Jednoczesne monitorowanie wideo-EEG-EKG w celu identyfikacji dysfunkcji neurosercowej w mysich modelach padaczki

Tutaj prezentujemy protokół do rejestrowania sygnałów biologicznych mózgu i serca u myszy za pomocą jednoczesnego wideo, elektroencefalografii (EEG) i elektrokardiografii (EKG). Opisano również metody analizy wynikowych zapisów EEG-EKG pod kątem napadów, mocy spektralnej EEG, funkcji serca i zmienności rytmu serca.

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar biosygnałów mózgu i serca u myszy za pomocą jednoczesnych zapisów wideo, elektroencefalografii i elektrokardiografii. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie padaczki, takie jak to, czy mutacja genu u myszy powoduje spontaniczne napady i czy napady wywołują zaburzenia rytmu serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że konfiguracja nagrywania na uwięzi pozwala na więcej kanałów rejestracji biopotencjału niż systemy bezprzewodowe i wykorzystuje elektrody, które są stosunkowo niedrogie i jednorazowe.

Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w dysfunkcję serca w padaczce, może być również zastosowana w badaniu neurokardiologii w celu zidentyfikowania powiązań między arytmią a nieprawidłową aktywnością mózgu. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść 10-gniazdowe żeńskie złącze nano w imadle stołowym, tak aby 10 przewodów było skierowanych do góry, a przewód z przodu. Za pomocą cienkich kleszczy złóż drut po prawej stronie, a brązowy drut po lewej.

Następnie złóż przewody czerwony, pomarańczowy, niebieski i fioletowy na przemian w prawo i w lewo. Następnie odetnij żółte, zielone, białe i szare przewody u podstawy ich mocowania. Aby przygotować przewody EKG, użyj markera permanentnego, aby zaznaczyć znaki na fioletowym przewodzie w odległości 3,2 centymetra i 3,5 centymetra od podstawy elektrody oraz na niebieskim przewodzie w odległości 2,2 centymetra i 2,5 centymetra.

Wyjmij elektrodę z imadła i odsłoń srebrne włókna między zaznaczonymi obszarami, zdejmując izolację z boku drutu za pomocą ostrza skalpela. Następnie umieść elektrodę z powrotem w imadle. Przymocuj kawałek dwustronnej taśmy montażowej, która została wstępnie przycięta do długości i szerokości elektrody, do górnej części drutów za pomocą cienkiej warstwy kleju superglue.

Następnie przytnij przewody, które mają być użyte do EEG, pod lekkim kątem w kształcie litery V na długość około siedmiu do dziewięciu milimetrów, przy czym jasnobrązowe i czarne druty powinny być przycięte do najkrótszego. Należy pamiętać, aby nie przecinać przewodów, które mają być używane do EKG. W tej procedurze należy ogolić dwa małe obszary o powierzchni około dwóch centymetrów kwadratowych po obu stronach tułowia myszy, odpowiadające miejscu, w którym zostaną wszczepione przewody EKG.

Następnie należy umieścić mysz w pozycji leżącej na stoliku mikroskopu preparacyjnego i potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palca u nogi. Trzymając głowę stabilnie między kciukiem a palcem wskazującym, rozchyl sierść na środku głowy od spomiędzy uszu do tuż za oczami za pomocą wacika nasączonego alkoholem. Za pomocą skalpela wykonaj jednocentymetrowe nacięcie w linii środkowej skóry głowy między rozchylonym futrem, od tuż przed uszami do tuż między oczami.

Używając boku skalpela lub aplikatora z bawełnianą końcówką, delikatnie zeskrob błonę śluzową na wierzchu czaszki, aż kość będzie wydawała się sucha. Następnie wyrwij futro na obwodzie nacięcia, tworząc cienką obwódkę łysej skóry. Ostrożnie usuń futro, które mogło wpaść na pole operacyjne za pomocą kleszczy.

Osusz powierzchnię czaszki aplikatorem z bawełnianą końcówką, delikatnie dociskując przez kilka sekund, jeśli to konieczne. Następnie wykonaj cztery znaki na czaszce za pomocą trwałego markera w miejscach, w których zostaną wywiercone otwory na żarna. Umieść dwa znaki, po jednym z każdej strony szwu strzałkowego, przed bregmą dla przewodów odniesienia i uziemienia.

Następnie umieść kolejne dwa znaki, po jednym z każdej strony szwu strzałkowego za bregmą dla dwóch drutów rejestrujących EEG. Za pomocą mikrowiertła wykonaj małe otwory w zadziorach na każdym znaku za pomocą wiertła o średnicy 0,8 milimetra. Zastosuj delikatny nacisk podczas wiercenia, aby utworzyć małe wgłębienia w każdym zaznaczonym miejscu.

Przewiercić czaszkę, pulsując wiertłem, gdy otwór zbliża się do ukończenia, uważając, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku, co może prowadzić do penetracji i uszkodzenia leżącej poniżej tkanki mózgowej. Po wywierceniu wszystkich otworów wytrzyj obszar do czysta aplikatorem z bawełnianą końcówką. Aby przykleić elektrodę do górnej części czaszki, usuń papierowy podkład z dwustronnej taśmy montażowej na elektrodzie.

Nałóż cienką warstwę superglue na taśmę. Za pomocą kleszczy wyjmij elektrodę z imadła. Ustaw elektrodę tak, aby po umieszczeniu wzdłuż szwu strzałkowego krótsze druty EEG były rostralne, a dłuższe druty EKG były ogonowe.

