Name: Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę aktywacji limfocytów T CD4 i różnicowania Th1 in vivo przy użyciu mysiego modelu z komórkami dendrytycznymi ze szpiku kostnego. Protokół obejmuje izolację komórek, transfer adoptywny i analizę odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Simonowi Bartlettowi za edycję w języku angielskim. Badanie to było wspierane przez granty z Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; Numer identyfikacyjny PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), program Miguel Servet i Fundación Ramón Areces; przy współfinansowaniu ze środków Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). CNIC jest wspierany przez Ministerstwo Gospodarki, Przemysłu i Konkurencyjności (MEIC) oraz Fundację Pro CNIC i jest Centrum Doskonałości Severo Ochoa (SEV-2015-0505). RTF jest założony przez Fundación Ramón Areces i CNIC, VZG przez ISCIII, BHF przez Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12), a JMG-G przez ISCIII Miguel Servet Program i imas12.

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) i Comunidad Autónoma de Madrid zgodnie z hiszpańskimi i europejskimi wytycznymi. Myszy były hodowane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów (SPF) i zostały uśpione przez wdychanie dwutlenku węgla (CO2).
1. Izolacja komórek szpiku kostnego myszy od kości piszczelowych i udowych
UWAGA: Kongeniczny szczep myszy C57BL/6 zawiera różnicowy marker leukocytów Ptprca, ogólnie rozpoznawany jako CD45.1 lub Ly5.1, podczas gdy szczepy C57BL typu dzikiego zawierają allel Ptprcb, znany jako CD45.2 lub Ly5.2. Warianty CD45.1 i CD45.2 można odróżnić za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem przeciwciał. Myszy CD45.1, CD45.2 i CD45.1/CD45.2 mogą być używane jako źródła komórek lub jako biorcy do transferu adoptywnego, co pozwala na śledzenie odrębnych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Preferencyjnie należy używać samców lub samic myszy w wieku poniżej 12 tygodni dopasowanych pod względem wieku i płci.
<ol>
	<li>Przygotowanie kości udowych i piszczelowych
	<ol>
		<li>Eutanazja myszy przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami.</li>
		<li>Zdezynfekuj kończyny tylne, spryskując powierzchnię zwierzęcia 70% etanolem.</li>
		<li>Używaj sterylnych nożyczek, kleszczy i skalpeli. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w skórze i usuń skórę z dystalnej części myszy, w tym skórę pokrywającą tylne kończyny. Obierz skórę wokół dolnej części mięśnia łydki i całkowicie usuń skórę z nóg (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, 2B).</li>
		<li>Oddziel mięsień czworogłowy uda od kości udowej za pomocą skalpela. Zdemaskuj staw biodrowy bez złamania głowy kości udowej. Usuń mięśnie z kości piszczelowej za pomocą skalpela (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C, 2D). Oddziel kość udową od kości piszczelowej bez łamania końców kości.</li>
		<li>Trzymaj kości na szalce Petriego zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w lodowatym podłożu 1x Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek 
	UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać pod kapturem hodowlanym i przy użyciu sterylnego materiału, aby uniknąć zanieczyszczenia.
	<ol>
		<li>Na sterylnej szalce Petriego ostrożnie odetnij skalpelem bliższe i dalsze końce każdej kości.</li>
		<li>Kilkakrotnie przepłukać kości całkowitą objętością 10 ml ciepłej, kompletnej pożywki RPMI (RPMI + 10% FBS, 2 mM EDTA, 1% penicyliny/streptomycyny, 20 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 1 mM pirogronianu sodu i 2 mM L-glutaminy). Przepłukać kości z obu końców za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Przenieść ścieki do stożkowej rurki o pojemności 50 ml wyposażonej w nylonowy filtr sieciowy o średnicy 70 μm. Ostrożnie usunąć zanieczyszczenia i konglomeraty komórkowe, delikatnie mieszając i pipetując.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego buforu do lizy krwinek czerwonych (0,15 M NH4Cl + 1 mM KHCO3 + 0,1 mM EDTA, dostosować pH do 7,2 za pomocą 1 N HCl, 0,4 μm sterylnie przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C). Trzymaj na lodzie przez 5 minut z ręcznym potrząsaniem.</li>
		<li>Dodać 10 ml zimnego buforu (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 2 mM EDTA + 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) w celu inaktywacji i wypłukania buforu do lizy czerwonych krwinek.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć komórki 25 ml pełnej pożywki RPMI i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki RPMI. Zmieszać 50 μl zawiesiny komórek w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym. Określ liczbę komórek w komorze liczącej pod mikroskopem. Oblicz liczbę komórek za pomocą wzoru: Komórki/ml = [(liczba komórek niebarwionych/4) x 2 x 10 000]12. 
