Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera

Chociaż wiele owadów z podrzędu Heteroptera (Insecta: Hemiptera) jest jadowitych, ich skład jadu i funkcje toksyn jadowych są w większości nieznane. Protokół ten opisuje metody zbierania jadów heteropterów w celu dalszej charakterystyki, przy użyciu elektrostymulacji, nękania i sekcji gruczołów.

Robaki zabójcy to grupa owadów, które używają jadu do paraliżowania i wstępnego trawienia zdobyczy. Jednak pomimo tego, że jady zwierzęce są przedmiotem zainteresowania jako nowe leki, środki owadobójcze i narzędzia naukowe, toksyny, które produkują, są prawie całkowicie niescharakteryzowane. Jednym z powodów jest to, że robaki zabójcy są mniej znane w porównaniu z kultowymi jadowitymi stawonogami, takimi jak pająki i skorpiony.

Innym powodem jest to, że do niedawna niewiele było dostępnych informacji na temat tego, jak zbierać ich toksyny. W tym filmie przedstawimy metody, które umożliwią naukowcom skuteczne zbieranie toksyn jadowych z owadów zabójców, a także owadów pokrewnych, takich jak gigantyczne pluskwiaki wodne zabijające ryby. Protokół pierwszy opisuje, jak zbierać jad za pomocą elektrostymulacji.

Najpierw zbierz odpowiednie owady. Dorosłe osobniki i duże nimfy są najłatwiejsze w pracy. Używanie owadów od dwóch do siedmiu dni po karmieniu jest idealne, aby upewnić się, że owady zgromadziły zapasy jadu, ale nie głodują.

Przygotuj parę kleszczy z elektrodami na końcach i podłącz je do źródła prądu. Idealnie byłoby, gdyby to zasilanie było elektrostymulatorem zdolnym do dostarczania pięciu milisekundowych impulsów z częstotliwością pięciu herców. Używaj napięć szczytowych od 15 do 25 woltów odpowiednio dla małych lub dużych błędów.

Jeśli elektrostymulator nie jest dostępny, użyj stałego napięcia od pięciu do 12 woltów. Powstrzymaj owada za pomocą gumek recepturek i piankowej platformy. Umieść trąbkę owada w rurce zbiorczej.

Rurka do pipet P200 jest idealna dla większości owadów zabójców. Opcjonalnie przed zbiorem można dodać niewielką ilość wody do końcówki, aby zapewnić maksymalny odzysk jadu. Nałóż żel przewodzący na elektrody, włącz zasilanie i przyłóż pęsetę pod napięciem do owada.

Eksperymentuj z różnymi punktami kontaktu, monitorując wydalanie jadu z trąbki. Przechowuj jad w ujemnych temperaturach, aby uniknąć trawienia autoproteolitycznego. Powtórz elektrostymulację nową rurką do pipety, aż nie pojawi się już jad

Protokół drugi opisuje, jak zbierać jad poprzez prowokowanie reakcji obronnej. Przygotuj i utrzymaj robaka zgodnie z powyższym opisem, wkładając trąbkę do końcówki zbierającej. Delikatnie nękaj robaka, aby sprowokować reakcję obronną, nie raniąc zwierzęcia.

Czasami samo skrępowanie zwierzęcia lub włożenie trąbki do probówki zbiorczej może wywołać reakcję obronną, której towarzyszy wydalenie jadu z trąbki. Jeśli nie, delikatnie dotknij zwierzęcia po klatce piersiowej, nogach, brzuchu, a zwłaszcza czułkach, aby wywołać jad. W protokole trzecim, w pisemnej formie tego artykułu, opisujemy również, jak zbierać jad z gatunków, które plują jadem w sposób defensywny.

Protokół czwarty opisuje, w jaki sposób zbierać jad bezpośrednio z gruczołów jadowych poprzez preparację. Znieczulaj zwierzęta poprzez wystawienie na działanie dwutlenku węgla przez 10 minut. Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.

Wytnij krótkie nacięcie w linii środkowej na brzusznej powierzchni brzucha za pomocą miniaturowego skalpela. Użyj miniaturowych nożyczek, aby przedłużyć linię środkową w kierunku przednim do głowy, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych. Aby odsłonić struktury wewnętrzne, wykonaj wiele bocznych nacięć rozciągających się od nacięcia w linii środkowej do boku owada.

