Metoda hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej między komórkami

Interakcje komórkowe parakrynne i juktakrynowe odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w progresji guza, odpowiedziach immunologicznych, angiogenezie i rozwoju. W tym przypadku stosuje się metodę hodowli proksymalnej do badania sygnalizacji parakrynnej, w której utrzymywane są zlokalizowane stężenia wydzielanych czynników, jednocześnie zapobiegając bezpośredniemu kontaktowi komórkowemu.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komunikacji międzykomórkowej dotyczące wzajemnych interakcji parakrynnych i jukstakrynowych między dwoma typami komórek. Główną zaletą tej metody jest to, że jest to bardzo prosta i powtarzalna technika, która dokładnie wychwytuje sygnalizację parakrynną w typowych warunkach hodowli, jednocześnie zapobiegając skutecznej sygnalizacji przykrzepnej. Implikacje tej techniki obejmują lepsze zrozumienie mechanizmu przesłuchu między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem guza.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje między komórkami rakowymi a zrębem guza, może być również stosowana do innych systemów, takich jak gojenie się ran i angiogeneza. Zacznij od odłączenia komórek raka jajnika od 80% zlewającej się mieszaniny z jednym mililitrem 0,25% trypsyny przez 40 do 60 sekund, a następnie zneutralizuj reakcję sześcioma mililitrami kompletnej pożywki wzrostowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej.

Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do 100 000 komórek raka jajnika na mililitr całkowitego stężenia pożywki wzrostowej i umieścić trzy odwrócone wkładki do hodowli tkanek z poliwęglanu o średnicy 0,4 mikrometra poddane działaniu kultur z poliwęglanu na warunki eksperymentalne w sterylnym naczyniu do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości. Oznacz wkładki zgodnie z warunkami eksperymentalnymi i ostrożnie pipetuj komórki rakowe na dno każdej wkładki w koncentrycznych okręgach, zaczynając od środka membrany i przesuwając się na zewnątrz, tworząc kopułę o pojemności 800 mikrolitrów. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wysiewania komórek na dolną powierzchnię wkładki, aby kopuła pożywki zawierającej komórki nie spływała z krawędzi wkładki podczas inkubacji.

Gdy wszystkie wkładki zostaną wysiane, przykryj naczynie i ostrożnie umieść wkładki w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po około czterech godzinach odłącz HPMC z dwoma mililitrami 0,25% trypsyny na jedną do dwóch minut, a następnie zneutralizuj reakcję za pomocą 12 mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Zebrać HPMC przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach kompletnej pożywki wzrostowej do liczenia.

Rozcieńczyć komórki do 300 000 HPMC na mililitr kompletnej pożywki wzrostowej i dodać 2,5 mililitra świeżej kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki hodowlanej. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść każdą wkładkę prawą stroną do góry w każdym dołku sześciodołkowej płytki, tak aby dolne powierzchnie przyłączone do komórek raka jajnika były zanurzone w pożywce. Następnie zasiej 1,5 mililitra HPMC do dołka każdej wkładki.

Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 72 godziny. Pod koniec inkubacji ostrożnie wyjmij wkładki z każdej studzienki i przepłucz obie strony wkładek PBS. Umieść każdą wkładkę w nowej sześciodołkowej płytce i dodaj 0,5 mililitra trypsyny do dołków wkładanych i dwa mililitry trypsyny do dołków dolnych.

Po dwóch minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki wzrostowej do każdej wkładki i ostrożnie odpipetuj roztwór kilka razy, nie rozrywając membrany ani nie rozlewając zawiesiny komórek do studzienki poniżej. Podczas pipetowania należy zwrócić uwagę na to, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia krzyżowego komórek z jednej komory z innymi. Przenieś zawieszone komórki do oznakowanej probówki zbiorczej i dalej neutralizuj trypsynę za pomocą dodatkowych dwóch mililitrów kompletnej pożywki wzrostowej.

Aby zebrać komórki na dnie wkładek, przepłucz dna membran dwa do trzech razy dwoma mililitrami trypsyny z odpowiedniego dołka płytki sześciodołkowej, tak aby oderwane komórki zostały złapane w odpowiednie dna studzienki. Gdy wszystkie komórki zostaną odłączone, zneutralizuj trypsynę w każdym dołku za pomocą sześciu mililitrów świeżej pożywki wzrostowej i przenieś zawiesiny komórek do oznakowanych probówek zbiorczych. Następnie zbierz wszystkie komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w 0,7 mililitra odczynnika do lizy na bazie tiocyjanianu fenolu i guanidyny na probówkę w celu ekstrakcji i izolacji RNA zgodnie ze standardowymi protokołami.

Bliższa hodowla HPMC z komórkami raka jajnika powoduje zwiększoną ekspresję fibronektyny i transformującego czynnika wzrostu lub TGF beta jeden w porównaniu z kontrolnym HPMC wysiewanym na insertach przy braku komórek rakowych. Ekspresja zarówno fibronektyny, jak i TGF beta również znacznie wzrasta w komórkach raka jajnika po bliższym posiewie z HPMC w porównaniu z kontrolnymi komórkami jajnika hodowanymi pod nieobecność HPMC. I odwrotnie, komórki raka jajnika leczone pożywką kondycjonowaną HPMC wykazują znacznie zmniejszoną ekspresję fibronektyny bez zmiany ekspresji TGF beta one.

Blokowanie TGF beta one za pomocą przeciwciała neutralizującego powoduje jednak znaczny spadek ekspresji TGF beta one w komórkach raka jajnika w bliższej hodowli z HPMC. Co ciekawe, niewielki wzrost ekspresji TGF beta one obserwuje się w kontrolnych komórkach raka jajnika hodowanych nieproksymalnie, prawdopodobnie jako odpowiedź kompensacyjną. Posiew proksymalny z komórkami raka jajnika nieznacznie zwiększa ekspresję E-kadheryny w HPMC, podczas gdy obserwuje się wyraźny spadek E-kadheryny w komórkach raka jajnika hodowanych w pobliżu HPMC w porównaniu z grupą kontrolną, co dodatkowo dowodzi skuteczności systemu hodowli proksymalnej w badaniu sygnalizacji parakrynnej między komórkami raka jajnika a normalnymi komórkami w miejscu przerzutów.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby zoptymalizować liczbę wysianych komórek i czas trwania hodowli proksymalnej. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunoblotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące zmian w ekspresji białek i aktywacji szlaków sygnałowych dalszego przetwarzania podczas kohodowli komórek międzybłonka komórek nowotworowych. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrośrodowiskiem nowotworów, immunologią i biologią rozwojową do badania wzajemnych interakcji parakrynnych między komórkami za pośrednictwem wydzielanych czynników.