		UWAGA: Ta metoda daje 40 x 106 do 60 x 106 komórek szpiku kostnego na niezakażoną 8 do 12 tygodniową mysz C57BL/6.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Różnicowanie, dojrzewanie i ładowanie antygenów DC
<ol>
	<li>Zbieranie komórek BM
	<ol>
		<li>Wysiewaj kompletną kulturę na 6-dołkowych płytkach powierzchniowych o bardzo niskim przyleganiu w10-6 komórkach na ml pożywki, zwykle w 5 ml na studzienkę. Zróżnicowane makrofagi przyczepiają się do płytek hodowlanych. Po 12 godzinach przenieś supernatant, który zawiera głównie monocyty, do czystych płytek 6-dołkowych, odrzucając stare płytki 6-dołkowe z przylegającymi makrofagami.</li>
		<li>Aby promować różnicowanie komórek, hodować nieprzylegające komórki w 5 x 105 komórek na ml w typie 5 ml na studzienkę kompletnej pożywki RPMI zawierającej 20 ng / ml komercyjnie otrzymanej rekombinowanej mysiej GM-CSF w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO2) i obserwować codziennie.</li>
		<li>Co 3 dni odwiruj zawieszone komórki i zbierz przylegające komórki z 5 mM EDTA w PBS i odwiruj. Połączyć i ponownie zawiesić w stężeniach 5 x 105 komórek/ml w świeżej pożywce zawierającej 20 ng/ml rm-GM-CSF.</li>
		<li>W dniu 8 zebrać przylegające i oderwane komórki, jak powyżej, i ponownie zawiesić w 5 x 105 komórek/ml w pożywce zawierającej 20 ng/mL GM-CSF i 20 ng/ml lipopolisacharydu (LPS) przez 24 godziny na sterylnej szalce Petriego bez hodowli tkankowej, w celu wywołania wysokiej ekspresji MHC-II, CD80 i CD86.</li>
		<li>Sprawdź różnicowanie DC za pomocą cytometrii przepływowej, jak wskazano w kroku 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza różnicowania i dojrzewania cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten czyn dwukrotnie.</li>
		<li>Blokować receptory Fc poprzez inkubację zawieszonego osadu komórkowego w blokerze mysiego receptora Fc (oczyszczone przeciwciało anty mysie CD16/CD32 IgG2b) przez 15 minut w temperaturze 4 °C zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dla każdej sondy należy ponownie zawiesić 250 000 komórek w 300 μl buforu cytometrii przepływowej (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść 30 μl roztworu komórkowego na studzienkę do płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i dodać 30 μl buforu zawierającego przeciwciała do każdej studzienki zgodnie ze wskazaniami producenta. Inkubować komórki z przeciwciałami przez 20 minut w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Zwykle stosowanymi markerami dla DC, monocytów i makrofagów są CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 i CD86 (<silna klasa = "xfig">Figura 3).</li>
		<li>Odwirować próbki przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 200 μl na studzienkę buforu do cytometrii przepływowej na zimno zawierającego marker wykluczający martwe komórki (np. jodek propidyny, 4′,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) lub barwnik reagujący aminami) w zalecanym przez producenta stężeniu13.</li>
		<li>Monitoruj różnicowanie komórek, przenosząc próbki do probówek do cytometrii przepływowej i wykonując analizę cytometrii przepływowej z wyłączeniem martwych komórek w dniach 0, 3, 6 i 9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie antygenu DC.