Brzuszny egzoszkielet między każdymi dwoma cięciami można następnie przypiąć z powrotem, aby odsłonić wewnętrzne struktury. Zalej tacę sekcyjną roztworem soli fizjologicznej, aż owad zostanie zanurzony, co pozwoli wewnętrznym strukturom unosić się w górę i łatwiej je uwidocznić. Gruczoły jadowe pojawią się jako półprzezroczyste, wydłużone struktury rozciągające się po obu stronach przewodu pokarmowego.

Za pomocą pęsety i mikronożyczek ostrożnie usuń tkankę łączną i nerwową oraz tchawicę, starając się nie pęknąć przewodu pokarmowego ani gruczołów jadowych. Gruczoł główny jest rozpoznawalny dzięki swojej charakterystycznej budowie, z płatami przednimi i tylnymi oraz dwoma przewodami spotykającymi się na wnęce. W przypadku robaków zabójców i być może innych heteropterów prawie wszystkie toksyny są przechowywane w światłach dwóch płatów głównego gruczołu.

Dlatego po uwolnieniu gruczołu głównego z tchawicy i tkanki łącznej można przeciąć dwa przewody prowadzące od wnęki i pobrać główny gruczoł jadowy. Jeśli pożądany jest również gruczoł dodatkowy, zwykle znajduje się on po przeciwnej stronie jelita i można go jednoznacznie zidentyfikować, śledząc przewody od wnęki. W każdym razie należy uważać, aby nie złamać przedwcześnie gruczołów i nie stracić jadu do otaczającej soli fizjologicznej.

Jeżeli płaty gruczołu głównego mają zostać oddzielone, należy to zrobić szybko po wyjęciu z soli fizjologicznej i niezwłocznie przystąpić do pobierania zawartości światła gruczołu, jak opisano w krokach 4.6 i 4.7 pisemnego rękopisu. Wyniki będą się różnić w zależności od dokładnego podprotokołu i gatunku użytego owada. Pierwszy i drugi podprotokół przedstawione w tym filmie pokazały, jak zbierać toksyny jadowe odpowiednio za pomocą elektrostymulacji i nękania.

Obie te metody zazwyczaj dają skoncentrowany płyn zawierający około 50 do 250 miligramów białka i ponad 100 składników białkowych, w tym enzymy, toksyny tworzące pory i peptydy. Główną zaletą obu tych protokołów jest to, że są szybkie, nieśmiertelne, a jad nie jest zanieczyszczony przez tkankę gruczołową. Największą wadą zbioru za pomocą elektrostymulacji lub nękania jest to, że gruczołowe źródło uzyskanego jadu jest nieznane, a zawartość białka w zebranym jadzie może się różnić w zależności od protokołu.

Ponadto elektrostymulacja i nękanie nie są skuteczne w przypadku wszystkich drapieżnych gatunków heteroptera. W ostatnim podprotokole pokazaliśmy, jak rozciąć nabrzmiałe gruczoły jadowe, aby bezpośrednio zebrać toksyny. Technika ta daje również koktajl różnych białek, chociaż w tym przypadku toksyny jadowe mogą wykazywać pewne zanieczyszczenie tkanką gruczołową.

Jednak zaletą zbierania toksyn z wypreparowanych gruczołów jest to, że przedział gruczołowy, z którego pochodzi, jest dokładnie znany. Podsumowując, zachęcamy badaczy do wyboru metody zbioru odpowiedniej do ich pytania badawczego. Na przykład badania nad biologią stosowania jadu przez dany gatunek skorzystają na zastosowaniu wielu technik zbierania.

W przypadku badań bioprospekcyjnych pojedyncza metoda zbierania jadów z wielu gatunków może być bardziej ekonomiczna, w zależności od konkretnego projektu eksperymentalnego. Mamy nadzieję, że ten film i towarzyszący mu artykuł pisemny ułatwią naukowcom zbieranie jadu z owadów zabójców i innych owadów heteropterańskich, co jest warunkiem wstępnym do zrozumienia jego składu, bioaktywności i ewolucji.