Przyklej elektrodę do czaszki nad szwem strzałkowym między otworami. Aby wszczepić przewody do EKG, obróć mysz lekko na prawą stronę, trzymając głowę w pozycji pionowej. Weź długi przewód EKG po lewej stronie i rozciągnij go z boku myszy do ogolonego obszaru po lewej stronie.

Wizualizuj, gdzie zostanie umieszczony odsłonięty drut po jego tunelowaniu pod skórą. Następnie za pomocą skalpela wykonaj centymetrowe nacięcie w skórze w miejscu, w którym zostanie umieszczony odsłonięty drut. Trzymając nacięcie otwarte, użyj kleszczy, aby poluzować skórę wokół nacięcia od leżącej poniżej tkanki łącznej, aby utworzyć kieszeń na drut.

Zaczynając od miejsca nacięcia z boku tunelu dla zwierząt, podskórnie za pomocą kawałka sześciocentymetrowej rurki polietylenowej ze ściętą krawędzią natarcia, aż ścięta krawędź wyjdzie z nacięcia wykonanego na głowie. Przeprowadź przewód EKG przez rurkę. Podczas wyjmowania rurki chwyć drut elektrody, gdy wychodzi z bocznego nacięcia i pociągnij drut.

Następnie zamocuj drut EKG na miejscu, przyszywając go do tkanki pod skórą. Nałóż jeden szew na odsłonięte włókna, a drugi szew przed lub po odsłoniętej części. Przetnij drut elektrody około dwóch do trzech milimetrów za ostatnim szwem i wsuń koniec do utworzonej wcześniej kieszeni skóry.

Następnie ściągnij obie strony nacięcia razem i zamknij klipsem do rany. Powtórz powyższe kroki, aby umieścić kontralateralny drut EKG. Aby wszczepić druty do EEG, zaczynając od najbardziej przedniego otworu po jednej stronie, zegnij drut, który jest najbliżej tego otworu, tak aby był umieszczony bezpośrednio nad otworem, ale jeszcze nie włożony.

Chwyć dolny koniec drutu i wsuń go jak najbardziej poziomo do otworu, aż dwa do trzech milimetrów drutu znajdzie się pod czaszką. Trzymając koniec drutu zabezpieczony w otworze, delikatnie złóż pozostałą część drutu tak, aby leżała płasko na czaszce. Kontynuuj w ten sam sposób, z tylnym drutem po tej samej stronie.

Powtórz procedury dla przewodów przednich i tylnych po drugiej stronie. W tej procedurze wymieszaj dwie miarki proszku polikarboksylowego z pięcioma kroplami płynu polikarboksylowego. Wymieszaj mieszaninę wykałaczką, aby uzyskać pastę o pożądanej lepkości.

Następnie podnieś wykałaczką dużą kroplę cementu i nałóż wokół podstawy elektrody, zaczynając doogonowo. Kontynuuj wokół elektrody, pozwalając, aby cement kapał po drutach, tworząc nasadkę wokół implantu. Za pomocą kleszczy Dumonta pociągnij futro na krawędziach nacięcia do góry nad cementową nasadką i dociśnij do siebie, uważając, aby nie naruszyć drutów wszczepionych pod spodem.

Następnie wciśnij futro w cement, aby ułatwić zamknięcie. Po okresie rekonwalescencji przywiąż mysz, delikatnie, ale stanowczo trzymając mysz w jednej ręce, podczas gdy drugą ręką wkładaj 10-pinowe metalowe złącze z drążkiem prowadzącym do gniazd implantu elektrody EEG, EKG na głowie myszy. Następnie przenieś mysz do komory nagraniowej z przezroczystymi ściankami, aby ułatwić monitoring wizyjny.

Nagrywaj jednocześnie obraz i EEG, EKG i zapisuj zdigitalizowane dane do analiz offline za pomocą oprogramowania do przetwarzania sygnałów. Pokazany tutaj jest ślad EEG reprezentujący spontaniczny napad u myszy z nokautem KCNA1. Jest to wykres czasu trwania każdego napadu obserwowanego podczas 24-godzinnej sesji nagraniowej na myszy.

Spektrogram ten pokazuje częstotliwość i gęstość mocy przed, w trakcie i po napadzie. Porównanie mocy względnej w każdym paśmie częstotliwości EEG w okresie przed i po ictal ujawnia wzrost względnej mocy delta i spadek mocy theta, alfa, beta i gamma. A to jest reprezentatywny wykres serii interwałowej R-R uzyskany z zapisu EKG myszy nokautującej KCNA1, pokazujący wahania czasu między uderzeniami.

Czerwona linia pokazuje składowe trendu niskiej częstotliwości, które dają usunięte z serii interwałów R-R po detrendingu. Oto przykładowy zapis EKG od myszy z nokautem KCNA1 wykazujący normalny rytm zatokowy poprzedzający blok przewodnictwa przedsionkowo-komorowego, który objawia się jako załamek P, po którym nie następuje zespół QRS. Po opanowaniu tej operacji można ją wykonać w ciągu 50 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wszczepić elektrody do rejestrowania elektroencefalografii i elektrokardiografii u myszy, które można zastosować w modelach padaczki w celu identyfikacji dysfunkcji neurosercowej.