Name: Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in vivo do dostarczania genów do neuronów DRG dorosłej myszy w celu badania regeneracji aksonów. Technika umożliwia manipulację ekspresją genów i obrazowanie regeneracji nerwów obwodowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie zostało sfinansowane (przyznane F-Q.Z.) przez NIH (R01NS064288, R01NS085176, R01GM111514, R01EY027347), Fundację Craiga H. Neilsena oraz Fundację BrightFocus.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez Johns Hopkins Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Materiały i odczynniki
<ol>
	<li>zwierzęta
	<ol>
		<li>Do eksperymentów użyj sześciotygodniowych samic myszy CF1 o wadze 30–35 g. 
		UWAGA: Myszy były trzymane w grupach (5 myszy w klatce) w indywidualnie wentylowanych, sterylizowanych klatkach z 1/4 "kolb kukurydzy i 2" kwadratowych gniazdach do gniazdowania. Klatki utrzymywano w kontrolowanym 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym, a temperatura w pomieszczeniu wynosiła od 19,4 °C do 25 °C. Myszy były karmione globalną dietą gryzoni i automatycznym systemem dostarczania wody. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instrumentów
	<ol>
		<li>Do sprawnego przeprowadzenia operacji należy użyć następujących narzędzi chirurgicznych: jednorazowe strzykawki (27 G, 1,0 ml) do wstrzykiwań dootrzewnowych, maszynka do strzyżenia futra, mikroskop stereoskopowy, kleszcze do mikrooperacji, nożyczki do mikrochirurgii oraz małe kości i sterylizowane gąbki włókninowe. 
		UWAGA: Wszystkie narzędzia i materiały są sterylizowane w autoklawie przed zabiegiem lub wstępnie sterylizowane przez producentów. Podczas operacji narzędzia są spryskiwane 75% alkoholem, aby utrzymać sterylizację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory anestezjologiczne
	<ol>
		<li>Użyj roztworu znieczulającego #1, aby wywołać znieczulenie i użyj roztworu znieczulającego #2 przed wstrzyknięciem DRG, aby utrzymać znieczulenie.
		<ol>
			<li>Aby przygotować roztwór znieczulający #1, rozcieńczyć ketaminę i ksylazynę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej w końcowym stężeniu 10 mg/ml i 1,2 mg/ml.</li>
			<li>Aby przygotować roztwór znieczulający #2, rozcieńczyć awertynę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej o końcowym stężeniu 20 mg/ml.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plazmid DNA i oligonukleotydy RNA
	<ol>
		<li>Przygotuj plazmidy za pomocą zestawu komercyjnego, postępując zgodnie z protokołami producenta. Rozcieńczyć plazmidowe DNA w sterylnej wodzie dejonizowanej do stężenia 2,0 μg/μL.</li>
		<li>Dodaj roztwór barwnika Fast Green, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,005–0,01% (v/v) w celu lepszej wizualizacji konturu DRG podczas wstrzykiwania.</li>
		<li>Rozpuścić oligonukleotydy siRNA lub mikroRNA w odpowiednich dostarczonych przez producentów, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pipeta do mikroiniekcji
	<ol>
		<li>Pociągnij szklankę kapilarną za pomocą ściągacza do mikropipet i odetnij końcówkę wyciągniętej szklanej pipety kapilarnej nożyczkami mikrochirurgicznymi, aby uzyskać otwór o średnicy zewnętrznej około 50 μm. Następnie sterylizuj szklaną pipetę w świetle UV na czystej ławce przez około 20–30 minut.</li>
		<li>Zamontuj wysterylizowaną szklaną pipetę na uchwycie pipety podłączonym do wewnątrzkomórkowego systemu dozowania mikroiniekcji. Ustaw parametry systemu mikroiniekcji na ciśnienie 30 psi i czas trwania 8 ms.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>System elektroporacji
	<ol>
		<li>Podłącz elektrody do systemu elektroporacji fali prostokątnej i ustaw następujące parametry: impulsy 15 ms przy 35 V w odstępach 950 ms dla elektroporacji in vivo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór do perfuzji i utrwalania
	<ol>
		<li>Rozpuść proszek paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS w stężeniu 4% (w/v). Przechowywać roztwór PFA w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedury eksperymentalne
<ol>
	<li>Chirurgiczne narażenie DRG L4 i L5
	<ol>
		<li>Znieczulić mysz za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia przygotowanego wcześniej roztworu znieczulającego #1 (z ketaminą 100 mg/kg masy ciała i ksylazyną 12 mg/kg masy ciała).</li>
		<li>Ogol obszar operacyjny maszynką do strzyżenia futra. 
