Name: Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metody pozyskiwania jadu z robaków zabójców i innych owadów heteroptera przy użyciu elektrostymulacji oraz drażnienia. Protokoły te umożliwiają badaczom charakterystykę toksyn i ich potencjalne zastosowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (Granty DP130103813 i LP140100832 dla G.F.K., stypendium DECRA DE160101142 dla EABU), Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Główne Stypendium Badawcze APP1044414 dla G.F.K.) oraz University of Queensland (Stypendium podoktorskie dla A.A.W.).

Ten protokół jest zgodny z polityką Uniwersytetu Queensland określoną w Responsible Care and Use of Animals in Teaching and Research (PPL 4.20.11), a także australijskim kodeksem National Health and Medical Research Council dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych (8th Edition 2013).
Uwaga: Uważaj, aby nie dać się zatruć podczas obsługi robaków zabójców. Zadbaj o ochronę oczu podczas pracy z gatunkami plującymi jadem w sposób defensywny. Przez cały czas należy uważać, aby nie zranić zwierząt doświadczalnych. Obejmuje to monitorowanie nacisku na urządzenia ograniczające, takie jak gumki recepturki, oraz upewnienie się, że trąba nie jest uszkodzona.
UWAGA: Opcjonalnie, znieczulaj zwierzęta poprzez wystawienie na działanie CO2 przez 0,5-2 min lub schłodzenie do 4-10 °C przed zbiorem jadu w celach 1-3, aby ułatwić bezpieczne przenoszenie i krępowanie. Znieczulenie nie jest bezwzględnie wymagane, ale może ułatwić bezpieczne unieruchomienie zwinnych lub silnych próbek. Jednak zwierzęta muszą być przytomne, aby umożliwić zbieranie jadu. Należy pamiętać o dalszych zastosowaniach przy podejmowaniu decyzji o dodaniu inhibitorów proteazy.
1. Zbieranie toksyn jadowych za pomocą elektrostymulacji
<ol>
	<li>Zdobądź żywe okazy, z których możesz zebrać toksyny.</li>
	<li>Użyj wstępnie przygotowanej plastikowej pęsety z elektrodami dodatnimi i ujemnymi zamontowanymi na obu końcówkach. Podłącz pęsetę pod napięciem do elektrostymulatora lub źródła stałego napięcia, które umożliwia regulację napięcia.
	<ol>
		<li>W przypadku małych (~10 mm) i dużych (~25 mm) owadów zabójców należy użyć napięć szczytowych odpowiednio 15 i 25 V.</li>
		<li>W przypadku większych heteropterów, takich jak gigantyczne pluskwiaki wodne, użyj do 40 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powstrzymaj żywe owady, przypinając je do platformy, używając gumki na klatce piersiowej.</li>
	<li>Umieść końcówkę trąbki w odpowiedniej końcówce zbierającej. W przypadku błędów zabójcy użyj końcówki do pipety P200. W przypadku gigantycznych pluskwiaków wodnych odetnij koniec końcówki P200, aby zwiększyć rozmiar otworu.
	<ol>
		<li>Delikatnie podnieś trąbkę za pomocą zamkniętej pary czystej pęsety i wepchnij otwarty otwór końcówki zbierającej na koniec trąbki.</li>
		<li>W razie potrzeby pobierz ~5 μl ultraczystej wody przed umieszczeniem trąbki w końcówce zbierającej. Zmniejsza to straty jadu pozostającego wewnątrz końcówki, chociaż zebrany jad zostanie rozcieńczony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj elektrostymulację. Zanurz elektrody stymulujące w żelu przewodzącym, takim jak 2,5 M NaCl/50% glicerol. Przyłóż elektrody do klatki piersiowej. W przypadku belostomatydów należy przyłożyć dwie elektrody do grzbietowej tylnej powierzchni głowy.</li>
	<li>Przechowuj jad, aby zapobiec autodegradacji. Po wyciśnięciu jadu należy go szybko przenieść do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Powtarzać kroki 1.5 i 1.6 do momentu, gdy pojawi się wystarczająca ilość jadu lub nie pojawi się dalszy jad.</li>
</ol>
2. Zbieranie toksyn jadu przez nękanie
<ol>
	<li>Przygotować zwierzęta do zbioru jadu i umieścić końcówkę trąbki w przedsionku do zbierania, jak opisano w podrozdziałach 1.1 i 1.3-1.4.</li>
	<li>Jeśli jad jest wytłaczany spontanicznie, przejdź do kroku 2.3. Jeśli nie, nękaj zwierzęta, delikatnie dotykając nimi pęsetą nóg, brzucha i czułków, aż do wytworzenia jadu.</li>
	<li>Szybko przenieś jad do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy, jeśli jest to pożądane.</li>
</ol>
3. Zbieranie toksyn jadu poprzez nękanie przez gatunki "plujące" jadem
<ol>
	<li>Znieczulić lub częściowo znieczulić owada przed wyjęciem go z pomieszczenia, aby zapobiec przedwczesnemu pluciu obronnemu.</li>
	<li>Sprowokuj plucie jadem. Zatrzymać owada i zmienić jego położenie za pomocą głębokiej pokrywy standardowej szalki Petriego o wymiarach 90 x 16 mm. Trzymaj pokrywę nieco z tyłu i 1-4 cm nad owadem, aby zapobiec ucieczce. Większość owadów pluje kilka razy, często w krótkich odstępach czasu. Upewnij się, że cały jad zebrał się na spodzie naczynia.</li>
	<li>Zebrać jad na spodniej stronie szalki Petriego, spłukując ją 10 μl ultraczystej wody. Szybko przenieś go do probówki o temperaturze -20 °C lub -60 °C lub probówki zawierającej koktajl inhibitorów proteazy.</li>
</ol>
4. Zbieranie toksyn jadowych poprzez rozwarstwienie gruczołów
