Szybka izolacja mitoribosomu z komórek HEK

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczenie rybosomów z mitochondriów ludzkich linii komórkowych na dużą skalę, która jest wystarczająca do badań strukturalnych. Ta metoda oczyszczania rybosomów mitochondrialnych umożliwia scharakteryzowanie translujących kompleksów, mutantów, zespołów kontroli jakości i półproduktów podjednostek mitoribosomalnych. Można je wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące syntezy białek w mitochondriach.

Główną zaletą tej techniki jest to, że kawitacja azotu jest wykorzystywana do lizy komórek, a do przygotowania mitoribosomów do określenia struktury w wysokiej rozdzielczości potrzeba tylko 10 do 10 komórek hodowlanych. Technika ta może doprowadzić do odkrycia nowych składników maszynerii translacji mitochondriów i może być dalej wykorzystywana do opracowywania nowych metod leczenia raka. Po wyhodowaniu HEK293S komórek zgodnie z protokołem tekstowym, zbierz dwie jednolitrowe probówki komórek przez odwirowanie w temperaturze 1000 g i czterech stopniach Celsjusza przez siedem minut.

Ostrożnie zdekantować supernatant i szybko ponownie zawiesić każdą osadkę w 100 mililitrach PBS. Następnie połączyć komórki i odwirować zawiesinę w temperaturze 1 200 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Następnie, po dokładnym zdekantowaniu supernatantu, zważyć osad.

Następnie użyj 120 mililitrów buforu MIB, aby go ponownie zawiesić i pozostaw zawieszone komórki do spęcznienia w chłodnym pomieszczeniu na 20 minut. Przenieś spęczniałe komórki do wstępnie schłodzonej komory kawitacyjnej azotu na lodzie. Następnie dodaj 45 mililitrów buforu SM4 do komórek.

Zamocuj komorę kawitacyjną azotu i napełnij ją azotem, aż ciśnienie osiągnie 500 PSI. Następnie zakręć krany i trzymaj go na lodzie przez 20 minut. Metoda lizy komórek z kawitacją azotową zapobiega zewnętrznemu stresowi fizycznemu komórek, zapobiega uszkodzeniom cieplnym organelli, a gazowy azot chroni komórki przed utlenianiem.

Ponadto jest to metoda wysoce powtarzalna. Powoli zwolnij ciśnienie w komorze i zbierz lizat. Następnie, aby usunąć resztki komórek i jądra, odwiruj zlizowany materiał w temperaturze 800 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Zebrać supernatant, przelewając go przez złożony kawałek muślinowej tkaniny do zlewki trzymanej na lodzie. Nie wyrzucaj granulek. Zawiesić osad w 90 mililitrach bufora MiBSM.

Następnie, za pomocą homogenizatora ze szkła teflonowego, homogenizować próbkę i powtarzać wirowanie w temperaturze 800 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zebrać supernatant, przelewając go przez złożony kawałek muślinu do zlewki trzymanej na lodzie. Następnie połącz ten supernatant z pierwszym supernatantem.

Odwirować próbkę w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie zebrać supernatant jak poprzednio. Po odrzuceniu osadu należy odwirować supernatant zawierający surowe mitochondria w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut.

Ostrożnie wypłucz luźne granulki, nie naruszając ciasnej porcji. Następnie użyj 10 mililitrów bufora MiBSM, aby ponownie zawiesić ciasny granul. Dodaj 200 jednostek DNazy wolnej od RNaz do próbki, aby usunąć genomowe DNA i obracaj probówkę na wałku w chłodni przez 20 minut, aby równomiernie roztrawić próbkę.

Odwirować próbkę w temperaturze 10 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut i użyć dwóch mililitrów buforu SEM do ponownego zawieszenia osadu. Załaduj całą zawiesinę mitochondrialną na wierzch gradientu sacharozy. Po obróceniu gradientu zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą pipety transferowej, ostrożnie zbierz brązowy pasek migrujący na granicy 32% i 60% sacharozy.