	<ol>
		<li>W dniu 8 odwirować próbki o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić granulki w pożywce o pojemności 200 μl (RPMI + 10% FBS bez antybiotyków). Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
		<li>Inkubować DC z 10 μg/ml OVAp (323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) na 1 x 107 DC w 1 ml pożywki (RMPI + 1% FBS) w plastikowej probówce przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C. Jako warunek kontroli ujemnej należy stosować DC nieobciążone OVAp.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić granulki w 200 μl pełnej pożywki RPMI. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
		<li>Odwirować próbki przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić granulki w podłożu o pojemności 200 μl (RPMI + 10% FBS) przy 2 x 106 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja naiwnych limfocytów T CD4 od myszy OTII
UWAGA: Ta metoda daje około 100 x 106 spleenocytów na niezainfekowaną 8 do 12 tygodniową mysz C57BL/6. Można stosować zarówno mężczyzn, jak i kobiety. Limfocyty T CD4 można wyizolować ze śledziony lub węzłów chłonnych; Limfocyty T CD4 stanowią odpowiednio około 25% i 50% komórek w tych narządach. Wykonaj następujące czynności w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Wyizoluj pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i krezkowe węzły chłonne oraz śledzionę od transgenicznych myszy OTII (<silna klasa = "xfig" >ryc. 4) i przenieś je na plastikową szalkę Petriego zawierającą 10 ml kompletnej pożywki RPMI.</li>
	<li>Przepłucz sitko komórkowe 2 ml kompletnej pożywki RPMI i wyjmij je z probówki o pojemności 50 ml. Przenieś węzły chłonne i śledzionę do sitka komórkowego o wielkości 70 μm umieszczonego w probówce o pojemności 50 ml. Homogenizować za pomocą tłoka strzykawki (<silna klasa="xfig">Rysunek 5) i dodać pożywkę do 15 ml.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić osad w 15 ml pełnej pożywki RPMI. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>W przypadku zawiesiny komórek śledziony należy ponownie zawiesić osad komórkowy i poddać lizie krwinki czerwone, jak wskazano w kroku 1.2.5.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć komórki 25 ml kompletnej pożywki RPMI i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki. Zmieszać 50 μl zawiesiny komórek w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym. Określ liczbę komórek za pomocą komory liczącej pod mikroskopem. Oblicz liczbę komórek za pomocą wzoru: komórki/ml = [(liczba komórek niebarwionych/4) x 2 x 10 000]12.</li>
	<li>Powtórz krok 2.2.2.</li>
	<li>Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, inkubować komórki z rozcieńczeniami biotynylowanych przeciwciał przeciwko CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (I-Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25 i DX5 przez 30 minut na lodzie w celu późniejszej negatywnej selekcji limfocytów T CD4.</li>
	<li>Postępując zgodnie z instrukcjami producenta oraz na podstawie liczby komórek i pojemności kulek, należy obliczyć wymaganą ilość mikrokulek magnetycznych pokrytych streptawidyną i wyizolować limfocyty T CD4 za pomocą magnetycznego separatora komórek i odpowiednich kolumn separacyjnych.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki RPMI i trzymać je na lodzie podczas liczenia żywych komórek zgodnie z opisem w kroku 3.7.</li>
	<li>Ekstrahować 2 x 105 komórek i sprawdzić czystość pobranych komórek za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych anty CD4, CD3, B220 i CD8 w cytometrze przepływowym przy użyciu zalecanych przez producenta rozcieńczeń przeciwciał.</li>
	<li>Aby wybarwić izolowane naiwne limfocyty T CD4 / OTII, ponownie zawieś 106 komórek w buforze 500 μl (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA). Przygotuj 500 μl buforu (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) zawierającego dwukrotnie wyższe niż zalecane przez producenta końcowe stężenie barwnika znacznikowego dla komórek. Wymieszaj oba roztwory, powoli dodając roztwór znacznika komórek do zawiesiny komórek. Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyć komórki 5 ml pełnej pożywki RPMI i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki RPMI przy 1 x 107komórek/ml.</li>
</ol>
4. Test aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 in vivo
UWAGA: Vital cell tracer dye karboksyfluoresceiny dioctan sukcynimidylu ester (CFSE) i inne barwniki na bazie estrów sukcynimidylowych, które są wzbudzone i emitują fluorescencję na różnych długościach fal, są szeroko stosowane do oceny proliferacji limfocytów za pomocą cytometrii przepływowej ze względu na ich wysoką intensywność fluorescencji, długą żywotność, niską zmienność i niską toksyczność14.
