Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transplantacji i konserwacji narządów. Zastosowania tej metody obejmują testowanie nowych perfudatów i dodatków perfuzyjnych, testowanie oprogramowania przeznaczonego do oceny narządów oraz przeprowadzanie eksperymentów mających na celu naprawę narządów. Główną zaletą tej techniki jest to, że przedstawiony tutaj normotermiczny model perfuzji wątroby ex vivo jest prosty, łatwy do powtórzenia, tani i ma szeroki zakres zastosowań.

Zacznij od przygotowania mankietu portalowego o rozmiarze 16. Wytnij pięciomilimetrowy odcinek rurki i określ punkt środkowy przekroju, mierząc 2,5 milimetra. Naciąć w punkcie środkowym i usunąć przednią połowę rurki.

Użyj hemostatu, aby zmiażdżyć tę płaską teraz porcję. Użyj zapalniczki, aby stopić drugi koniec cewnika naczyniowego, aby utworzyć wargę. Następnie przygotuj kaniulę przewodu żółciowego, przecinając port iniekcyjny z angiocewnika o rozmiarze 27, pozostawiając tylko cewnik.

Podłącz go do 10-centymetrowego odcinka rurki kaniuli o rozmiarze 27. Umieść znieczulonego szczura z nosem w stożku nosowym do znieczulenia i unieruchomionymi czterema kończynami. Monitoruj parametry życiowe, mocując monitor do lewej tylnej kończyny.

Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia. Spryskaj brzuch zwierzęcia 70% alkoholem izopropylowym i pozostaw do wyschnięcia. Umieść sterylną serwetę na zwierzęciu.

Następnie, po wykonaniu nacięcia w linii środkowej od mieczykowatej do łonowej za pomocą ostrych nożyczek, delikatnie wejdź do otrzewnej i nacinaj mięsień. Przedłuż nacięcie bocznie w lewo i w prawo, aby utworzyć krzyż na poziomie dolnej granicy wątroby. W tym momencie zmniejsz znieczulenie izofluranem do 2%Cofnij wyrostek mieczykowaty za pomocą zakrzywionego zacisku na komary, a żebra za pomocą zwijaczy żeber.

Następnie ostrymi nożyczkami przeciąć więzadła pospolite, przeponowe i żołądkowo-wątrobowe. Zlokalizuj i zawiąż żyłę przeponową szwem 7-0 jak najbliżej jej początku, aby zapobiec przeciekaniu. Następnie użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wypatroszyć szczura.

Owiń jelita gazą zwilżoną 0,9% solą fizjologiczną, uważając, aby nie rozciągać układu krwionośnego. Następnie wypreparuj żyłę główną dolną, aby usunąć nadmiar tkanki. Rozciąć za IVC tuż nad rozwidleniem i przepuścić pętlę jedwabnego szwu 4-O do późniejszego użycia.

Następnie cofnij prawą nerkę, aby zapewnić ekspozycję na prawą żyłę nadnerczy i cofnij prawy płat wątroby lepiej gazą. Zawiąż prawą żyłę nadnerczy jedwabnym szwem 7-0 jak najbliżej IVC i kauteryzuj w poprzek niej dystalnie do krawata. Następnie ostrożnie wypreparuj żyłę śledzionową.

Zawiąż je za pomocą dwóch jedwabnych szwów 7-0 i przetnij je między dwoma szwami. Po rozcięciu okolic tętnicy żołądkowo-dwunastniczej zwiąż tętnicę żołądkowo-dwunastniczą jedwabnym szwem 7-0 i podwiązuj. Następnie wypreparuj okolice tętnicy wątrobowej i luźno umieść wokół niej jedwabny szew 7-0.

Następnie wypreparuj przewód żółciowy. Następnie sprawdź długość przewodu żółciowego, zwiąż go na dystalnym końcu i umieść pętlę szwu wokół przewodu żółciowego i proksymalnie, jeśli to możliwe. Użyj małych nożyczek, aby wyciąć otwór o średnicy połowy średnicy przewodu i umieść cewnik o rozmiarze 27 w przewodzie żółciowym proksymalnie.

