Name: Metoda hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj metodę hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem guza. Technika ta jest prosta, powtarzalna i pozwala izolować efekty parakrynne bez kontaktu bezpośredniego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni pacjentom za ich udział w pobieraniu tkanek do tych eksperymentów. Nagroda Akademii Raka Jajnika OCRP Departamentu Obrony (W81XWH-15-0253) oraz nagroda pilotażowa od Colleen's Dream Foundation dla Anirban K. Mitra wsparły te badania.

Protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnej Rady Regulacyjnej Uniwersytetu Indiana.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Izolacja i hodowla ludzkich pierwotnych komórek międzybłonka
	<ol>
		<li>Wyizoluj ludzkie pierwotne komórki międzybłonka (HPMC) od ludzkiej sieci komórkowej, jak opisano wcześniej17,18 i hoduj je na kompletnym pożywce wzrostowej [Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny, 1% aminokwasów endogennych i 1% witamin] w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		UWAGA: HPMC są zwykle uprawiane do 100% konfluencji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki wzrostu komórek raka jajnika
	<ol>
		<li>Hoduj komórki raka jajnika HeyA8 w kompletnym pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
		UWAGA: Użyj komórek HeyA8 wyhodowanych do około 80% zbieżności (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Konfiguracja posiewu proksymalnego
	<ol>
		<li>Używaj wkładek Transwell do płytek 6-dołkowych z membraną poliwęglanową o grubości 10 μm poddanej działaniu kultur tkankowych z porami 0,4 μm (108 porów/cm2) i obszarem wzrostu 4,67cm2. W razie potrzeby zoptymalizuj pod kątem różnych rozmiarów wkładek, skalując liczbę komórek zasianych zgodnie z powierzchnią wzrostu. Przed użyciem podgrzać kompletną pożywkę wzrostową, trypsynę i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do temperatury 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wkładek
	<ol>
		<li>Aby wysiać komórki HeyA8 na dolnej powierzchni membrany wkładki, wyjmij wkładkę z opakowania za pomocą sterylnych kleszczy i umieść ją odwróconą w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 15 cm.</li>
		<li>Użyj naczynia o średnicy 15 cm, ponieważ ma ono głębokość, aby pomieścić odwróconą wkładkę, lub zastąp je dowolnym odpowiednim sterylnym pojemnikiem. W zależności od eksperymentu umieść wymaganą liczbę wkładek w naczyniu o średnicy 15 cm.</li>
		<li>Oznaczyć odpowiednio trzy kontrole i trzy warunki eksperymentalne markerem na krawędzi wkładek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek rakowych
	<ol>
		<li>Aby trypsynizować komórki HeyA8 hodowane przy 80% zbiegu w kolbie o średnicy 25 cm2 (~ 2 x 106 komórek), dodaj 1 ml trypsyny (0,25%) przez 40–60 s i zneutralizuj trypsynę 6 ml kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Odwirować komórki w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Policz żywe komórki za pomocą metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek rakowych
	<ol>
		<li>Zawieś 100 000 komórek/ml żywych komórek HeyA8 w kompletnej pożywce wzrostowej. Ostrożnie wysiewaj 80 000 komórek HeyA8 zawieszonych w 800 μl kompletnego podłoża wzrostowego na dnie wkładki (która jest teraz skierowana do góry, ponieważ jest odwrócona).</li>
		<li>Zasiej komórki, aby utworzyły kształt przypominający kopułę, tak aby komórki pozostały na wkładce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). Zacznij od środka membrany i powoli przesuwaj się na zewnątrz koncentrycznymi okręgami, powoli pipetując. Unikaj oddalania się od krawędzi na więcej niż 3 mm, aby zapobiec rozlaniu się medium. 
		UWAGA: Liczba wysianych komórek będzie zależeć od tempa wzrostu komórek i czasu trwania eksperymentu. Liczba komórek HeyA8 wysianych do tej bliższej hodowli została zoptymalizowana i komórki będą zlewać się w 80-90% pod koniec trzeciego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyczepienie komórek rakowych
	<ol>
		<li>Przykryj 15-centymetrową naczynie i ostrożnie przenieś naczynie zawierające wkładki do inkubatora CO2 . Bardzo ważne jest, aby na tym etapie nie zakłócać spadku podłoża i komórek na wkładce. Pozostawić komórki w temperaturze 37 °C na 4 godziny, aby umożliwić komórkom rakowym przyczepienie się do wkładki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek międzybłonka
	<ol>
		<li>Po około 4 godzinach trypsynizuj HPMC wyhodowane przy 100% zbiegu w kolbie o średnicy 75 cm2 (~ 4 x 106 komórek) z 2 ml trypsyny (0,25%) przez 1-2 minuty i zneutralizuj trypsynę 12 ml kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Odwirować komórki przy 500 x g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i policzyć żywe komórki przy użyciu metody wykluczania barwnika trypanowego niebieskiego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie komórek międzybłonka
	<ol>