<ol>
	<li>Składaj ofiary ze zwierząt. Silnie znieczulać lub zabijać zwierzęta, stosując >5 minutową ekspozycję na CO2 . Doprowadzać czysty CO2 bezpośrednio do otworów wentylacyjnych w pomieszczeniu dla zwierząt.</li>
	<li>Przypnij owada do tacki preparcyjnej. W przypadku robaków zabójców, przeprowadź sekcję przez powierzchnię brzuszną (4.3). W przypadku gigantycznych pluskwiaków wodnych należy przeprowadzić sekcję przez powierzchnię grzbietową (4.4).</li>
	<li>Rozwarstwienie brzuszne
	<ol>
		<li>Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.</li>
		<li>Wytnij krótkie nacięcie w linii środkowej na brzusznej powierzchni brzucha za pomocą miniaturowego skalpela. Użyj miniaturowych nożyczek, aby przedłużyć nacięcie linii środkowej do przodu do głowy, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych.</li>
		<li>Aby odsłonić struktury wewnętrzne, wykonaj wiele bocznych nacięć rozciągających się od nacięcia w linii środkowej do boku owada. Następnie przypnij z powrotem każdy płat brzusznego egzoszkieletu, aby odsłonić struktury wewnętrzne.</li>
		<li>W przypadku dużych robaków zabójców wykonaj cztery boczne nacięcia, w środkowej części brzucha, w przedniej części brzucha, między pierwszą a drugą nogą oraz przed pierwszą nogą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie grzbietowe
	<ol>
		<li>Usuń skrzydła w pobliżu podstawy. Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.</li>
		<li>Wytnij nacięcie w linii środkowej od głowy do brzucha za pomocą miniaturowych nożyczek i skalpela, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych.</li>
		<li>Rozsuń dwie połówki owada. Umieść kilka szpilek z boku wzdłuż owada, aby pozostawić odsłoniętą wewnętrzną jamę.</li>
		<li>Usuń mięśnie lotu za pomocą pęsety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zalej tacę sekcyjną. Dodawaj PBS, dopóki błąd nie zostanie zanurzony, aby umożliwić wewnętrzne struktury unoszenia się w górę i łatwiejszej wizualizacji.</li>
	<li>Za pomocą pęsety i mikronożyczek ostrożnie usuń tkankę łączną i nerwową oraz tchawicę. Gruczoły jadowe wyglądają jak wydłużone, półprzezroczyste struktury rozciągające się po obu stronach przewodu pokarmowego.
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj główny gruczoł po jego charakterystycznym wyglądzie, z przednimi i tylnymi płatami oraz dwoma przewodami spotykającymi się na wnęce.</li>
		<li>W razie potrzeby zidentyfikuj dławik dodatkowy, śledząc kanał od wnęki. Uwolnij główny dławnicę, przecinając dwa kanały wychodzące z wnęki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz pożądane lumeny gruczołów. Przenieść gruczoł do mikrowirówki na lodzie zawierającej 30 μl PBS lub PBS plus koktajl inhibitorów proteazy. Nakłuć gruczoły czystym, ostrym szpilką.
	<ol>
		<li>Wirować przez 10 s i odwirować (1 min, 5 000 × g, 4 °C) w celu opróżnienia światła gruczołu. Usuń tkankę gruczołową za pomocą pęsety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sklaruj ekstrakt z toksyny. Odwirować (5 min, 17 000 × g, 4°C) w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych, zachowując supernatant i odrzucając osad. Przechowywać w temperaturze -20°C lub -60°C, aby zapobiec degradacji autoproteolitycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venoms+of+heteropteran+insects%3A+A+treasure+trove+of+diverse+pharmacological+toolkits%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits.</a> Toxins. 8 (2), 43(2016).</li>
<li>Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/psyche/2012/470436/">An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera.</a> Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).</li>
<li>Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/320234828_Quantification_protein_content_and_paralytic_potential_of_saliva_of_fed_and_prey_deprived_reduviid_Acanthaspis_pedestris_Stal_Heteroptera_Reduviidae_Reduviinae">Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae).</a> Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).</li>
<li>Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/38/1/61">The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae).</a> Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).</li>
<li>Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZerachia%2C+T+%22Animal+and+Plant+Toxins%22">Animal and Plant Toxins</a>. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).</li>
<li>Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li>
<li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cell. Mol. Life Sci. , (2018).</li>
<li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assassin+bug+Pristhesancus+plagipennis+produces+two+distinct+venoms+in+separate+gland+lumens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens.</a> Nature Communications. 9 (1), 755(2018).</li>
<li>Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+triabin+protein+family+of+American+hematophagous+reduviids%3A+Functional%2C+structural+and+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis.</a> Toxins. 8 (2), 44(2016).</li>