		UWAGA: Ponieważ będzie miała miejsce kolejna operacja zmiażdżenia lewego nerwu kulszowego, futro lewej tylnej części uda można ogolić jednocześnie.</li>
		<li>Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) i monitoruj temperaturę w odbycie za pomocą sondy temperatury.</li>
		<li>Aby przetestować znieczulenie, uszczypnij palce u nóg i ogon myszy i obserwuj reakcje behawioralne.</li>
		<li>Przyklej cztery kończyny myszy do tablicy korkowej.</li>
		<li>Przetrzyj obszar chirurgiczny roztworem jodoforu, a następnie 75% alkoholem, aby usunąć jodofor przed przecięciem skóry.</li>
		<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Przed nacięciem zaznacz obie strony grzebieni biodrowych cienkim markerem. Narysuj linię łączącą dwa punkty grzbietów biodrowych, aby ułatwić identyfikację pozycji DRG L5.</li>
		<li>Wykonaj 3 cm nacięcie wzdłuż linii środkowej dolnej części pleców za pomocą mikronożyczek. Ponadto odłącz mięśnie przykolcowe, takie jak mięsień wielodzielny i mięsień najdłuższy lędźwiowy, od wyrostków kolczystych L3 do S1 i odsłoń stawy międzywyrostkowe L4-5 i L5-6.</li>
		<li>Użyj mikro-rongeur, aby usunąć stawy międzywyrostkowe L4-5 i L5-6. Ponadto usuń lewy łuk nerwowy L4 i L5, aby odsłonić grzbietową stronę DRG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtrysk DRG
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć roztwór znieczulający #2 (z avertyną 200 mg/kg masy ciała) dootrzewnowo w celu podtrzymania znieczulenia przed wstrzyknięciem DRG.</li>
		<li>Załaduj plazmidy DNA lub oligonukleotydy RNA (1 μl na DRG) do szklanej pipety kapilarnej.</li>
		<li>Ostrożnie włóż końcówkę szklanej pipety kapilarnej do DRG.</li>
		<li>Stopniowo wstrzykiwać 1,0 μl roztworu plazmidów DNA lub oligonukleotydów RNA do DRG za pomocą wewnątrzkomórkowych systemów dozowania mikroiniekcji (30 psi, 8 ms). 
		UWAGA: Czas trwania wstrzyknięcia nie powinien trwać krócej niż 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroporacja
	<ol>
		<li>Upuść PBS na końcówki elektrod.</li>
		<li>Oczyść krwawienie za pomocą wysterylizowanej kwadratowej gazy bawełnianej.</li>
		<li>Delikatnie ściśnij docelowy DRG elektrodami i zastosuj 5 kwadratowych impulsów elektrycznych za pomocą systemu elektroporacji.</li>
		<li>Zamknij odpowiednio warstwy mięśni i skóry za pomocą nylonowych szwów 5-0.</li>
		<li>Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) pod ścisłą uwagą, aż całkowicie odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia. 