		<li>Zawiesić 300 000 komórek/ml żywych HPMC w kompletnej pożywce wzrostowej. Dodaj 2,5 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Ostrożnie wynieś 15-centymetrową naczynie z wkładkami do okapu bezpieczeństwa biologicznego. Używając sterylnych kleszczy, odwróć wkładkę i umieść ją w dołku płytki 6-dołkowej tak, aby była pionowa, z komórkami HeyA8 przymocowanymi do dolnej powierzchni zanurzonymi w kompletnym pożywce wzrostowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>Wysiewaj 450 000 HPMC zawieszonych w 1,5 ml pożywki wzrostowej we wnętrzu wkładek z komórkami HeyA8 przymocowanymi do powierzchni skierowanej do dna studzienki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C) lub do wkładek bez żadnych komórek HeyA8 dla kontroli HPMC. Dodać 1,5 ml pożywki wzrostowej bez komórek do kontrolek HeyA8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa kultury proksymalnej
	<ol>
		<li>Pozwól kulturze proksymalnej rosnąć w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 72 godziny. W razie potrzeby podłoże można uzupełnić w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Do wnętrza wkładki należy usunąć 750 μl i dodać 750 μl świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.</li>
			<li>Z zewnętrznej strony wkładki (płytki 6-dołkowej) należy pobrać 1 ml i dodać 1 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej. 1 ml został wybrany ze względu na wygodę wymiany podłoża w jednym kroku. W razie potrzeby 1,25 ml można wyjąć i wymienić.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie komórek
	<ol>
		<li>Zebrać komórki po 72 godzinach hodowli proksymalnej. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu komórek HeyA8 i HPMC. Trypsynizuj komórki, odwiruj je i poddaj lizie osad zamiast lizy komórek na membranie, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trypsyna komórek
	<ol>
		<li>Przepłukać obie strony wkładu za pomocą 1x PBS.</li>
		<li>Przenieś wkładki do nowej studzienki i dodaj trypsynę. Dodaj 0,5 ml trypsyny do wnętrza wkładki i dodaj 2 ml trypsyny do płytki 6-dołkowej, aby trypsynizować komórki rakowe przyczepione do dolnej powierzchni wkładki. Inkubować płytkę przez 2 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Neutralizacja trypsyny
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej do wnętrza wkładki, aby zneutralizować trypsynę, pipetuj w górę iw dół, a następnie weź komórki i przenieś je do oznakowanej probówki zbiorczej. Dodaj dodatkowe 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej, aby uzyskać całkowitą neutralizację. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić membrany podczas pipetowania, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu komórek.</li>
		<li>Aby zebrać komórki na dnie wkładki, odpipetuj 2 ml trypsyny, która została dodana w kroku 12.2, na dolną powierzchnię 2–3 razy, tak aby komórki wpadły na dno płytki 6-dołkowej. Zneutralizować trypsynę znajdującą się na dnie płytki za pomocą 6 ml pożywki wzrostowej i przenieść zawartość płytki do oznakowanej probówki zbiorczej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie i liza komórek 
	<ol>
		<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 3 minuty i odessać pożywkę. Ponownie zawiesić i poddać lizie osady komórkowe za pomocą 0,7 ml odczynnika do lizy na bazie tiocyjanianów fenolu i guanidyny do ekstrakcji RNA. Wyizolować RNA za pomocą dowolnego odpowiedniego zestawu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
UWAGA: Poniższe kroki opisują ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) w celu zbadania zmian ekspresji genów w wyniku hodowli proksymalnej.
<ol>
	<li>Przygotuj cDNA z próbek RNA do qPCR. Użyj dowolnej odpowiedniej odwrotnej transkryptazy z odpowiednim buforem i losowymi starterami, aby zapewnić odwrotną transkrypcję całego mRNA (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Oceń zmiany w poziomach ekspresji mRNA fibronektyny (FN1) i E-kadheryny (CDH1) oraz transformacji czynnika wzrostu beta 1 (TGFβ1) metodą qPCR z dehydrogenazą 3-fosforanową aldehydu glicerynowego (GAPDH) jako kontrola wewnętrzna. Możliwe jest użycie standaryzowanych, dostępnych na rynku testów ekspresji genów (patrz tabela materiałów) lub zaprojektowanie starterów.</li>
	<li>Porównaj komórki HeyA8 hodowane w kulturze proksymalnej z HPMC z kontrolami HeyA8 i HPMC hodowane w kulturze proksymalnej z kontrolami HPMC.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
<li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation%2C+Wound+Healing%2C+and+Tissue+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li>
<li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li>
<li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals%3A+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li>
<li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li>
<li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li>
<li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> 43-58 (2016).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
<li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zrozumienie mechanizmu sygnalizacji parakrynnej i jukstakrynowej między komórkami jest niezbędne do uzyskania lepszej wiedzy na temat prawidłowej homeostazy tkanek i stanów chorobowych 7,8. Większość badań sygnalizacji parakrynnej przeprowadza się poprzez pobranie kondycjonowanej pożywki z jednego typu komórki i użycie jej do leczenia drugiego typu komórki. Ta metoda ma tę zaletę, że jest z natury prosta. Jednak nie podsumowuje dokładnie zlokalizowanych stężeń wy...

