Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolizmu mózgu Drosophila i tego, jak nadmierna proliferacja komórek glejowych wpływa na przeprogramowanie metaboliczne, niezależnie od tego, czy dieta, czy zachowanie zmienia metabolizm. Główną zaletą tej techniki jest to, że mózgi much mogą być analizowane metabolicznie jako jedna cała nienaruszona tkanka z powtarzalnymi wynikami uzyskanymi przy pomiarze tylko jednego mózgu na raz. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w metabolizm mózgu muchy, można ją również zastosować do innych tkanek i systemów modelowych, takich jak dyski wyobrażeniowe i C. elegans.

Aby przygotować urządzenia ograniczające mikrotkanki, z pojemnika do przechowywania należy wybrać jedno urządzenie do utrzymywania mikrotkanek na mózg, który jest mierzony, oraz co najmniej trzy do użycia jako kontrole tylko do unieruchomienia. Używając kosza siatkowego i płytki sześciodołkowej, spłucz ograniczniki siedemdziesięcioprocentowym etanolem i umyj je trzykrotnie wodą dejonizowaną, za każdym razem przez dwie minuty. Wykonaj dodatkowe mycie wodą, jeśli ograniczniki nadal wydzielają zapach alkoholu.

Umyć ograniczniki mikrotkanek w pożywce do oznaczania i pozostawić je w roztworze, aż będą gotowe do użycia. Aby wypreparować mózg larwalny Drosophila melanogaster, wybierz larwy w późnym trzecim stadium rozwojowym z fiolki z hodowanymi muchami Organ R. Umieść larwę w studzience czystej płytki preparacyjnej zawierającej 500 mikrolitrów 1x PBS.

Następnie umyj larwę, delikatnie potrząsając nią w studzience i przenieś ją do innej czystej studzienki. Następnie umieść płytkę punktową pod mikroskopem preparacyjnym. Chwyć larwę w jej środkowej części jedną parą pęsety, chwytając haczyki na oczy drugą parą pęsety.

Delikatnie i płynnie pociągnij larwę w przeciwnych kierunkach za pomocą dwóch zestawów pęsety. Wizualizuj mózg, który zazwyczaj pozostaje przyczepiony do haczyków ocznych i zwykle ma przyczepione do niego dyski antenowe oka. Używając haczyków na oczy, aby utrzymać mózg na miejscu, ostrożnie usuń dodatkowe tkanki.

Na koniec oddziel haczyki oczne od mózgu. Następnie za pomocą pęsety przenieś wypreparowany mózg do nowej studzienki zawierającej 1x PBS. Aby dodać wypreparowane mózgi do 96-dołkowej płytki do testów metabolicznych, najpierw dodaj 50 mikrolitrów pożywki testowej do wszystkich dołków, w tym dołków eksperymentalnych, kontrolnych, tylko do ograniczeń i dołków tła.

Następnie ostrożnie umieść po jednym mózgu w każdej studzience. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj mikrosondy z wygiętą igłą, aby docisnąć mózgi do dna studni. Delikatnie umieść mózgi w środku trzech podniesionych kul za pomocą sondy.

Aby dodać ogranicznik mikrotkanek do 96-dołkowej płytki do oznaczania metabolizmu, najpierw umieść ją na krawędzi. Pod mikroskopem zorientuj go z plastikowym pierścieniem skierowanym w dół i siatką na górze. Następnie wyjmij płytkę z mikroskopu.

Użyj pęsety, aby chwycić ogranicznik po obu stronach i delikatnie wrzuć go do studni. Użyj mikrosondy z wygiętą igłą, aby wcisnąć ogranicznik do studzienki. Ograniczenia mikrotkanek muszą być odpowiednio umieszczone nad wyśrodkowanym mózgiem w każdym dołku, aby ta technika przyniosła znaczące wyniki.

Pod mikroskopem sprawdź, czy wypreparowany mózg jest widoczny przez ograniczenie tkanki i czy jest wyśrodkowany w studzience i powtórz procedurę dla wszystkich studzienek, które zostaną użyte w teście. Ostrożnie dodaj 130 mikrolitrów pożywki testowej do każdej z dołków eksperymentalnych, kontrolnych i ograniczających. Sprawdź, czy ograniczenia mózgów i mikrotkanek nie poruszyły się podczas dodawania pożywki.

Następnie dodaj 180 mikrolitrów pożywki testowej do czterech dołków narożnych do użycia jako kontrola tła. W tej procedurze należy zdjąć tabliczkę użytkową i dodać płytkę celi bez pokrywy w tej samej orientacji do analizatora metabolicznego. Wybierz Płytka ogniwa obciążnikowego", aby instrument przybrał płytkę ogniwa i zamknął tacę, a następnie rozpoczął test.

Po zakończeniu testu wyjmij wyrzuconą płytkę ogniwa i wkład. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego sprawdź, czy mózgi i ograniczenia mikrotkanek są nadal prawidłowo umieszczone w studzience po zakończeniu testu i wyklucz z analizy wszelkie studzienki z nieprawidłowościami. Gdy przestrzegane są zoptymalizowane warunki, testy z mózgiem larw i dorosłych dają odczyty OCR nieznacznie przekraczające 150 pikomoli na minutę w ustabilizowanym szóstym punkcie czasowym, około 25 minut po rozpoczęciu testu.

Tempo to utrzymuje się przez co najmniej 30 minut i do dwóch godzin. ECAR jest nieco niższy w mózgach dorosłych niż w mózgach larwalnych w szóstym punkcie czasowym i utrzymuje się przez co najmniej 30 minut. Odkrycie to odpowiada wzrostowi glikolizy w stadiach larwalnych w celu wsparcia wzrostu.

Wstrzyknięcie inhibitora mitochondrialnego, takiego jak oligomycyna, obniża odczyty OCR, aby ujawnić oddychanie zależne od ATP, a dalsze leczenie rotenonem i antymycyną A obniża OCR, ujawniając niemitochondrialne zużycie tlenu. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wyśrodkowaniu mózgu i upewnieniu się, że ograniczenie mikrotkanek jest zabezpieczone na miejscu przed uruchomieniem testu i podczas analizy. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak ilościowa PCR i analiza western blot, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób ekspresja genów przyczynia się do obserwowanego fenotypu metabolicznego.