		UWAGA: Mysz potrzebuje około 60 minut, aby całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia na kocu o temperaturze 37 °C. Rozpuść jedną tabletkę (200 mg) ibuprofenu w 1000 ml wody (0,2 mg/ml) do codziennego karmienia, aby złagodzić ból pooperacyjny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmiażdżenie nerwu kulszowego
	<ol>
		<li>Dwa lub trzy dni (w zależności od projektu eksperymentalnego) po elektroporacji DRG znieczulić mysz dootrzewnowo roztworem znieczulającym #2 (z avertyną 400 mg/kg masy ciała).</li>
		<li>Przyklej cztery kończyny myszy do tablicy korkowej.</li>
		<li>Wykonaj 1 cm nacięcie 0,5 cm w lewo wzdłuż linii środkowej. Przetnij mięśnie, takie jak mięsień pośladkowy wielki i mięsień gruszkowaty, podłużnie. Odsłoń odcinek nerwu kulszowego między większym otworem kulszowym a wcięciem kulszowym.</li>
		<li>Zmiażdż nerw kleszczami mikrochirurgicznymi przez 12 s i oznacz miejsce zmiażdżenia nylonowym szwem epineuralnym 10-0. Zrób węzeł na membranie opony twardej, aby zaznaczyć miejsce zgniecenia.</li>
		<li>Zamknij warstwy mięśni i skóry za pomocą nylonowego szwu 5-0.</li>
		<li>Umieść mysz na podgrzewanym kocu (35.0 °C) ze szczególną uwagą, aż całkowicie odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej po całkowitym wyzdrowieniu ze znieczulenia. 
		UWAGA: Mysz potrzebuje około 60 minut, aby całkowicie wyzdrowieć ze znieczulenia na kocu o temperaturze 37 °C. Rozpuść jedną tabletkę (200 mg) ibuprofenu w 1000 ml wody (0,2 mg/ml) do codziennego karmienia, aby złagodzić ból pooperacyjny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja myszy, DRG i zbiór nerwu kulszowego
	<ol>
		<li>Dwa lub trzy dni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego (w zależności od projektu eksperymentalnego) znieczulenie myszy dootrzewnowo roztworem znieczulającym #2.</li>
		<li>Perfuzję myszy przezsercowo z PBS (pH 7,4), a następnie lodowato zimnym 4% paraformaldehydem (PFA) (pH 7,5) w PBS.</li>
		<li>Po perfuzji ostrożnie oddziel DRG wraz z korzeniami nerwowymi i nerwem kulszowym przed kolanem za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść nerw kulszowy bezpośrednio w 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie i pomiar znakowanych fluorescencyjnie aksonów czuciowych
	<ol>
		<li>Usuń przyczepioną tkankę i błonę na stałym nerwie kulszowym za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczy ostrożnie pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie zamień 4% PFA na PBS i trzykrotnie umyj nerw.</li>
		<li>Umieść nerw kulszowy na szkiełku i trzymaj go prosto. Dodaj 80 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu wokół nerwu, a następnie połóż na nim szkiełko nakrywkowe. Spłaszcz całą zamontowaną tkankę pod naciskiem.</li>
		<li>Umieść spłaszczone tkanki na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w akcesorium do akwizycji mozaiki i przetwarzania obrazu. 