Rola produktywnych wzajemnych interakcji między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem guza w progresji guza została dobrze ugruntowana i stała się głównym przedmiotem badań w biologii nowotworów1. Podobne przypadki sygnalizacji dwukierunkowej mają kluczowe znaczenie podczas gojenia się ran, odpowiedzi immunologicznej, angiogenezy, nisz komórek macierzystych oraz podczas rozwoju2,3,4,5,6,7,8. Wspólnym motywem wszystkich tych procesów biologicznych jest to, że komórki reagują na różne sposoby na zewnątrzkomórkowe sygnały z ich mikrośrodowiska, które determinują los komórki, fizjologię tkanek i postęp choroby. W związku z tym coraz bardziej skupiamy się na lepszym zrozumieniu mechanizmów zaangażowanych w taką komunikację między komórkami. Większość takich interakcji obejmuje sygnalizację parakrynną lub juktakrynową między komórkami. Sygnalizacja parakrynna polega na wydzielaniu określonych czynników sygnałowych przez jedną komórkę, które są odbierane przez odpowiednie receptory na innej komórce w pobliżu, wywołując w niej odpowiedź9,10, podczas gdy sygnalizacja juxtacrine wymaga bezpośredniego kontaktu między składnikami komórkowymi dwóch zaangażowanych komórek11,12.
Taka sygnalizacja jest kluczowym elementem homeostazy tkanek, jak również mikrośrodowiska guza. Komórki nowotworowe czerpią korzyści z czynników parakrynnych i jukstakrynowych z komórek zrębu guza, w tym fibroblastów związanych z rakiem (CAF), komórek odpornościowych i adipocytów13,14,15,16. Sygnalizacja parakrynna może być pośredniczona przez czynniki wzrostu, cytokiny, chemokiny itp., Podczas gdy sygnalizacja przyklatakrylowa obejmuje zestawione ligandy i receptory, jak w sygnalizacji Notch, lub interakcje między integrynami i ich odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej. Wykazaliśmy znaczenie wzajemnych interakcji między komórkami raka jajnika a CAF w progresji guza i przerzutach14. Podobnie, interakcje komórek raka jajnika z przerzutami z komórkami międzybłonka pokrywającymi miejsce przerzutów regulują kluczowe mikroRNA i czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych, które sprzyjają kolonizacji przerzutowej17,18.
Większość badań nad sygnalizacją parakrynną polega na użyciu kondycjonowanego podłoża pobranego z jednego typu komórki do leczenia drugiego typu komórek. Chociaż podejście to jest szeroko stosowane, nie replikuje ono skutecznie zlokalizowanych poziomów wysokiego stężenia wydzielanego czynnika w mikrośrodowisku komórki odbiorczej. Nie odtwarza również kinetyki ciągłego przepływu wydzielanego czynnika wytwarzanego przez jedną komórkę i odbieranego przez sąsiednią komórkę. Sygnalizacja parakrynna jest skuteczna na krótkich dystansach, ponieważ wydzielane czynniki mają wymagane stężenia tylko w pobliżu komórki źródłowej i mają tendencję do dyfuzji i rozcieńczania się wraz ze wzrostem odległości. To zlokalizowane wysokie stężenie wydzielanego czynnika jest niezbędne do wywołania odpowiedzi w komórce receptorowej. Co więcej, odpowiedź w komórkach biorcy zależy również od równowagi nowo wydzielanych czynników i ich ciągłego wyczerpywania się poprzez degradację, wiązanie i internalizację w komórkach biorcy oraz dyfuzję z dala od komórki źródłowej. Kondycjonowane podłoże można stężyć, aby uwzględnić wyższe miejscowe stężenia obecne w mikrośrodowisku, ale nie można dokładnie odtworzyć dokładnych stężeń. Co więcej, nie może naśladować naturalnej kinetyki produkcji i wyczerpywania się danego czynnika. Aby dokładniej odtworzyć sygnalizację parakrynną i oddzielić ją od mechanizmów sygnalizacji przybuksztynowej, opracowaliśmy nową metodę hodowli proksymalnej, która polega na hodowaniu dwóch typów komórek na obu powierzchniach porowatej błony. Pory są na tyle małe, że zapobiegają interakcjom z przykustaryną, a jednocześnie umożliwiają wymianę wydzielanych czynników w miejscowo wysokich stężeniach. W ten sposób system ten zachowuje kinetykę produkcji i zubożenia czynników parakrynnych.