<li>Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+the+saliva+of+Triatoma+infestans+%28Heteroptera%3A+Reduviidae%29+on+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels.</a> Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).</li>
<li>Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+peptides+from+assassin+bugs+%28Hemiptera%3A+Reduviidae%29%3A+isolation%2C+chemical+and+biological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization.</a> FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).</li>
<li>Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+milking+and+electric+shocks+for+venom+collection+from+hunter+reduviids%5BTitle%5D)+AND+%22Entomon%22%5BJournal%5D)">Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids.</a> Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).</li>
<li>Silva-Cardoso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+activity+of+lysophosphatidylcholine+from+saliva+of+the+waterbug+Belostoma+anurum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum.</a> Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).</li>
<li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triabin%2C+a+highly+potent+exosite+inhibitor+of+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).</li>
<li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+collagen-induced+platelet+aggregation+from+the+saliva+of+Triatoma+pallidipennis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).</li>
<li>Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1678-91992006000300011">Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens.</a> Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).</li>
<li>Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201301326115">Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae).</a> Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).</li>
<li>Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaran%2C+SPM+%22Biotechnological+Applications+for+Integrated+Pest+Management%22">Biotechnological Applications for Integrated Pest Management</a>. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).</li>
<li>Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaran%2C+SPM+%22Insect+Pest+Management%2C+A+Current+Scenario%22">Insect Pest Management, A Current Scenario</a>. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).</li>
<li>Pereira, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulant+activity+of+Triatoma+infestans+and+Panstrongylus+megistus+saliva+%28Hemiptera%2FTriatominae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae).</a> Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+vasodilator+in+the+blood-sucking+bug%2C+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus.</a> British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+prolixin-S+%28nitrophorin+2%29%2C+the+salivary+anticoagulant+of+the+blood-sucking+bug+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Journal%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus.</a> Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).</li>
<li>Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+gland+and+salivary+enzymes+of+the+giant+waterbugs+%28Heteroptera%3B+Belostomatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae).</a> Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).</li>
<li>Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-7998.1995.tb02743.x/full">On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae).</a> Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).</li>
<li>Fink, L. S. <a target="_blank" href="https://bugguide.net/node/view/1371711">Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae).</a> Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).</li>
<li>Herzig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogenesis%2C+gender%2C+molting+influence+the+venom+yield+in+the+spider+Coremiocnemis+tropix+%28Araneae%2C+Theraphosidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Venomous+Research%22%5BJournal%5D)">Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae).</a> Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).</li>
<li>Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+electrophoretic+analyses+of+saliva+from+the+predatory+reduviid+species+Rhynocoris+marginatus+%28Fab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab).</a> Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem w zbieraniu jadu robaka zabójcy jest wybór odpowiedniej metody w zależności od celów badania. Każda z trzech przedstawionych metod zbierania jadów heteroptera ma zalety i wady w zależności od dalszych zastosowań.
Indukowanie owadów do wydalania jadu z trąbki (Protokoły 1-3) pozwala uniknąć zanieczyszczenia jadu przez tkanki gruczołowe. Ponadto metody te nie są śmiertelne i mogą być powtarzane wiele razy w ciągu życia owada. Elektrostymulacja zwykle dostarcza największe i...