		UWAGA: Długości wzbudzenia i emisji wynoszą 488 nm i 509 nm. Możliwe jest również ręczne wykonanie wielu nakładających się obrazów i zszycie obrazów za pomocą ImageJ z wtyczką Mosaic.</li>
		<li>Mierząc długość zregenerowanych aksonów, prześledź wszystkie możliwe do zidentyfikowania fluorescencyjnie znakowane aksony w nerwie kulszowym od miejsca zmiażdżenia (oznaczonego szwem epineuralnym 10-0) do dystalnych końców aksonu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Saijilafu,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-GSK3+signalling+regulates+mammalian+axon+regeneration+by+inducing+the+expression+of+Smad1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PI3K-GSK3 signalling regulates mammalian axon regeneration by inducing the expression of Smad1.</a> Nature Communications. 4, 2690(2013).</li>
<li>Zhang, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt-independent+GSK3+inactivation+downstream+of+PI3K+signaling+regulates+mammalian+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt-independent GSK3 inactivation downstream of PI3K signaling regulates mammalian axon regeneration.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (2), 743-748 (2014).</li>
<li>Jiang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+supports+mammalian+axon+regeneration+in+vivo+by+suppressing+GSK3beta+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a supports mammalian axon regeneration in vivo by suppressing GSK3beta expression.</a> Cell Death & Disease. 6, 1865(2015).</li>
<li>Krames, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+dorsal+root+ganglion+in+the+development+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of the dorsal root ganglion in the development of neuropathic pain.</a> Pain Medicine. 15 (10), 1669-1685 (2014).</li>
<li>Salimzadeh, L., Jaberipour, M., Hosseini, A., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+transfection+methods+optimized+for+gene+delivery+to+a+lung+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+Journal+of+Medical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Non-viral transfection methods optimized for gene delivery to a lung cancer cell line.</a> Avicenna Journal of Medical Biotechnology. 5 (2), 68-77 (2013).</li>
<li>Keeler, A. M., ElMallah, M. K., Flotte, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+2017%3A+Progress+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy 2017: Progress and Future Directions.</a> Clinical and Translational Science. 10 (4), 242-248 (2017).</li>
<li>Neumann, E., Schaeferridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Transfer+into+Mouse+Lyoma+Cells+by+Electroporation+in+High+Electric-Fields%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Gene-Transfer into Mouse Lyoma Cells by Electroporation in High Electric-Fields.</a> The EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).</li>
<li>Liu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-138+and+SIRT1+form+a+mutual+negative+feedback+loop+to+regulate+mammalian+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-138 and SIRT1 form a mutual negative feedback loop to regulate mammalian axon regeneration.</a> Genes & Development. 27 (13), 1473-1483 (2013).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+axon+regeneration+via+in+vivo+electroporation+of+adult+mouse+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons.</a> Nature Communications. 2, 543(2011).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13, 859(2016).</li>
<li>Rao, R. D., Bagaria, V. B., Cooley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterolateral+intertransverse+lumbar+fusion+in+a+mouse+model%3A+surgical+anatomy+and+operative+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Posterolateral intertransverse lumbar fusion in a mouse model: surgical anatomy and operative technique.</a> Spine Journal. 7 (1), 61-67 (2007).</li>
<li>Dommisse, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood+supply+of+the+spinal+cord.+A+critical+vascular+zone+in+spinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery.+British+Volume%22%5BJournal%5D)">The blood supply of the spinal cord. A critical vascular zone in spinal surgery.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 56 (2), 225-235 (1974).</li>
<li>Sorensen, D. R., Leirdal, M., Sioud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Systemic+Delivery+of+Synthetic+siRNAs+in+Adult+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Systemic Delivery of Synthetic siRNAs in Adult Mice.</a> Journal of Molecular Biology. 327 (4), 761-766 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Szczególnej uwagi wymaga kilka etapów chirurgicznych. L4 i L5 DRG (lokalizacja somy), które dominują w nerwie kulszowym, muszą być prawidłowo zidentyfikowane i wstrzyknięte za pomocą konstruktów genów. W przeciwnym razie znakowanie GFP będzie nieobecne w aksonach nerwu kulszowego. Grzebienie biodrowe mogą być postrzegane jako przydatne anatomiczne punkty orientacyjne do określenia DRG L4 i L5. U większości myszy staw międzywyrostkowy między kręgami L5 i L6 znajduje się w pobliżu grzebieni biodrowych12</...