Protokół ten wykorzystuje kawitację azotu do rozbijania komórek. Po opanowaniu, izolacja wysoce czystych, nienaruszonych mitochondriów na dużą skalę może być wykonana w ciągu dziewięciu godzin i może być łatwo modyfikowana i dostosowywana do różnych typów komórek i skal. Po rozmrożeniu zamrożonych mitochondriów na lodzie dodaj dwie objętości buforu do lizy do trzech mililitrów mitochondriów.

Natychmiast wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę. Użyj małego homogenizatora ze szkła teflonowego, aby wspomóc lizę i inkubuj homogenat na lodzie przez pięć do 10 minut, aby zakończyć reakcję. Odwirować lizat w temperaturze 30 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut, aby usunąć nierozpuszczalny materiał.

Następnie ostrożnie zebrać supernatant i wyrzucić osad. Powtórzyć wirowanie, aby zapewnić klarowanie supernatantu. Następnie ostrożnie zebrać supernatant i wyrzucić osad.

Na każdy mililitr lizowanego materiału przygotuj poduszkę sacharozy w ultra przezroczystej tubie TLA-120.2, dodając 0,4 mililitra poduszki sacharozy do probówek. Ułóż około jednego mililitra lizowanych mitochondriów na każdej poduszce sacharozy, co daje stosunek lizatu do poduszki 2,5 do jednego. Następnie odwirować próbkę w wirniku TLA-120.2 w temperaturze 231, 550 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 45 minut.

Odrzucić sklarowany osad i użyć 100 mikrolitrów buforu do spoczynku do sporządzenia zawiesiny w celu przepłukania probówki i usunięcia pozostałości sacharozy. Ponownie zawiesić granulki i połączyć je w sumie 100 mikrolitrów buforu do ponownego zawieszenia. Podczas ponownego zawieszania osadu poduszki konieczne jest wykonanie na lodzie, aby uniknąć nagrzewania się próbki, a także uniknąć spieniania się próbki, aby zapewnić integralność strukturalną rybosomów mitochondrialnych.

Wirować próbkę z małą prędkością przez 30 sekund, aby rozpuścić pozostałe agregaty i odwirować probówki w temperaturze 17 949 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Ostrożnie zebrać supernatant i powtórzyć wirowanie. Po zmierzeniu absorpcji mitoribosomów w A260 załaduj całą próbkę na pojedynczą liniową rurkę z gradientem sacharozy.

Odwirować próbkę w wirniku TLS-55 przy temperaturze 213, 626 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 120 minut. Aby ułamkować gradient, przebij spód probówki i zbierz próbkę kroplami w 96-dołkowej płytce. Oczyszczanie mitoribosomów nie powinno trwać dłużej niż siedem godzin, aby uzyskać wystarczającą ilość mitoribosomów.

Jak wykazano w tym nieciągłym gradiencie sacharozy, oczyszczone mitochondria migrują do brązowego dolnego pasma na granicy 32-60%. Po oddzieleniu mitoribosomów od rozpuszczalnych kompleksów mitochondrialnych na gradiencie sacharozy identyfikuje się dwie główne populacje mitoribosomów, monosom 55S i dużą podjednostkę 39S. Obecność dużej frakcji podjednostkowej sugeruje, że komórki są zbierane w stanie aktywnego podziału.

Ten panel pokazuje mikrofotografię z próbką z drugiego piku monosomu przy skalibrowanym powiększeniu 1,23 angstrema na piksel. Pokazano tutaj dane po wstępnym przetworzeniu, które ujawniły nienaruszone monosomy. Wreszcie, monosomowa rekonstrukcja 3D jest zilustrowana w tym panelu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować nienaruszone ludzkie mitoribosomy do badań strukturalnych i biochemicznych. Nasz protokół oferuje wysokiej jakości preparaty końcowe, które można ekstrapolować na inne makrocząsteczki mitochondrialne.