Jady heteroptera są silnie bioaktywnymi substancjami1. Na przykład wydzieliny jadu/śliny żywiących się krwią Heteroptera, takich jak pluskwy całujące (Triatominae) i pluskwy (Cimicidae), ułatwiają żerowanie, zakłócając hemostazę2. Toksyny w tych jadach działają na wiele szlaków, w tym krzepnięcie, agregację płytek krwi i zwężenie naczyń krwionośnych, a także szlaki bólu i swędzenia. Jady większości innych gatunków heteroptera są przystosowane do ułatwiania drapieżnictwa, a nie do odżywiania się krwią. Ich jady powodują paraliż, śmierć i upłynnienie tkanek po wstrzyknięciu do bezkręgowców3,4. Po wstrzyknięciu do kręgowców ich jad może mieć również drastyczne skutki. Na przykład wstrzyknięcie kręgowcom jadu z robaka zabójcy Holotrichius innesi powoduje ból, paraliż mięśni i krwotok; Myszy zatrute tym robakiem szybko umierają z powodu paraliżu oddechowego5.
Badania transkryptomiczne i proteomiczne ujawniły skład białkowy niektórych jadów heteropterańskich. Jady drapieżnych gatunków są bogate w proteazy, inne enzymy oraz peptydy i białka o nieznanej budowie i funkcji6,7,8. Jad pluskwiaka całującego jest bogaty w rodzinę białek triabin, których członkowie głęboko wpływają na krzepnięcie, agregację płytek krwi i zwężenie naczyń krwionośnych2,9. Nie wiadomo jednak, jakie toksyny leżą u podstaw większości bioaktywności jadu. Na przykład doniesiono, że jad pluskwiaka Triatoma infestans ma działanie przeciwbólowe i hamuje kanały sodowe10, ale odpowiedzialne za to składniki pozostają do wyjaśnienia. Podobnie nie wiadomo, jakie składniki jadu robaka zabójcy powodują paraliż lub ból. Warunkiem wstępnym do zidentyfikowania toksyn odpowiedzialnych za poszczególne bioaktywności jadu oraz do scharakteryzowania struktury i funkcji nowych toksyn jadowych jest uzyskanie jadu.
Venom został uzyskany z heteropteran metodą elektrostymulacji5,6,7,8,11,12,13, prowokacja reakcji obronnych4,8, mechanicznie ściskając Thorax12,14,15,16, preparowanie gruczołów jadowych8,17,18,19,xref"20,21,22 i zastosowanie agonistów receptora muskarynowego acetylocholiny<klasa SUP="xref">23. Ocena potencjalnych zalet i wad każdej metody jest skomplikowana ze względu na morfologię gruczołów jadowych heteroptera, które składają się z gruczołu głównego z dwoma oddzielnymi światłami, gruczołu głównego przedniego (AMG) i gruczołu głównego tylnego (PMG), a także powiązanego gruczołu dodatkowego (AG). Te różne przedziały gruczołowe wytwarzają różne wydzieliny białkowe, które mogą być wyspecjalizowane w różnych funkcjach biologicznych, w tym chwytaniu zdobyczy, obronie i trawieniu pozaustnym8,17. U robaków zabójców peiratyny i ektrychodyny AMG jest związany z chwytaniem zdobyczy, a PMG z trawieniem pozaustnym17. Jednak u pluskwiaka harfaktorycznego Pristhesancus plagipennis PMG specjalizuje się w chwytaniu i trawieniu zdobyczy, podczas gdy przypuszcza się, że AMG wydziela jad obronny8. AG został opisany jako pełniący niewielką funkcję sekrecji w Assassin bugs8 lub jako główne miejsce przechowywania proteaz w gigantycznych pluskwach wodnych23. Oczywiste jest, że potrzebne są dalsze prace w celu wyjaśnienia funkcji każdego przedziału gruczołu w różnych podgrupach heteropterów oraz określenia funkcji większości toksyn jadowych. W tym raporcie opisujemy protokoły zbierania toksyn jadowych od heteropterów w tym celu.