<ol>
	<li>Adoptywnie przenieś (dożylnie) 1 x 106 żywych, ważnych komórek znacznikowych, barwionych barwnikiem, naiwnych limfocytów T CD4 / OTII w 100 μl PBS na mysz. Oznaczone limfocyty T mogą być adoptywnie przenoszone przez żyłę ogonową lub wstrzyknięcie zaoczodołowe15; w obu przypadkach komórki będą domem dla narządów limfatycznych (<silna klasa="xfig">Ryc. 6A).</li>
	<li>Rzuć wyzwanie myszom biorcom dzień później, adoptywnie przenosząc 100 000 dojrzałych w LPS DC załadowanych OVAp przez wstrzyknięcie podskórne (si) w opuszki stóp (<silna klasa = "xfig">Figura 6B).</li>
	<li>Pobrać węzły chłonne podkolanowe od myszy biorców i przetwarzać je aż do uzyskania zawiesin jednokomórkowych, wykonując te same czynności, jak opisano poprzednio w ppkt 3.1 i 3.2. Zrób to w 2 dniu po szczepieniu, aby zmierzyć aktywację limfocytów T CD4 / OTII oraz w 5 dniu, aby zmierzyć proliferację i różnicowanie Th1.</li>
	<li>Aby przeanalizować aktywację limfocytów T w dniu 2, wybarwić komórki przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD4, CD69 i CD25 (opcjonalnie CD45.1 i CD45.2) i określić procent limfocytów T C69 + CD25 + w populacji CD4. Analiza za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 7).</li>
	<li>Aby sprawdzić proliferację limfocytów T w 5 dniu, wybarwij komórki za pomocą odpowiednich przeciwciał fluorescencyjnych przeciwko CD4 i opcjonalnie CD45.1 i CD45.2. Przeanalizuj rozpad sygnału barwnika znacznikowego ważnych komórek w populacji CD4 za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 8). W badaniach tych można określić kilka parametrów, takich jak liczba podziałów komórkowych przechodzących przez komórki znakowane niezbędnym barwnikiem znacznikowym komórek, procent dzielących się komórek w każdym piku fluorescencji oraz procent dzielących się komórek w całej populacji komórek.</li>
	<li>Aby określić różnicowanie Th1 w 5 dniu, należy umieścić 400 000 komórek na basenie 96-dołkowej płytki w 200 μl kompletnej pożywki RPMI zawierającej 1 μM jonomycynę i 10 ng/ml octanu mirystynianu 13 forbolu 12 (PMA) przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Przez ostatnie 4 godziny dodawać 3–10 μg/ml brefeldyny A, aby zablokować wydzielanie cytokin do pożywki.</li>
	<li>Odwirować płytki przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez szybkie odwrócenie płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Powtórz krok 2.2.2.</li>
	<li>Wybarwić błony komórkowe przez inkubację przez 15 minut w temperaturze 4 °C w 30 μl buforu (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) zawierającego przeciwciała przeciwko CD4 i opcjonalnie przeciwko CD45.1 i CD45.2 w rozcieńczeniach zalecanych przez producenta. Przepłukać komórki, dodając 150 μl buforu (1x PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA) i odwirować płytki przez 5 minut w temperaturze 250 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając 100 μl 2% paraformaldehydu/1% sacharozy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować płytki przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek poprzez dodanie 50 μl wewnątrzkomórkowego buforu permeabilizacji (1x PBS + 0,1% BSA, 0,01 M HEPES, 0,3% saponiny) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 150 μl PBS i wirować przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej stężenia. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Wybarwić cytokiny wewnątrzkomórkowe, dodając 30 μl przeciwciała anty IFNγ sprzężonego z fluoroforem w buforze (PBS + 0,1% saponiny) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyj komórki, dodając 150 μl buforu (PBS + 0,1% saponiny). Odwirować płytki przez 5 minut przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Analizuj populacje komórek za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 8).</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+effector+CD4+T+cell+populations+%28%2A%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of effector CD4 T cell populations (*).</a> Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).</li>
<li>Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+Lymphocyte+Polarity+in+Cognate+Immune+Cell-Cell+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Granado, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+lamin-A+couples+actin+dynamics+with+immunological+synapse+architecture+and+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation.</a> Science Signaling. 7 (322), ra37(2014).</li>
<li>Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+lamin-A+as+a+coordinator+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation.</a> Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).</li>
<li>Rocha-Perugini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD9+Regulates+Major+Histocompatibility+Complex+Class+II+Trafficking+in+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).</li>
<li>Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+and+memory+T-cell+differentiation%3A+implications+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).</li>
<li>Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Differentiation+of+Naive+CD4%28%2B%29+T+Cells%3A+A+Tool+for+Understanding+the+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).</li>
<li>Toribio-Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamin+A%2FC+augments+Th1+differentiation+and+response+against+vaccinia+virus+and+Leishmania+major%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major.</a> Cell Death & Disease. 9 (1), 9(2018).</li>
<li>Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+Transduction+of+Bone+Marrow+Progenitor+Cells+to+Generate+T-cell+Receptor+Retrogenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).</li>
<li>Cruz-Adalia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+CD4%28%2B%29+T+cells+present+bacterial+antigens+to+induce+cytotoxic+and+memory+CD8%28%2B%29+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses.</a> Nature Communications. 8 (1), 1591(2017).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51627(2014).</li>
<li>Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Capture+Bacteria+by+Transinfection+from+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e52976(2016).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies.</a> European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animals+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Warth, S. C., Heissmeyer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+transduction+of+naive+CD4+T+cells+to+study+Treg+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie zdolności DC pochodzących z BM do modulowania aktywacji, proliferacji i różnicowania naiwnych limfocytów T CD4. Co więcej, może być również stosowany do oceny podatności limfocytów T CD4 na modulację przez prądy stałe pochodzące z BM. Dzięki temu protokołowi zmiany w tych zdarzeniach mogą być mierzone in vivo.