<table><tbody><tr><td>Przepuszczalny wspornik Transwell 24 mm z 0,4 i mikro; m Wkładka membranowa z poliwęglanu</td><td>porów Corning (Costar)</td><td>3412</td><td>&bull; 10 &micro; M gruba półprzezroczysta membrana poliwęglanowa &; Poddany obróbce w celu optymalnego przylegania komórek i bull; Pakowane 6 wkładek w płytkę 6-dołkową, 4 płytki w opakowaniu i bull; Membrana musi być barwiona pod kątem widoczności komórek &bull; Sterylizowane promieniowaniem gamma</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>Płaskie dno, poddane działaniu TC, sterylne, z pokrywką</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane 15 cm</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>Sterylne, poddane działaniu TC Naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nieistotne aminokwasy kwasy</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Witaminy</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td>Każda marka jest w porządku</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td> CO2 Każda <td>marka jest w porządku</td></tr><tr>Szafka <td></td><td></td><td>poziomu bezpieczeństwa biologicznego II</td><td>Każda marka jest w porządku</td></tr><tr><td>Test ekspresji genów FN1 TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 Test ekspresji genów TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 Test ekspresji genów TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Ekspresja genów TaqMan Test</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini zestaw do izolacji RNA</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>Komórki raka jajnika HeyA8</td><td>Uzyskane z Ernst Lengyel Lab, University of Chicago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; Przeciwciało neutralizujące</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Interakcje międzykomórkowe odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w progresji guza, odpowiedziach immunologicznych, angiogenezie i rozwoju. Sygnalizacja parakrynna lub juktakrynowa pośredniczy w takich interakcjach. Wykorzystanie uwarunkowanego podłoża i badań nad współkulturą są najczęstszymi metodami rozróżniania tych dwóch typów interakcji. Jednak wpływ miejscowych wysokich stężeń wydzielanych czynników w mikrośrodowisku podczas interakcji parakrynnych nie jest dokładnie rekapitulowany przez uwarunkowaną pożywkę, a tym samym może prowadzić do nieprecyzyjnych wniosków. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy metodę hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej. Dwa typy komórek są hodowane na obu powierzchniach membrany poliwęglanowej o grubości 10 μm z porami 0,4 μm. Pory umożliwiają wymianę wydzielanych czynników i jednocześnie hamują sygnalizację przyklatową. Komórki mogą być zbierane i poddawane lizie w punkcie końcowym w celu określenia skutków sygnalizacji parakrynnej. Oprócz umożliwienia miejscowych gradientów stężeń wydzielanych czynników, metoda ta jest podatna na eksperymenty obejmujące przedłużone okresy hodowli, a także stosowanie inhibitorów. Chociaż używamy tej metody do badania interakcji między komórkami raka jajnika a komórkami międzybłonka, które napotykają w miejscu przerzutów, można ją dostosować do dowolnych dwóch typów komórek przylegających, aby naukowcy mogli badać sygnalizację parakrynną w różnych dziedzinach, w tym w mikrośrodowisku guza, immunologii i rozwoju.