<table><tbody><tr><td>Elektrostymulator</td><td>Grass Technologies</td><td>S48 Kwadratowy stymulator impulsów</td><td>Elektrostymulator umożliwiający pulsacyjną elektrostymulację</td></tr><tr><td>Lekka jak piórko pęseta</td><td>Australijskie materiały entomologiczne</td><td>E122B</td><td>Do obchodzenia się z żywymi jadowitymi owadami</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>4693124001</td><td>Do zapobiegania autoproteolitycznemu trawieniu jadu</td></tr><tr><td>Rozwarstwienie sprzęt</td><td>Australijskie Materiały Entomologiczne</td><td>E152Micro</td><td>Do drobnych sekcji</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów Australijskie</td><td>Materiały Entomologiczne</td><td>E162</td><td>Do drobnych sekcji</td></tr></tbody></table>

zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropterańskie owady, takie jak robaki zabójcze (Reduviidae) i gigantyczne pluskwiaki wodne (Belostomatidae) pochodzą od wspólnego drapieżnego i jadowitego przodka, a większość istniejących heteroptera zachowuje tę strategię troficzną. Niektóre heteropteranie przestawiły się na żywienie się krwią kręgowców (takie jak pluskwy całujące Triatominae i pluskwy Cimicidae), podczas gdy inne powróciły do żywienia się roślinami (większość Pentatomomorpha). Jednak z wyjątkiem śliny używanej przez całujące robaki w celu ułatwienia odżywiania krwią, niewiele wiadomo o jadach heteropterów w porównaniu z jadami pająków, skorpionów i węży.
Jedną z przeszkód w charakterystyce toksyn jadu heteroptera jest struktura i funkcja gruczołów jadowych/wargowych, które są morfologicznie złożone i pełnią wiele ról biologicznych (obrona, chwytanie zdobyczy i trawienie pozaustne). W tym artykule opisujemy trzy metody, które z powodzeniem zastosowaliśmy do zbierania jadów heteropterańskich. Po pierwsze, przedstawiamy elektrostymulację jako wygodny sposób zbierania jadu, który często jest śmiertelny po wstrzyknięciu zwierzętom drapieżnym i który zapobiega zanieczyszczeniu przez tkankę gruczołową. Po drugie, wykazujemy, że delikatne nękanie zwierząt jest wystarczające, aby spowodować wytłaczanie jadu z trąbki i/lub plucie jadem w niektórych grupach heteropterów. Po trzecie, opisujemy metody zbierania toksyn jadowych poprzez sekcję znieczulonych zwierząt w celu uzyskania gruczołów jadowych. Metoda ta jest komplementarna z innymi metodami, ponieważ może pozwolić na zbieranie toksyn z taksonów, w których elektrostymulacja i nękanie są nieskuteczne. Protokoły te umożliwią naukowcom zbieranie toksyn z owadów heteropterowych w celu scharakteryzowania struktury i funkcji oraz możliwych zastosowań w medycynie i rolnictwie.

Niektóre gatunki pluskwiaków z podrzędu Heteroptera, takie jak harpactorine P. plagipennis oraz reduviine Platymeris rhadamanthus, wiarygodnie dostarczają dużych ilości (5-20 µL) jadu w odpowiedzi na elektrostymulację (Tabela 1). Ogólnie rzecz biorąc, większość pluskwiaków z podrodzin Peiratinae, Reduviinae i Harpactorinae wydziela jad przy zastosowaniu tej metody. Wśród pluskwiaków z podrodziny Stenopodainae, elektrostymulacja wywołała wydzielanie jadu ...

Chociaż wiele owadów z podrzędu Heteroptera (Insecta: Hemiptera) jest jadowitych, ich skład jadu i funkcje toksyn jadowych są w większości nieznane. Protokół ten opisuje metody zbierania jadów heteropterów w celu dalszej charakterystyki, przy użyciu elektrostymulacji, nękania i sekcji gruczołów.

Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Robaki zabójcy to grupa owadów, które używają jadu do paraliżowania i wstępnego trawienia zdobyczy. Jednak pomimo tego, że jady zwierzęce są przedmiotem zainteresowania jako nowe leki, środki owadobójcze i narzędzia naukowe, toksyny, które produkują, są prawie całkowicie niescharakteryzowane. Jednym z powodów jest to, że robaki zabójcy są mniej znane w porównaniu z kultowymi jadowitymi stawonogami, takimi jak pająki i skorpiony.Innym powodem jest to, że do niedawna niewiele było dostępnych informacji na temat tego, jak zbierać ich toksyny. W tym filmie przedstawimy metody, które umożliwią naukowcom skuteczne zbieranie toksyn jadowych z owadów zabójców, a także owadów pokrewnych, takich jak gigantyczne pluskwiaki wodne zabijające ryby. Protokół pierwszy opisuje, jak zbierać jad za pomocą elektrostymulacji.Najpierw zbierz odpowiednie owady. Dorosłe osobniki i duże nimfy są najłatwiejsze w pracy. Używanie owadów od dwóch do siedmiu dni po karmieniu jest idealne, aby upewnić się, że owady zgromadziły zapasy jadu, ale nie głodują.Przygotuj parę kleszczy z elektrodami na końcach i podłącz je do źródła prądu. Idealnie byłoby, gdyby to zasilanie było elektrostymulatorem zdolnym do dostarczania pięciu milisekundowych impulsów z częstotliwością pięciu herców. Używaj napięć szczytowych od 15 do 25 woltów odpowiednio dla małych lub dużych błędów.Jeśli elektrostymulator nie jest dostępny, użyj stałego napięcia od pięciu do 12 woltów. Powstrzymaj owada za pomocą gumek recepturek i piankowej platformy. Umieść trąbkę owada w rurce zbiorczej.Rurka do pipet P200 jest idealna dla większości owadów zabójców. Opcjonalnie przed zbiorem można dodać niewielką ilość wody do końcówki, aby zapewnić maksymalny odzysk jadu. Nałóż żel przewodzący na elektrody, włącz zasilanie i przyłóż pęsetę pod napięciem do owada.Eksperymentuj z różnymi punktami kontaktu, monitorując wydalanie jadu z trąbki. Przechowuj jad w ujemnych temperaturach, aby uniknąć trawienia autoproteolitycznego. Powtórz elektrostymulację nową rurką do pipety, aż nie pojawi się już jad.Protokół drugi opisuje, jak zbierać jad poprzez prowokowanie reakcji obronnej. Przygotuj i utrzymaj robaka zgodnie z powyższym opisem, wkładając trąbkę do końcówki zbierającej. Delikatnie nękaj robaka, aby sprowokować reakcję obronną, nie raniąc zwierzęcia.Czasami samo skrępowanie zwierzęcia lub włożenie trąbki do probówki zbiorczej może wywołać reakcję obronną, której towarzyszy wydalenie jadu z trąbki. Jeśli nie, delikatnie dotknij zwierzęcia po klatce piersiowej, nogach, brzuchu, a zwłaszcza czułkach, aby wywołać jad. W protokole trzecim, w pisemnej formie tego artykułu, opisujemy również, jak zbierać jad z gatunków, które plują jadem w sposób defensywny.Protokół czwarty opisuje, w jaki sposób zbierać jad bezpośrednio z gruczołów jadowych poprzez preparację. Znieczulaj zwierzęta poprzez wystawienie na działanie dwutlenku węgla przez 10 minut. Włóż trzy szpilki do tylnego brzucha, aby przytrzymać owada bez nakłuwania gruczołów jadowych.Wytnij krótkie nacięcie w linii środkowej na brzusznej powierzchni brzucha za pomocą miniaturowego skalpela. Użyj miniaturowych nożyczek, aby przedłużyć linię środkową w kierunku przednim do głowy, uważając, aby przeciąć tylko egzoszkielet i nie uszkodzić struktur wewnętrznych. Aby odsłonić struktury wewnętrzne, wykonaj wiele bocznych nacięć rozciągających się od