W zależności od badanej hipotezy można zastosować kilka kombinacji limfocytów T i DC. Na przykład, można przeanalizować konsekwencje w...

Limfocyty T CD4 i komórki prezentujące antygen (APC), takie jak DC, są wymaganymi mediatorami odporności na patogeny mikrobiologiczne1,2. W obwodowych narządach limfatycznych limfocyty T CD4 są aktywowane po rozpoznaniu specyficznych antygenów prezentowanych przez APCs3,4,5. Aktywowane limfocyty T CD4 namnażają się i różnicują w odrębne specyficzne komórki efektorowe Th, które są niezbędne do rozwoju prawidłowej adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej6,7. Kontrola tych procesów ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia odpowiedniej obrony adaptacyjnej, która zabija patogen bez powodowania szkodliwych uszkodzeń tkanek8. Komórki Th są definiowane zgodnie z ekspresją lub produkcją cząsteczek powierzchniowych, czynników transkrypcyjnych i cytokin efektorowych i pełnią podstawowe i precyzyjne funkcje w odpowiedzi na patogeny1. Komórki podzbioru komórek Th1 wyrażają czynnik transkrypcyjny T-bet i interferon cytokinowy γ (IFNγ) i uczestniczą w obronie gospodarza przed patogenami wewnątrzkomórkowymi1. Kwantyfikacja naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania limfocytów T CD4 jest użytecznym sposobem oceny roli, jaką limfocyty T odgrywają w odpowiedzi immunologicznej.
Ten protokół umożliwia analizę in vivo zdolności generowanych in vitro DC pochodzących z BM do modulowania aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych limfocytów T CD4. Protokół służy również do oceny zdolności naiwnych limfocytów T CD4 do aktywacji, indukowania do proliferacji i różnicowania Th1 (<silna klasa = "xfig" >Figura 1). Ten wszechstronny protokół pozwala obejść brak możliwości specyficznego manipulowania lub selekcji badanej populacji komórek w protokołach czysto in vivo. Wpływ różnych cząsteczek i terapii na DC można badać za pomocą BM od genetycznie zmodyfikowanych myszy5 lub poprzez leczenie lub genetyczne manipulowanie izolowanymi komórkami BM9. Podobnie, odpowiedzi limfocytów T można zbadać, uzyskując limfocyty T do transferu adoptywnego z różnych źródeł lub po kilku manipulacjach3,8,10.
Główne zalety tego protokołu są dwojakie. Aktywacja, proliferacja i różnicowanie limfocytów T są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej; Jest to połączone z badaniami in vivo, zapobiegając w ten sposób zmianom, które mogą wystąpić in vitro, a także uwzględniając typy komórek i inne czynniki występujące tylko w nienaruszonych narządach<klasa SUP="xref">11.