Zawiąż cewnik na miejscu za pomocą szwu do krawata z sandałów rzymskich. Następnie użyj igły o rozmiarze 27, aby wstrzyknąć 0,5 mililitra heparyny do żyły prątkowej lub IVC. Następnie zacisnąć i związać IVC za pomocą wcześniej założonego szwu jedwabnego 4-0 i związać tętnicę wątrobową za pomocą wcześniej założonego szwu jedwabnego 7-0.

Teraz użyj klipsa mikrochirurgicznego, aby zacisnąć żyłę wrotną. Kankaniulować żyłę wrotną za pomocą angiocewnika o rozmiarze 22 i przepłukać 60 mililitrami zimnej 0,9% normalnej soli fizjologicznej zawierającej 100 jednostek heparyny, aż wątroba zblednie. Po przepłukaniu wątroby należy odsłonić IVC nadwątrobowy i przeciąć go jak najwyżej w klatce piersiowej.

Wykonaj hepatektomię, przecinając okolice przepony, a następnie przecinając tętnicę wątrobową, IVC, żyłę wrotną i wszelkie dodatkowe więzadła. Wyjmij wątrobę i umieść lodowatą sól fizjologiczną 0,9%. Na koniec umieść mankiet naczyniowy o rozmiarze 16 w żyle wrotnej i podłącz wątrobę do normotermicznego obwodu perfuzji wątroby ex vivo.

Przed rozpoczęciem każdej perfuzji należy przeprowadzić oględziny obwodu w celu zidentyfikowania i uszkodzenia lub nagromadzenia się na elementach obwodu lub rurkach. Jeśli w obwodzie nagromadziły się bakterie lub inne substancje, części należy wymienić lub wyczyścić. Zacznij od przepływu perfuzatu z prędkością dwóch mililitrów na minutę.

Obserwuj monitor pod kątem skoków ciśnienia w żyle wrotnej, ponieważ może to oznaczać, że naczynie zostało niedrożne i wymaga zmiany położenia kaniuli. Włóż kaniulę żyły protalnej do żyły wrotnej z mankietem w celu powrotu perfuzatu i zszyj za pomocą jedwabnego szwu 7-0. Gdy obie kaniule znajdą się na miejscu, zacznij zwiększać przepływ perfuzatu o jeden mililitr na minutę, aż do osiągnięcia ciśnienia fizjologicznego w zakresie od 10 do 16 centymetrów wody.

Usuń jeden mililitr próbki z portu wstępnego i końcowego podczas perfuzji. Podziel każdą próbkę o pojemności jednego mililitra na dwie próbki o pojemności 0,5 mililitra. Zatrzaskowo zamroź jedną z 0,5 mililitrowych podwielokrotności w probówkach kriogenicznych w ciekłym azocie i przeprowadź analizę gazometrii krwi tętniczej przy użyciu pozostałych 0,5 mililitra perfuzatu.

Następnie zmierz pH i zbuforuj perfuzat w razie potrzeby, aby powrócić do pH 7,4. Po czterech godzinach perfuzji odłącz wątrobę od obwodu perfuzji. Podziel wątrobę na segmenty o wadze 0,5 grama, przenieś do probówek kriogenicznych i zamroź w ciekłym azocie.

AlAT mierzono przy zero, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 i 240 minutach perfuzji. W perfuzacie zasadowym i grupie PEG-CAT występuje znacznie mniej ALT w porównaniu z perfuzatem podstawowym, który jest pokazany na czarno po 150, 180, 210 i 240 minutach. ATP tkankowe utrzymywało się w grupie perfuzatu zasadowego plus PEG-CAT w porównaniu z grupą leczonej samą perfuzatem zasadową.

Wytwarzanie MDA w tkankach było istotnie wyższe w grupie perfuzatu zasadowego niż w grupie perfuzatu zasadowego plus PEG-CAT. Całkowity GSH utrzymywał się w perfuzacie podstawowym plus PEG-CAT w porównaniu z grupą z samym perfuzatem podstawowym. Każde proponowane zastosowanie normotermicznej perfuzji wątroby ex vivo będzie musiało być metodycznie testowane na modelach zwierzęcych przed badaniem na odrzuconych narządach ludzkich, a następnie na wątrobach ludzkich.

Prezentowany tutaj model jest idealny, ponieważ jest łatwy do powielenia, eliminuje zbędne testy i jest tani. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać niedrogi, łatwy do odtworzenia, normotermiczny model perfuzji wątroby ex vivo przy użyciu szczurów.