nacięcia w linii środkowej do boku owada.Brzuszny egzoszkielet między każdymi dwoma cięciami można następnie przypiąć z powrotem, aby odsłonić wewnętrzne struktury. Zalej tacę sekcyjną roztworem soli fizjologicznej, aż owad zostanie zanurzony, co pozwoli wewnętrznym strukturom unosić się w górę i łatwiej je uwidocznić. Gruczoły jadowe pojawią się jako półprzezroczyste, wydłużone struktury rozciągające się po obu stronach przewodu pokarmowego.Za pomocą pęsety i mikronożyczek ostrożnie usuń tkankę łączną i nerwową oraz tchawicę, starając się nie pęknąć przewodu pokarmowego ani gruczołów jadowych. Gruczoł główny jest rozpoznawalny dzięki swojej charakterystycznej budowie, z płatami przednimi i tylnymi oraz dwoma przewodami spotykającymi się na wnęce. W przypadku robaków zabójców i być może innych heteropterów prawie wszystkie toksyny są przechowywane w światłach dwóch płatów głównego gruczołu.Dlatego po uwolnieniu gruczołu głównego z tchawicy i tkanki łącznej można przeciąć dwa przewody prowadzące od wnęki i pobrać główny gruczoł jadowy. Jeśli pożądany jest również gruczoł dodatkowy, zwykle znajduje się on po przeciwnej stronie jelita i można go jednoznacznie zidentyfikować, śledząc przewody od wnęki. W każdym razie należy uważać, aby nie złamać przedwcześnie gruczołów i nie stracić jadu do otaczającej soli fizjologicznej.Jeżeli płaty gruczołu głównego mają zostać oddzielone, należy to zrobić szybko po wyjęciu z soli fizjologicznej i niezwłocznie przystąpić do pobierania zawartości światła gruczołu, jak opisano w krokach 4.6 i 4.7 pisemnego rękopisu. Wyniki będą się różnić w zależności od dokładnego podprotokołu i gatunku użytego owada. Pierwszy i drugi podprotokół przedstawione w tym filmie pokazały, jak zbierać toksyny jadowe odpowiednio za pomocą elektrostymulacji i nękania.Obie te metody zazwyczaj dają skoncentrowany płyn zawierający około 50 do 250 miligramów białka i ponad 100 składników białkowych, w tym enzymy, toksyny tworzące pory i peptydy. Główną zaletą obu tych protokołów jest to, że są szybkie, nieśmiertelne, a jad nie jest zanieczyszczony przez tkankę gruczołową. Największą wadą zbioru za pomocą elektrostymulacji lub nękania jest to, że gruczołowe źródło uzyskanego jadu jest nieznane, a zawartość białka w zebranym jadzie może się różnić w zależności od protokołu.Ponadto elektrostymulacja i nękanie nie są skuteczne w przypadku wszystkich drapieżnych gatunków heteroptera. W ostatnim podprotokole pokazaliśmy, jak rozciąć nabrzmiałe gruczoły jadowe, aby bezpośrednio zebrać toksyny. Technika ta daje również koktajl różnych białek, chociaż w tym przypadku toksyny jadowe mogą wykazywać pewne zanieczyszczenie tkanką gruczołową.Jednak zaletą zbierania toksyn z wypreparowanych gruczołów jest to, że przedział gruczołowy, z którego pochodzi, jest dokładnie znany. Podsumowując, zachęcamy badaczy do wyboru metody zbioru odpowiedniej do ich pytania badawczego. Na przykład badania nad biologią stosowania jadu przez dany gatunek skorzystają na zastosowaniu wielu technik zbierania.W przypadku badań bioprospekcyjnych pojedyncza metoda zbierania jadów z wielu gatunków może być bardziej ekonomiczna, w zależności od konkretnego projektu eksperymentalnego. Mamy nadzieję, że ten film i towarzyszący mu artykuł pisemny ułatwią naukowcom zbieranie jadu z owadów zabójców i innych owadów heteropterańskich, co jest warunkiem wstępnym do zrozumienia jego składu, bioaktywności i ewolucji.