Użycie barwników witalnych jest powszechnie stosowaną techniką do śledzenia proliferacji komórek przy jednoczesnym unikaniu użycia radioaktywności. Pomiar proliferacji za pomocą tych odczynników opiera się na rozcieńczeniu barwnika po podziale komórek. Co więcej, barwniki te mogą być wykrywane na wielu długościach fal i są łatwo analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w połączeniu z wieloma przeciwciałami lub markerami fluorescencyjnymi. Podkreślamy użyteczność tego protokołu, pokazując, w jaki sposób aktywacja, proliferacja i różnicowanie limfocytów Th1 mogą być analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20,824,365</td> 5 <td>L</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki (FST)</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej (F.S.T.)</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td> precyzyjne <td>Narzędzia do nauki (FST)</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>do narzędzi naukowych (FST)</td><td>10020-00</td><td>Pudełko ze 100 ostrzami</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>SIGMA</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>GIBCO</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 25</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Novico</td><td>N15663</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m nylonowy filtr wstęgowy</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do czerwonej krwi</td><td>SIGMA</td><td>R7757</td><td>100 Ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>ED2SS-250</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>SIGMA</td><td>302643-25G</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)</td><td>Cambrex</td><td>BE17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>Merck</td><td>8-05740-0250</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>LONZA</td><td>BE13-115E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>LONZA</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów makrofagów (GM-CSF)</td><td>Prepotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>lipopolisacharyd (LPS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L2018</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka</td><td>Costar</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>v450 anty-mysie przeciwciało CD11b</td><td>BD Biosciences</td><td>560455</td><td></td></tr><tr><td>PE anty-mysie przeciwciało CD64</td><td>BioLegend</td><td>139303</td><td></td></tr> PE przeciwciało <tr><td>anty-mysie CD115</td><td>BioLegend</td><td>135505</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-myszy Przeciwciało CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciw mysim przeciwciałom MHCII</td><td>BioLegend</td><td>125507</td><td></td></tr><tr><td>APC przeciwciało przeciw mysim CD86</td><td>BioLegend</td><td>105011</td><td></td></tr><tr><td>APC przeciwciało przeciw mysim CD80</td><td>Probówki do</td><td></td> cytometrii przepływowej BioLegend 104713 <td></td></tr><tr><td>Zelian</td><td></td><td>300800-1</td><td>PS 12X75 5mL</td></tr><tr><td>OTII Peptyd</td> <td>owoalbuminowyInvivoGen</td><td>323-339</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie biotynylowane przeciwciało CD8&alfa;</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0081-U500</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie biotynylowane przeciwciało IgM</td><td>BioLegend</td><td>406503</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie biotynylowane B220</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0452-U500</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie biotynylowane przeciwciało CD19</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0193-U500</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowane przeciwciało przeciw myszom MHCII (I-Ab)</td><td>BioLegend</td><td>115302</td><td></td></tr><tr><td>antymysie biotynylowane przeciwciało CD11b</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0112-U500</td><td></td></tr><tr><td>antymysie biotynylowane przeciwciało CD11c</td><td>BioLegend</td><td>117303</td><td></td></tr><tr><td>biotynylowane przeciwciało anty-mysie CD44</td><td>BioLegend</td><td>103003</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie biotynylowane Przeciwciało CD25</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>30-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>antymysie biotynylowane przeciwciało DX5</td><td>BioLegend</td><td>108903</td><td></td></tr><tr><td>mikrokulki magnetyczne pokryte streptawidyną</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny separator komórek</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>QuadroMACS Separator</td></tr><tr><td>Kolumny separacyjne</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>PE przeciwciało anty-mysie CD4</td><td>BioLegend</td><td>100408</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom CD3</td><td>BioLegend</td><td>100235</td><td></td></tr><tr><td>FITC przeciwciało przeciw myszom CD8</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0081-U025</td><td></td></tr><tr><td>Cell Violet Tracer</td><td>Thermofisher</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom CD25 APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0251-U100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 przeciwciało anty-mysie CD69</td><td>BioLegend</td><td>104518</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD45.1 PerCPCY5.5</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>65-0453</td><td></td></tr><tr><td>APC przeciwciało anty-mysie CD45.1</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0453</td><td></td></tr><tr><td>PECY7 przeciwciało anty-mysie CD45.1</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>60-0453</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-myszy CD45.2 przeciwciało</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0454</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Octan mirystynianu 13 Phorbol 12 (PMA)</td><td>SIGMA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BD GolgiPlug)</td><td>BD</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Millipore</td><td>8-18715-02100</td><td></td></tr><tr><td>Wewnątrzkomórkowy bufor permeabilizacyjny</td><td>eBioscience</td><td>00-8333</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom IFNg APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-7311-U100</td><td></td></tr><tr><td>Blok Fc (anty-mysie CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-U100</td><td></td></tr><tr><td>B6. Myszy SJL CD45.1</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa&trade; Analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>649225</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>62248</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania th1 limfocytów t cd4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Kwantyfikacja aktywacji, proliferacji i różnicowania naiwnych limfocytów T CD4 do komórek T pomocniczych 1 (Th1) jest użytecznym sposobem oceny roli, jaką odgrywają limfocyty T w odpowiedzi immunologicznej. Protokół ten opisuje różnicowanie in vitro komórek progenitorowych szpiku kostnego (BM) w celu uzyskania komórek dendrytycznych (DC) pochodzących z czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF). Protokół opisuje również adoptywny transfer peptydu albuminy jaja kurzego (OVAp) DC pochodzących z GM-CSF i naiwnych limfocytów T CD4 od transgenicznych myszy OTII w celu analizy aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 in vivo przenoszonych limfocytów T CD4. Protokół ten omija ograniczenia metod czysto in vivo, wynikające z braku możliwości specyficznego manipulowania lub selekcji badanej populacji komórek. Co więcej, protokół ten umożliwia badania w środowisku in vivo, unikając w ten sposób zmian w czynnikach funkcjonalnych, które mogą wystąpić in vitro, oraz uwzględniając wpływ typów komórek i innych czynników występujących tylko w nienaruszonych narządach. Protokół jest użytecznym narzędziem do generowania zmian w limfocytach DC i T, które modyfikują adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne, potencjalnie dostarczając ważnych wyników pozwalających zrozumieć pochodzenie lub rozwój wielu chorób związanych z układem odpornościowym.