Przerzutujące komórki raka jajnika napotykają komórki mezotelialne w miejscu przerzutu w obrębie jamy otrzewnej19. Efektywne oddziaływania parakrynne i jukstakrynne z komórkami mezotelialnymi pomagają w indukowaniu odpowiedzi adaptacyjnych w komórkach raka jajnika, co umożliwia pomyślny przerzut17,18,20,21. Aby przetestować skuteczność me...

Interakcje komórkowe parakrynne i juktakrynowe odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w progresji guza, odpowiedziach immunologicznych, angiogenezie i rozwoju. W tym przypadku stosuje się metodę hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej, w której utrzymywane są zlokalizowane stężenia wydzielanych czynników, jednocześnie zapobiegając bezpośredniemu kontaktowi komórkowemu.

Metoda hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komunikacji międzykomórkowej dotyczące wzajemnych interakcji parakrynnych i jukstakrynowych między dwoma typami komórek. Główną zaletą tej metody jest to, że jest to bardzo prosta i powtarzalna technika, która dokładnie wychwytuje sygnalizację parakrynną w typowych warunkach hodowli, jednocześnie zapobiegając skutecznej sygnalizacji przykrzepnej. Implikacje tej techniki obejmują lepsze zrozumienie mechanizmu przesłuchu między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem guza.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje między komórkami rakowymi a zrębem guza, może być również stosowana do innych systemów, takich jak gojenie się ran i angiogeneza. Zacznij od odłączenia komórek raka jajnika od 80% zlewającej się mieszaniny z jednym mililitrem 0,25% trypsyny przez 40 do 60 sekund, a następnie zneutralizuj reakcję sześcioma mililitrami kompletnej pożywki wzrostowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do 100 000 komórek raka jajnika na mililitr całkowitego stężenia pożywki wzrostowej i umieścić trzy odwrócone wkładki do hodowli tkanek z poliwęglanu o średnicy 0,4 mikrometra poddane działaniu kultur z poliwęglanu na warunki eksperymentalne w sterylnym naczyniu do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości. Oznacz wkładki zgodnie z warunkami eksperymentalnymi i ostrożnie pipetuj komórki rakowe na dno każdej wkładki w koncentrycznych okręgach, zaczynając od środka membrany i przesuwając się na zewnątrz, tworząc kopułę o pojemności 800 mikrolitrów. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wysiewania komórek na dolną powierzchnię wkładki, aby kopuła pożywki zawierającej komórki nie spływała z krawędzi wkładki podczas inkubacji.Gdy wszystkie wkładki zostaną wysiane, przykryj naczynie i ostrożnie umieść wkładki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po około czterech godzinach odłącz HPMC z dwoma mililitrami 0,25% trypsyny na jedną do dwóch minut, a następnie zneutralizuj reakcję za pomocą 12 mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Zebrać HPMC przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej do liczenia.Rozcieńczyć komórki do 300 000 HPMC na mililitr kompletnej pożywki wzrostowej i dodać 2,5 mililitra świeżej kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki hodowlanej. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść każdą wkładkę prawą stroną do góry w każdym dołku sześciodołkowej płytki, tak aby dolne powierzchnie przyłączone do komórek raka jajnika były zanurzone w pożywce. Następnie zasiej 1,5 mililitra HPMC do dołka każdej wkładki.Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 72 godziny. Pod koniec inkubacji ostrożnie wyjmij wkładki z każdej studzienki i przepłucz obie strony wkładek PBS. Umieść każdą wkładkę w nowej sześciodołkowej płytce i dodaj 0,5 mililitra trypsyny do dołków wkładanych i dwa mililitry trypsyny do dołków dolnych.Po dwóch minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki wzrostowej do każdej wkładki i ostrożnie odpipetuj roztwór kilka razy, nie rozrywając membrany ani nie rozlewając zawiesiny komórek do studzienki poniżej. Podczas pipetowania należy zwrócić uwagę na to, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia krzyżowego komórek z jednej komory z innymi. Przenieś zawieszone komórki do oznakowanej probówki zbiorczej i dalej neutralizuj trypsynę za pomocą dodatkowych dwóch mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej.Aby zebrać komórki na dnie wkładek, przepłucz dna membran dwa do trzech razy dwoma mililitrami trypsyny z odpowiedniego dołka płytki sześciodołkowej, tak aby oderwane komórki zostały złapane w odpowiednie dna studzienki. Gdy wszystkie komórki zostaną odłączone, zneutralizuj trypsynę w każdym dołku za pomocą sześciu mililitrów świeżej pożywki wzrostowej i przenieś zawiesiny komórek do oznakowanych probówek zbiorczych. Następnie zbierz wszystkie komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w 0,7 mililitra odczynnika do lizy na bazie tiocyjanianu fenolu i guanidyny na probówkę w celu ekstrakcji i izolacji RNA zgodnie ze standardowymi protokołami.Bliższa hodowla HPMC z komórkami raka jajnika powoduje zwiększoną ekspresję fibronektyny i transformującego czynnika wzrostu lub TGF beta jeden w porównaniu z kontrolnym HPMC wysiewanym na insertach przy braku komórek rakowych. Ekspresja zarówno fibronektyny, jak i TGF beta również znacznie wzrasta w komórkach raka jajnika po bliższym posiewie z HPMC w porównaniu z kontrolnymi komórkami jajnika hodowanymi pod nieobecność HPMC. I odwrotnie, komórki raka jajnika leczone pożywką kondycjonowaną HPMC wykazują znacznie zmniejszoną ekspresję fibronektyny bez zmiany ekspresji TGF beta one.Blokowanie TGF beta one za pomocą przeciwciała neutralizującego powoduje jednak znaczny spadek ekspresji TGF beta one w komórkach raka jajnika w bliższej hodowli z HPMC. Co ciekawe, niewielki wzrost ekspresji TGF beta one obserwuje się w kontrolnych komórkach raka jajnika hodowanych nieproksymalnie, prawdopodobnie jako odpowiedź kompensacyjną. Posiew proksymalny z komórkami raka jajnika nieznacznie zwiększa ekspresję E-kadheryny w HPMC, podczas gdy obserwuje się wyraźny spadek E-kadheryny w komórkach raka jajnika hodowanych w pobliżu HPMC w porównaniu z grupą kontrolną, co dodatkowo dowodzi skuteczności systemu hodowli proksymalnej w badaniu sygnalizacji parakrynnej między komórkami raka jajnika a normalnymi komórkami w miejscu przerzutów.Podczas próby tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować liczbę wysianych komórek i czas trwania hodowli proksymalnej. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunoblotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w ekspresji białek i aktywacji szlaków sygnałowych dalszego przetwarzania podczas kohodowli komórek międzybłonka komórek nowotworowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrośrodowiskiem nowotworów, immunologią i biologią rozwojową do badania wzajemnych interakcji parakrynnych między komórkami za pośrednictwem wydzielanych czynników.

