Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące aktywacji, proliferacji i różnicowania limfocytów T1, a także stymulacji komórek odporności adaptacyjnej antygenem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie środowiska in vivo, a jednocześnie umożliwia manipulację komórkami in vitro. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji narządów i kości oraz transferu adoptywnego są trudne do opanowania za pomocą samych instrukcji tekstowych.

W celu wyizolowania komórek szpiku kostnego zdezynfekuj tylne kończyny dorosłej myszy 70% etanolem i użyj nożyczek, aby wykonać boczne nacięcie skóry w poprzek tylnych kończyn. Włóż nożyczki w przyśrodkową stronę nóg i przetnij skórę nożyczkami aż do początku kończyn tylnych. Następnie użyj kleszczy, aby oddzielić skórę od nóg.

Za pomocą nożyczek oddziel mięsień od kości udowej i piszczelowej, a nożyczkami rozłącz staw biodrowy, łamiąc głowę kości udowej. Następnie oddziel kość udową od piszczelowej bez łamania końców kości i umieść kości na szalce Petriego z kompletnym podłożem na lodzie. Kiedy wszystkie kości zostaną pobrane, ostrożnie odetnij bliższe i dalsze końce każdej kości skalpelem i użyj strzykawki o pojemności 1 milileta wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 milimetrów, aby kilkakrotnie przepłukać kości z łączną objętością 10 mililetów ciepłego, kompletnego podłoża RPMI.

Kiedy wszystkie kości zostaną wypłukane, przenieś całą zawartość naczynia do stożkowej rurki o średnicy 50 mililitrów wyposażonej w nylonowy filtr pajękowy o średnicy 70 mikrometrów i ostrożnie usuń wszelkie zanieczyszczenia i zlepki komórek, delikatnie mieszając i pipetując. Zebrać komórki szpiku kostnego przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililecie buforu do lizy czerwonych krwinek o temperaturze czterech stopni Celsjusza z pipetowaniem i inkubować mieszaninę na lodzie przez pięć minut.

Pod koniec inkubacji należy przerwać lizę za pomocą 10 mililetów PVS i ponownie zawiesić osad w 25 mililetach kompletnego podłoża do drugiego odwirowania. Następnie ponownie zawieś komórki w 5 mililetach świeżej, kompletnej pożywki do liczenia i ponownie odwiruj komórki. W celu wtórnej izolacji komórek tkanki limfatycznej należy pobrać węzły chłonne pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i mezentaryczne oraz śledzionę od myszy transgenicznych OT-II i przenieść wtórne tkanki limfatyczne na plastikową szalkę Petriego zawierającą 10 mililetów kompletnej pożywki RPMI.

Po pobraniu wszystkich tkanek przenieś węzły chłonne i śledzionę do sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów w stożkowej probówce o średnicy 50 milimetrów i użyj tłoka strzykawki do homogenizacji tkanek. Przepłucz sitko do 15 mililetów pożywki i odwiruj komórki przez odwirowanie. Następnie wyizoluj limfocyty T CD4-dodatnie przez sortowanie kulek magnetycznych, zgodnie ze standardowymi protokołami.

W celu aktywacji in vivo naiwnych limfocytów T CD4-dodatnich OT-II, oznacz komórki T izolowane kulkami magnetycznymi niezbędnym barwnikiem znacznikowym komórek, zgodnie ze standardowymi protokołami, i ponownie zawiesij znakowane komórki w 10 do szóstych komórek na 100 mikrolitrów stężenia PBS. Następnie adoptyjnie przenieś 100 mikrolitrów komórek na zwierzę przez żyłę ogonową. Przed wstrzyknięciem należy wstępnie ogrzać myszy, aby upewnić się, że żyły ogonowe są wystarczająco rozszerzone, aby umożliwić dostarczenie całej objętości komórek.

Po 24 godzinach dostarczyć od 10 do piątych dojrzałych komórek dendrytycznych OVA wypełnionych peptydem LPS przez wstrzyknięcie podskórne w opuszkę stopy każdego zwierzęcia, któremu wstrzyknięto limfocyty T. Dwa i pięć dni po wyzwaniu adopcyjnym należy pobrać węzły chłonne podkolanowe od zwierząt biorców w celu przetworzenia tkanek i izolacji komórek T, jak pokazano. Aby przeanalizować aktywację limfocytów T, wybarwić izolowane komórki drugiego dnia przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD4, CD69 i CD25, aby określić odsetek limfocytów T CD64-dodatnich, CD25-dodatnich w populacji biorcy CD4-dodatniej za pomocą cytometrii przepływowej.

Aby ocenić proliferację limfocytów T, wybarwij izolowane komórki z piątego dnia odpowiednimi przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD4 i przeanalizuj rozpad sygnału barwnika znacznika ważnych komórek w populacji limfocytów T CD4-dodatnich dawcy za pomocą cytometrii przepływowej. Aby ocenić różnicowanie Th1, płytka cztery razy po 10 do piątego dnia pięć izolowanych limfocytów T na dołek w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża, uzupełnionego jonomycyną i PMA na dołek, na 96-dołkowej płytce. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na sześć godzin, dodając Brefeldin A do każdej studzienki, aby zablokować wydzielanie cytokin w ciągu ostatnich czterech godzin stymulacji.

Pod koniec inkubacji odwirować płytkę i odrzucić supernatant przez szybką inwersję. Wybarwić komórki przeciwciałem anty-CD4, a następnie utrwalić w 100 mikrolitrach 2% paraformaldehydu i 1% sacharozy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczalność komórek za pomocą 50 mikrolitrów buforu permeabilizacji przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie odwirowanie płukania 150 mikrolitrami PBS na studzienkę.

Następnie wybarwić interesujące nas cytokin wewnątrzkomórkowe, zgodnie ze standardowymi protokołami, przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwa płuczki wirowania 150 mikrolitrami PBS uzupełnionymi 1% saponiną na studzienkę. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza cytometryczna przepływowa komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego GM-CSF po stymulacji LPS ujawnia regulację w górę markerów dojrzewania, takich jak MHCII, CD80 i CD86.

Naiwne limfocyty T OT-II CD4-dodatnie stają się aktywowane po adopcyjnym przeniesieniu do zwierząt biorców poprzez ich regulację w górę markerów aktywacji komórek T, ekspresję powierzchniową i wiele rund podziału komórek. Po aktywacji proliferujące się CD-dodatnie limfocyty T OT-II wykazują fenotyp Th1, o czym świadczy ich wewnątrzkomórkowa ekspresja interferonu gamma. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu wszystkich odczynników i materiałów na dzień przed eksperymentem. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią do badania komórek dendrytycznych i limfocytów T u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować szpik kostny z kości udowej i piszczelowej myszy oraz jak przenieść limfocyty T i komórki dendrytyczne do zwierząt biorców.

Nie zapominaj, że praca z ostrymi narzędziami, takimi jak igły, skalpele lub nożyczki, może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiedniej ochrony palców.