Rysunek 1 przedstawia kroki opisane w niniejszym protokole. Rysunek 2 ilustruje izolację i hodowlę komórek szpiku kostnego (BM) myszy. Dodanie GM-CSF i LPS do tych hodowli umożliwia generowanie i dojrzewanie komórek dendrytycznych (DCs) in vitro. Rysunek 3 przedstawia analizę cytometrii przepływowej różnicowania i dojrzewania uzyskanych DCs. Obciążone OVAp DCs pochodzące z BM hodowane z GM-C...

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące aktywacji, proliferacji i różnicowania limfocytów T1, a także stymulacji komórek odporności adaptacyjnej antygenem. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badanie środowiska in vivo, a jednocześnie umożliwia manipulację komórkami in vitro. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji narządów i kości oraz transferu adoptywnego są trudne do opanowania za pomocą samych instrukcji tekstowych.W celu wyizolowania komórek szpiku kostnego zdezynfekuj tylne kończyny dorosłej myszy 70% etanolem i użyj nożyczek, aby wykonać boczne nacięcie skóry w poprzek tylnych kończyn. Włóż nożyczki w przyśrodkową stronę nóg i przetnij skórę nożyczkami aż do początku kończyn tylnych. Następnie użyj kleszczy, aby oddzielić skórę od nóg.Za pomocą nożyczek oddziel mięsień od kości udowej i piszczelowej, a nożyczkami rozłącz staw biodrowy, łamiąc głowę kości udowej. Następnie oddziel kość udową od piszczelowej bez łamania końców kości i umieść kości na szalce Petriego z kompletnym podłożem na lodzie. Kiedy wszystkie kości zostaną pobrane, ostrożnie odetnij bliższe i dalsze końce każdej kości skalpelem i użyj strzykawki o pojemności 1 milileta wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 milimetrów, aby kilkakrotnie przepłukać kości z łączną objętością 10 mililetów ciepłego, kompletnego podłoża RPMI.Kiedy wszystkie kości zostaną wypłukane, przenieś całą zawartość naczynia do stożkowej rurki o średnicy 50 mililitrów wyposażonej w nylonowy filtr pajękowy o średnicy 70 mikrometrów i ostrożnie usuń wszelkie zanieczyszczenia i zlepki komórek, delikatnie mieszając i pipetując. Zebrać komórki szpiku kostnego przez odwirowanie. Zawiesić osad w jednym mililecie buforu do lizy czerwonych krwinek o temperaturze czterech stopni Celsjusza z pipetowaniem i inkubować mieszaninę na lodzie przez pięć minut.Pod koniec inkubacji należy przerwać lizę za pomocą 10 mililetów PVS i ponownie zawiesić osad w 25 mililetach kompletnego podłoża do drugiego odwirowania. Następnie ponownie zawieś komórki w 5 mililetach świeżej, kompletnej pożywki do liczenia i ponownie odwiruj komórki. W celu wtórnej izolacji komórek tkanki limfatycznej należy pobrać węzły chłonne pachwinowe, pachowe, ramienne, szyjne i mezentaryczne oraz śledzionę od myszy transgenicznych OT-II i przenieść wtórne tkanki limfatyczne na plastikową szalkę Petriego zawierającą 10 mililetów kompletnej pożywki RPMI.Po pobraniu wszystkich tkanek przenieś węzły chłonne i śledzionę do sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów w stożkowej probówce o średnicy 50 milimetrów i użyj tłoka strzykawki do homogenizacji tkanek. Przepłucz sitko do 15 mililetów pożywki i odwiruj komórki przez odwirowanie. Następnie wyizoluj limfocyty T CD4-dodatnie przez sortowanie kulek magnetycznych, zgodnie ze standardowymi protokołami.W celu aktywacji in vivo naiwnych limfocytów T CD4-dodatnich OT-II, oznacz komórki T izolowane kulkami magnetycznymi niezbędnym barwnikiem znacznikowym komórek, zgodnie ze standardowymi protokołami, i ponownie zawiesij znakowane komórki w 10 do szóstych komórek na 100 mikrolitrów stężenia PBS. Następnie adoptyjnie przenieś 100 mikrolitrów komórek na zwierzę przez żyłę ogonową. Przed wstrzyknięciem należy wstępnie ogrzać myszy, aby upewnić się, że żyły ogonowe są wystarczająco rozszerzone, aby umożliwić dostarczenie całej objętości komórek.Po 24 godzinach dostarczyć od 10 do piątych dojrzałych komórek dendrytycznych OVA wypełnionych peptydem LPS przez wstrzyknięcie podskórne w opuszkę stopy każdego zwierzęcia, któremu wstrzyknięto limfocyty