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie rozwijamy model proksymalnej kokultury komórek raka jajnika i pierwotnych ludzkich komórek międzybłonka. Ten fizjologicznie istotny model pozwala na badanie sygnalizacji parakrynnej, w której lokalne stężenia wydzielanych czynników są utrzymywane, jednocześnie zapobiegając bezpośredniemu kontaktowi komórkowemu.

System hodowli proksymalnej: technika hodowli in vitro do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Opisano model hodowli komórkowej tętnic oporowych, pozwalający na rozbiór szlaków sygnałowych w śródbłonku, mięśniach gładkich lub między śródbłonkiem a mięśniami gładkimi (połączenie mięśniowo-śródbłonkowe). Selektywne zastosowanie agonistów lub izolacji białek, mikroskopia elektronowa lub immunofluorescencja mogą być wykorzystane przy użyciu tego modelu hodowli komórkowej.

Model hodowli komórkowych tętnic oporowych

Przedstawiamy protokół do badania wzajemnych oddziaływań między napromieniowanym promieniowaniem rentgenowskim Caco-2 a komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC). Protokół rozpoczyna się od napromieniania Caco-2 i ustanowienia kokultury z PBMC; następnie regularnie przez 48 godzin mierzy się przeznabłonkowy opór elektryczny, a western blot wykonuje się zarówno w Caco-2, jak i PBMC.

Metoda wspólnej hodowli do badania przesłuchów między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC

Udostępniamy protokoły oceny mezenchymalnych komórek macierzystych wyizolowanych z miazgi zębowej i interakcji komórek raka prostaty w oparciu o bezpośrednie i pośrednie metody wspólnej hodowli. Membrany Condition Medium i trans-well są odpowiednie do analizy pośredniej aktywności parakrynnej. Wysiewanie różnie barwionych komórek razem jest odpowiednim modelem bezpośredniej interakcji komórka-komórka.

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki miazgi i współhodowla z komórkami nowotworowymi w celu zbadania ich interakcji

Tutaj prezentujemy metodę wykorzystującą przepuszczalne nośniki błonowe, aby ułatwić badanie bezkontaktowej sygnalizacji parakrynnej używanej przez komórki nowotworowe do tłumienia odpowiedzi immunologicznej. System jest podatny na badanie roli czynników wydzielanych przez nowotwór w tłumieniu aktywacji makrofagów.

Badanie wpływu ligandów parakrynnych wydzielanych przez guz na aktywację makrofagów przy użyciu kokultury z przepuszczalnymi nośnikami błonowymi

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Niniejsze badanie przedstawia wysoce powtarzalną i wykonalną metodę badania parakrynnych niekanonicznych zdarzeń sygnalizacyjnych Wnt in vitro. Protokół ten zastosowano do oceny wpływu parakrynnej sygnalizacji Wnt5a w mysich komórkach grzebienia nerwowego i mioblastach.

Modelowanie parakrynnej niekanonicznej sygnalizacji Wnt in vitro

W tym artykule, nowo zaprojektowana wkładka wydrukowana w 3D jest przedstawiona jako model kokultury i zweryfikowana przez badanie parakrynnej komunikacji międzykomórkowej między komórkami śródbłonka a keratynocytami.

Innowacyjna wkładka drukowana w 3D zaprojektowana z myślą o prostych hodowlach komórkowych 2D i 3D

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Poznaj metodę hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem guza. Technika ta jest prosta, powtarzalna i pozwala izolować efekty parakrynne bez kontaktu bezpośredniego.

Metoda hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

Przeglądaj więcej filmów