harvesting-venom-toxins-from-assassin-bugs-other-heteropteran

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten artykuł zawiera protokół ekstrakcji jadu z pająków za pomocą stymulacji elektrycznej w celu: 1) przeprowadzenia charakterystyki proteomicznej, 2) stymulowania ekspresji genów gruczołów jadowych oraz 3) przeprowadzenia badań funkcjonalnych jadów. Następnie opisano mikrodysekcje gruczołów jadowych do badań ekspresji genów.

Ekstrakcja jadu i mikrodysekcji gruczołów jadowych od pająków do analiz proteomicznych i transkryptomicznych

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Ten protokół opisuje obowiązkowy test żywieniowy w celu oceny potencjalnie toksycznego wpływu substancji fitochemicznej na larwy owadów z rzędu Lepidoptera. Jest to wysoce skalowalny test biologiczny owadów, łatwy do optymalizacji dawki subletalnej i śmiertelnej, działania odstraszającego i efektu fizjologicznego. Można to wykorzystać do badań przesiewowych przyjaznych dla środowiska środków owadobójczych.

Opracowanie systemu oznaczania żywienia do oceny owadobójczego wpływu fitochemikaliów na Helicoverpa armigera

Tutaj prezentujemy skuteczne protokoły konserwacji i ekstrakcji jadu dla hodowli Tityus serrulatus Lutz i Mello, 1922 (brazylijski żółty skorpion) na dużą skalę, w celu dostarczenia jadu do późniejszej produkcji jadu skorpiona, aby sprostać wymaganiom brazylijskiego systemu opieki zdrowotnej.

Utrzymanie w niewoli i ekstrakcja jadu Tityus serrulatus (brazylijskiego żółtego skorpiona) w celu produkcji antyjadu

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji jadu z Trichogramma dendrolimi za pomocą sztucznego gospodarza stworzonego z folii polietylenowej i roztworu aminokwasów.

Ekstrakcja jadu z pasożytniczej osy Trichogramma dendrolimi przy użyciu sztucznego żywiciela

Dzikie zwierzęta są często pasożytowane przez szeroki zakres robaków. Cztery główne typy robaków to "glisty" (nicienie), "robaki o kolczastych głowach" (acanthocephalans), "przywry" (przywry) i "tasiemce" (tasiemce). Tutaj opisujemy, w jaki sposób robaki są zbierane od kręgowców oraz jak są one zachowywane i identyfikowane taksonomicznie.

Zbieranie i identyfikacja robaków od dzikich zwierząt

Integracja hodowli mikroalg z przemysłowymi gazami spalinowymi ostatecznie wprowadzi metale ciężkie i inne związki nieorganiczne do podłoża wzrostowego. W pracy przedstawiono procedurę zastosowaną do określenia końcowego losu i wpływu metali ciężkich i zanieczyszczeń nieorganicznych na wzrost Nannochloropsis salina hodowanych w fotobioreaktorach.

Kwantyfikacja metali ciężkich i innych zanieczyszczeń nieorganicznych na produktywność mikroglonów

Testy behawioralne dostarczają potężnych narzędzi do zrozumienia funkcji neuronów. W tym miejscu przedstawiamy kilka protokołów ilościowego określania zachowań żywieniowych drapieżników występujących u modelowego nicienia Pristionchus pacificus i jego krewnych. Dodatkowo udostępniamy metody analizy adaptacji żywieniowych drapieżników, w tym budowy jamy ustnej i zębów.

Badanie drapieżnych zachowań żywieniowych u Pristionchus i innych nicieni

Mikroplastik działa jako wektor potencjalnie toksycznych zanieczyszczeń organicznych o nieprzewidywalnych skutkach. Protokół ten opisuje alternatywną metodologię oceny poziomów pestycydów chloroorganicznych zaadsorbowanych na granulkach z tworzywa sztucznego i identyfikacji struktury chemicznej polimeru. Nacisk kładziony jest na ekstrakcję płynu pod ciśnieniem i spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera o całkowitym współczynniku odbicia.

Ekstrakcja pestycydów chloroorganicznych z granulek tworzyw sztucznych i analiza typu tworzywa sztucznego

Przedstawiono metody ukierunkowanej ekstrakcji środków powierzchniowo czynnych obecnych w aerozolach atmosferycznych oraz określania ich bezwzględnych stężeń i krzywych napięcia powierzchniowego w wodzie, w tym ich krytycznego stężenia miceli (CMC).

Ekstrakcja i charakterystyka środków powierzchniowo czynnych z aerozoli atmosferycznych

Poznaj metody pozyskiwania jadu z robaków zabójców i innych owadów heteroptera przy użyciu elektrostymulacji oraz drażnienia. Protokoły te umożliwiają badaczom charakterystykę toksyn i ich potencjalne zastosowania.

Zbieranie toksyn jadowych z robaków zabójców i innych owadów heteroptera

Przeglądaj więcej filmów