T. Dwa i pięć dni po wyzwaniu adopcyjnym należy pobrać węzły chłonne podkolanowe od zwierząt biorców w celu przetworzenia tkanek i izolacji komórek T, jak pokazano. Aby przeanalizować aktywację limfocytów T, wybarwić izolowane komórki drugiego dnia przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD4, CD69 i CD25, aby określić odsetek limfocytów T CD64-dodatnich, CD25-dodatnich w populacji biorcy CD4-dodatniej za pomocą cytometrii przepływowej.Aby ocenić proliferację limfocytów T, wybarwij izolowane komórki z piątego dnia odpowiednimi przeciwciałami fluorescencyjnymi przeciwko CD4 i przeanalizuj rozpad sygnału barwnika znacznika ważnych komórek w populacji limfocytów T CD4-dodatnich dawcy za pomocą cytometrii przepływowej. Aby ocenić różnicowanie Th1, płytka cztery razy po 10 do piątego dnia pięć izolowanych limfocytów T na dołek w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża, uzupełnionego jonomycyną i PMA na dołek, na 96-dołkowej płytce. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza na sześć godzin, dodając Brefeldin A do każdej studzienki, aby zablokować wydzielanie cytokin w ciągu ostatnich czterech godzin stymulacji.Pod koniec inkubacji odwirować płytkę i odrzucić supernatant przez szybką inwersję. Wybarwić komórki przeciwciałem anty-CD4, a następnie utrwalić w 100 mikrolitrach 2% paraformaldehydu i 1% sacharozy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczalność komórek za pomocą 50 mikrolitrów buforu permeabilizacji przez 30 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, a następnie odwirowanie płukania 150 mikrolitrami PBS na studzienkę.Następnie wybarwić interesujące nas cytokin wewnątrzkomórkowe, zgodnie ze standardowymi protokołami, przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dwa płuczki wirowania 150 mikrolitrami PBS uzupełnionymi 1% saponiną na studzienkę. Następnie przeanalizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza cytometryczna przepływowa komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego GM-CSF po stymulacji LPS ujawnia regulację w górę markerów dojrzewania, takich jak MHCII, CD80 i CD86.Naiwne limfocyty T OT-II CD4-dodatnie stają się aktywowane po adopcyjnym przeniesieniu do zwierząt biorców poprzez ich regulację w górę markerów aktywacji komórek T, ekspresję powierzchniową i wiele rund podziału komórek. Po aktywacji proliferujące się CD-dodatnie limfocyty T OT-II wykazują fenotyp Th1, o czym świadczy ich wewnątrzkomórkowa ekspresja interferonu gamma. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu wszystkich odczynników i materiałów na dzień przed eksperymentem. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się immunologią do badania komórek dendrytycznych i limfocytów T u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować szpik kostny z kości udowej i piszczelowej myszy oraz jak przenieść limfocyty T i komórki dendrytyczne do zwierząt biorców.Nie zapominaj, że praca z ostrymi narzędziami, takimi jak igły, skalpele lub nożyczki, może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie odpowiedniej ochrony palców.

an-vivo-mouse-model-to-measure-nave-cd4-t-cell-activation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi jest poważnym powikłaniem po allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego. Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. W niniejszym artykule opisano nowatorską platformę przeszczepu szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w rozwoju choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi i efektowi przeszczep przeciwko białaczce.

Platforma do przeszczepiania szpiku kostnego w celu zbadania roli komórek dendrytycznych w chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

Poznaj metodę aktywacji limfocytów T CD4 i różnicowania Th1 in vivo przy użyciu mysiego modelu z komórkami dendrytycznymi ze szpiku kostnego. Protokół obejmuje izolację komórek, transfer adoptywny i analizę odpowiedzi immunologicznej.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów