważ obie metki są wrażliwe na światło. Następnie inkubuj probówkę przez godzinę w temperaturze pokojowej.W międzyczasie, gdy trwa inkubacja, zalać kolumnę wirową dwukrotnym buforem fosforanowym soli fizjologicznej. Następnie odwiruj kolumnę pod ciśnieniem 1000 razy większym niż grawitacja przez dwie minuty za każdym razem. Następnie odwiruj mieszaninę znaczników autoantygenu w kolumnie wirowej przy 1,000 razy grawitacji przez dwie minuty.Następnie podwielokrotność i przechowywanie znakowanego antygenu w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza. Następnie użyj racjonalnego stężenia antygenu znakowanego biotyną SULFO-TAG na podstawie testu szachownicy dla buforu antygenowego, aby przygotować trzy mililitry roztworu antygenu na 96-dołkową płytkę. Następnie do każdej studzienki dodaj cztery mikrolitry surowicy i dostosuj końcową objętość do 20 mikrolitrów za pomocą jednokrotnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem.Następnie dodaj 20 mikrolitrów znakowanego roztworu antygenu do każdej studzienki. I przykryj płytkę folią uszczelniającą, aby zapobiec światłu. Następnie przenieś płytkę na shaker w temperaturze pokojowej na dwie godziny.Gdy shaker się zatrzyma, pozostaw talerz w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce na 18 do 24 godzin. Teraz wymieszaj 15 mikrolitrów surowicy z 18 mikrolitrami 0,5 molowego kwasu octowego dla każdej próbki i inkubuj to samo w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Na podstawie testu szachownicy należy użyć racjonalnego stężenia antygenu znakowanego biotyną SULFO-TAG do przygotowania roztworu antygenu.Następnie podwielokrotność 35 mikrolitrów buforu antygenowego do każdej studzienki nowej płytki PCR. Tuż przed zakończeniem inkubacji mieszaniny surowicy dodać 3,8 mikrolitra jednego molowego buforu Tris o pH dziewięć, wzdłuż każdej studzienki na płytce antygenowej. Po zakończeniu inkubacji szybko przenieś 25 mikrolitrów surowicy poddanej działaniu kwasu octowego do każdej studzienki płytki antygenowej i wymieszaj roztwór.Następnie przykryj płytkę PCR folią uszczelniającą, aby uniknąć światła i umieść na shakerze w temperaturze pokojowej na dwie godziny. Po zakończeniu przenieś płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do lodówki i inkubuj przez 18 do 24 godzin. Wyjmij płytkę streptawidyny z lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i pozwól jej osiągnąć temperaturę pokojową.Po osiągnięciu przez płytkę streptawidyny temperatury pokojowej dodać 150 mikrolitrów 3% blokera A do każdej studzienki i przykryć płytkę PCR folią uszczelniającą i inkubować w lodówce przez noc. Następnego dnia wyjmij płytkę streptawidyny z lodówki i wyrzuć bufor z studzienek. Następnie osusz talerz, kładąc go do góry nogami na ręcznikach papierowych, aby pozostały bufor nasiąkł.Następnie dodaj 150 mikrolitrów jednorazowego buforu PBST, aby umyć studzienkę przez trzy kolejne płukania. Następnie przenieś 30 mikrolitrów inkubacji antygenu surowicy do każdej studzienki płytki streptawidyny i przykryj płytkę folią, aby uniknąć światła. Następnie przenieś płytkę na shaker w temperaturze pokojowej na godzinę.Po godzinie wyrzucić inkubację antygenu surowicy z płytki i dodać 150 mikrolitrów jednokrotnego buforu PBST, aby przemyć studzienkę trzy razy. Po zakończeniu mycia dodaj 150 mikrolitrów buforu odczytowego do każdej studzienki, aby odczytać na czytniku płytkowym. Przed analizą jakichkolwiek nieznanych próbek, punkt odcięcia testu dla każdego testu autoprzeciwciał został ustalony poprzez przetestowanie około 100 pacjentów z cukrzycą typu pierwszego i około 100 zdrowych osób z grupy kontrolnej.Następnie wykreślono krzywą ROC w celu wyznaczenia optymalnego wskaźnika górnej granicy normy dla testu, który wynosił 0,023, tak aby uzyskać najlepszą czułość i swoistość. Następnie wynik nieznanej próbki obliczono za pomocą równania wyprowadzonego z wysokich dodatnich, niskich dodatnich i ujemnych wzorców kontroli. Następnie wykreślono wykres w celu określenia sygnałów uzyskanych w teście autoatibody wysp trzustkowych podczas inkubacji przeciwciała monoklonalnego insuliny z normalną surowicą ludzką w obecności i bez leczenia kwasem.Wykres pokazuje, że sygnał jest wyraźnie zablokowany po dodaniu normalnej surowicy przy braku leczenia kwasem. Wręcz przeciwnie, uzyskany sygnał jest porównywalnie wyższy, gdy surowica jest poddawana działaniu kwasu przed inkubacją z przeciwciałem monoklonalnym insuliny. Podobny wykres został również wykreślony w celu określenia sygnałów uzyskanych przy użyciu surowic pacjenta zagranicznego w obecności i bez leczenia kwasem.Traktowanie surowicy pacjenta kwasem przed inkubacją z przeciwciałem znacznie zwiększa sygnały w teście autoprzeciwciał wysp trzustkowych w porównaniu z brakiem leczenia. Po opanowaniu tej techniki można ją łatwo wykonać dla kilkuset próbek w ciągu jednego dnia, jeśli jest odpowiednio uformowana. Próbując tej procedury, należy pamiętać o wykonaniu testu szachownicy dla każdego testu autoprzeciwciał, aby zoptymalizować stan testu.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się autoimmunologiczną cukrzycą typu 1 do przewidywania i zapobiegania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo wykonać ten test. Nie zapominaj, że praca z próbkami surowicy może być niebezpieczna i zaraźliwa.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu ze skórą.

electrochemiluminescence-assays-for-human-islet-autoantibodies

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano prosty protokół przygotowania ekstraktów z ludzkich tkanek, które służą jako źródło antygenów w funkcjonalnych testach limfocytów T. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi limfocytów T na antygeny pochodzące z tkanek in vitro.

Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Ten film prezentuje wykrywanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych w ludzkiej surowicy. Przeciwciała w surowicy łączą antygen sprzężony rutenem z biotynylowanym antygenem wychwytującym, tworząc kompleksy, które są wykrywane za pomocą pomiarów elektrochemiluminescencyjnych.

Wykrywanie ludzkich autoprzeciwciał wysp trzustkowych za pomocą testu elektrochemiluminescencyjnego

Ten film demonstruje protokół testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkera białkowego związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) z płytek krwi ludzkiej. Potwierdzenie obecności białka biomarkerowego ALS uzyskuje się poprzez rozdzielenie białek płytek krwi na podstawie wielkości, a następnie detekcję chemiluminescencyjną.

Test immunologiczny elektroforezy kapilarnej do wykrywania biomarkerów białkowych

Automatyczne przeciwciała DFS70 naśladują powszechne wzorce przeciwciał przeciwjądrowych związanych z chorobami, co utrudnia dokładną interpretację przy użyciu konwencjonalnych substratów HEp-2. Protokół opisuje zalety nowatorskiego zmodyfikowanego substratu HEp-2 w porównaniu z konwencjonalnym HEp-2 w badaniach przesiewowych ANA i rozróżnianiu wzorców DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach dodatnich ANA.

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Tutaj prezentujemy jednorodny FRET (HTRF) jako skuteczną metodę szybkiego wykrywania insuliny wydzielanej przez komórki.

Jednorodny, rozdzielczy w czasie test rezonansowy oparty na transferze energii Förstera do wykrywania wydzielania insuliny

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić szybkie, tanie testy lucyferazy przy średniej przepustowości przy użyciu lucyferazy Gaussia połączonej z insuliną jako wskaźnika wydzielania insuliny z komórek beta. Test można wykonać za pomocą większości czytników płytek luminescencyjnych i pipet wielokanałowych.

Pomiar względnego wydzielania insuliny za pomocą współwydzielanego surogatu lucyferazy

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

Zgodnie z pilną potrzebą badań przesiewowych w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i choroby koronawirusowej 2019, opracowaliśmy wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 6-Plex do jednoczesnego wykrywania wszystkich czterech autoprzeciwciał wysp trzustkowych, autoprzeciwciał transglutaminazy tkankowej oraz przeciwciał przeciwko domenie wiążącej receptor koronawirusa 2 zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej.

Wysokoprzepustowe, multipleksowane badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1, celiakii i COVID-19

Poznaj testy elektrochemiluminescencyjne do wykrywania autoprzeciwciał wysp trzustkowych w cukrzycy typu 1. Ta metoda oferuje wysoką czułość i swoistość, umożliwiając wczesną predykcję choroby.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Przeglądaj więcej filmów