Urazy w układzie nerwowym spowodowane urazami nerwowymi lub różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi zwykle powodują defekty w funkcjach motorycznych, czuciowych i poznawczych. Ostatnio wiele wysiłku poświęcono przywróceniu potencji regeneracyjnej w dorosłych neuronach w celu przywrócenia funkcji fizjologicznych uszkodzonych neuronów1,2,3. Neurony czuciowe w DRG to skupisko komórek nerwowych, które przekazują do mózgu różne bodźce sensoryczne, takie jak ból, temperatura, dotyk lub postawa ciała. Każdy z tych neuronów jest pseudo-jednobiegunowy i zawiera pojedynczy akson, który rozgałęzia się z jedną gałęzią rozciągającą się w kierunku obwodu, a drugą gałęzią skierowaną w stronę rdzenia kręgowego4. Dorosłe neurony czuciowe w DRG są jednymi z niewielu dojrzałych neuronów ssaków, o których wiadomo, że aktywnie regenerują swoje aksony po urazie. W związku z tym uszkodzenia aksonów czuciowych są szeroko stosowane jako kluczowy model do badania mechanizmów regeneracji aksonów in vivo.
Techniki transfekcji genów in vivo, które zazwyczaj są mniej czasochłonne do skonfigurowania i bardziej elastyczne niż przy użyciu zwierząt transgenicznych, odgrywają istotną rolę w badaniu funkcji genów i szlaków sygnałowych w układzie nerwowym. Główne techniki można podzielić na dwa podejścia: oparte na instrumentach i oparte na wirusach5. Wirusowe dostarczanie genów in vivo do dorosłych neuronów może zapewnić precyzyjną czasoprzestrzenną manipulację ekspresją genów6. Jednak w metodach opartych na wirusach, takich jak produkcja i oczyszczanie cząstek wirusowych zawierających pożądany gen, zaangażowane są procesy pracochłonne. Ponadto wiele wektorów wirusowych może aktywować układ odpornościowy gospodarza, co może zakłócać pozyskiwanie danych, analizę danych i potencjalnie wprowadzać w błąd interpretację wyników eksperymentalnych. Elektroporacja, typowe podejście do transfekcji oparte na instrumentach, wykorzystuje impuls elektryczny w celu przejściowego zwiększenia przepuszczalności błon komórkowych i jądrowych, co sprzyja napływowi wektorów genów lub małych oligonukleotydów RNA z przestrzeni poza komórkami7. Elektroporacja in vitro jest powszechnie uznawana za przejściową, ale bardzo skuteczną strategię manipulowania docelową ekspresją genów w wielu typach komórek. Chociaż elektroporacja in vivo prowadzi tylko do przejściowej ekspresji genów o niskiej skuteczności transfekcji w porównaniu z wektorami wirusowymi, ma ona różne zalety w porównaniu z podejściami wirusowymi. Na przykład, może być stosowany do prawie wszystkich tkanek i komórek7,8,9. Ponadto do tkanki docelowej można wstrzyknąć bezpośrednio do tkanki docelowej plazmidy kodujące interesujące geny lub małe oligonukleotydy RNA (np. siRNA, mikroRNA) przeciwko określonym transkryptom, a następnie impulsować elektrycznie, co sprawia, że procedura jest mniej pracochłonna i czasochłonna. Co więcej, możliwa jest jednoczesna transfekcja wielu plazmidów i oligonukleotydów RNA za pomocą pojedynczej elektroporacji.
Ustaliliśmy metodę elektroporacji in vivo do manipulowania ekspresją genów w neuronach czuciowych dorosłych myszy i z powodzeniem zastosowaliśmy i zatwierdziliśmy takie podejście w licznych pionierskich badaniach1,2,3,8,10. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, który ma ułatwić zastosowanie tego podejścia w przyszłych badaniach nad regeneracją aksonów ssaków.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 System elektroporacji fal prostokątnych</td><td>Aparat BTX Harvard</td><td>45-0052</td><td>Do elektroporacji in vivo</td></tr><tr><td>Elektrody pęsetowe Aparat</td><td>BTX Harvard</td><td>45-0524</td><td>Do elektroporacji in vivo, płaski 1 mm</td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Instrumentation</td><td>1096</td><td>Wewnątrzkomórkowe systemy</td></tr> <tr><td>dozowania mikroiniekcjiŚciągacz do kapilar szklanych</td><td>NARISHIGE</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td>1902328</tr><tr><td>Stereo mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Mikrochirurgia Rongeur</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze mikrochirurgiczne</td><td>FST firmy DUMONT, Szwajcaria</td><td>11255-20</td><td>Tylko do zmiażdżenia nerwu kulszowego</td></tr><tr><td>Glass Capillary</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-4</td><td>10 cm, standardowa taśma ścienna</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>15-901-30</td><td>Do mocowania myszy na tablicy korkowej</td></tr><tr><td>2, 2, 2-Tribromoetanol (Avertin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>Avertin roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Avertin roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>siRNA Fluorescencyjna uniwersalna kontrola negatywna #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC003</td><td>Niedocelowe siRNA z fluorescencyjną</td></tr><tr><td>mikroRNA Naśladująca kontrola transfekcji za pomocą Dy547</td><td>Dharmacon</td><td>CP-004500-01-05</td> Zestaw do przygotowania <td>mikroRNA niedocelowego z fluorescencyjną</td></tr><tr><td>plazmidą</td><td>Invitrogen Purelink</td><td>K210016</td><td>Preparat plazmidowy kodujący GFP</td></tr><tr><td>Fast Green Dye</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7252</td><td>Dla lepszej wizualizacji konturu DRG podczas wstrzykiwania</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-731-51</td><td>Indukcja znieczulenia</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Indukcja znieczulenia</td></tr><tr><td>Paracetamol</td><td>McNeil Consumer Healthcare</td><td>NDC 50580-449-36</td><td>Ulga w bólu pooperacyjnym</td></tr></tbody></table>

badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Elektroporacja jest niezbędnym niewirusowym podejściem do transfekcji genów w celu wprowadzenia plazmidów DNA lub małych cząsteczek RNA do komórek. Neuron czuciowy w zwoju korzenia grzbietowego (DRG) rozciąga pojedynczy akson za pomocą dwóch gałęzi. Jedna gałąź przechodzi do nerwu obwodowego (gałąź obwodowa), a druga gałąź wchodzi do rdzenia kręgowego przez korzeń grzbietowy (gałąź centralna). Po uszkodzeniu układu nerwowego gałąź obwodowa silnie się regeneruje, podczas gdy gałąź centralna nie ulega regeneracji. Ze względu na wysoką zdolność regeneracyjną, czuciowa regeneracja aksonów jest szeroko stosowana jako system modelowy do badania regeneracji aksonów ssaków zarówno w obwodowym układzie nerwowym (PNS), jak i ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W tym miejscu opisujemy wcześniej ustalony protokół podejścia do manipulowania ekspresją genów w dojrzałych neuronach czuciowych in vivo za pomocą elektroporacji. Podejście to, oparte na transfekcji plazmidami lub małymi oligonukleotydami RNA (siRNA lub mikroRNA), pozwala na przeprowadzenie eksperymentów zarówno dotyczących utraty, jak i wzmocnienia funkcji w celu zbadania roli genów będących przedmiotem zainteresowania lub mikroRNA w regulacji regeneracji aksonów in vivo. Ponadto manipulacja ekspresją genów in vivo może być kontrolowana zarówno przestrzennie, jak i czasowo w stosunkowo krótkim czasie. Ten model systemowy stanowi unikalne narzędzie do badania mechanizmów molekularnych, za pomocą których regeneracja aksonów ssaków jest regulowana in vivo.

Aby określić cytotoksyczność zastosowanego protokołu oraz potwierdzić, że stopień transfekcji podczas elektroporacji zwojów korzeni grzbietowych (in vivo DRG) jest wystarczająco wysoki, wstrzyknięto i poddano elektroporacji mikroRNA lub siRNA znakowane fluorescencyjnie w DRG L4 i L5. Wypreparowane DRG poddano kriosekcjonowaniu oraz immunohistochemii (Rycina 1A-B). W celu oszacowania przeżywalności komórek po wtryśnięciu i elektropora...

Elektroporacja to skuteczne podejście do dostarczania interesujących genów do komórek. Stosując to podejście in vivo na neuronach zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy (DRG), opisujemy model do badania regeneracji aksonów in vivo.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Metoda ta zapewnia technikę transfekcji genów in vivo do manipulowania ekspresją genów w neuronach czuciowych dorosłych myszy na potrzeby przyszłych badań nad egzoregeneracją ssaków. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest mniej pracochłonna i czasochłonna, a także może zarówno nadekspresji, jak i powalać docelowe geny jednocześnie i osobno. Aby rozpocząć tę procedurę, zaznacz obie strony grzebienia biodrowego znieczulonej myszy cienkim markerem.Narysuj linię łączącą dwa punkty grzbietu biodrowego, aby ułatwić identyfikację pozycji L5 DRG. Następnie wykonaj trzycentymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej dolnej części pleców za pomocą mikronożyczek. Następnie odłącz mięśnie przykolcowe, takie jak mięsień wielodzielny i mięsień najdłuższy lędźwiowy, od wyrostków kolczystych L3 do S1 i odsłoń staw powięziowy L4-5 i L5-6.Następnie użyj mikro rongeur, aby usunąć stawy powięziowe L4-5 i L5-6. Następnie usuń lewy łuk nerwowy L4 i L5, aby odsłonić grzbietową stronę DRG. W celu wstrzyknięcia DRG należy załadować plazmidy DNA lub oligonukleotydy RNA do szklanej pipety kapilarnej.Następnie ostrożnie włóż końcówkę szklanej pipety kapilarnej do DRG i stopniowo wstrzykuj jeden mikrolitrowy roztwór plazmidów DNA lub oligonukleotydów RNA za pomocą wewnątrzkomórkowego systemu dozowania mikroiniekcji. W celu elektroporacji delikatnie ściśnij docelowy DRG elektrodami i zastosuj pięć kwadratowych impulsów elektrycznych za pomocą systemu elektroporacji. Następnie zamknij mięsień, a następnie warstwy skóry za pomocą nylonowych szwów.Dwa lub trzy dni po elektroporacji DRG znieczulij mysz dootrzewnowo, przyklej jej kończyny do tablicy korkowej i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie 0,5 centymetra po lewej stronie wzdłuż linii środkowej. Następnie przetnij mięśnie, takie jak mięsień pośladkowy wielki i mięsień gruszkowaty, podłużnie. Następnie odsłoń odcinek nerwu kulszowego między większym otworem kulszowym a wcięciem kulszowym.Zmiażdż nerw kleszczami mikrochirurgicznymi przez 12 sekund i zaznacz miejsce zmiażdżenia nylonowym szwem epinalnym. Następnie zamknij warstwy mięśni i skóry nylonowym szwem. Po obfitości oddziel DRG wraz z korzeniami nerwowymi i nerwem kulszowym, ostrożnie, za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczy pod mikroskopem preparacyjnym.Następnie przenieś nerw kulszowy bezpośrednio w 4% PFA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zobrazować i zmierzyć znakowane fluorescencyjnie aksony czuciowe pod mikroskopem preparacyjnym, ostrożnie zdejmij przyczepioną tkankę i błonę na utrwalonym nerwie kulszowym za pomocą mikronożyczek i mikrokleszczyków. Następnie trzykrotnie przemyj nerw PVS.Następnie umieść nerw kulszowy na szkiełku i trzymaj go prosto. Dodaj 80 mikrolitrów roztworu zapobiegającego blaknięciu wokół nerwu, a następnie połóż na nim szkiełko nakrywkowe. Spłaszcz całą zamontowaną tkankę pod naciskiem.Następnie umieść spłaszczoną tkankę pod odwróconym mikroskopem epifluorescencyjnym, wyposażonym w akcesorium do akwizycji mozaiki i przetwarzania obrazu. Mierząc długość zregenerowanych aksonów, prześledź wszystkie możliwe do zidentyfikowania fluorescencyjnie znakowane aksony w nerwie kulszowym od miejsca zmiażdżenia do dystalnych końców aksonów. Podczas stosowania obecnej metody elektroporacji in vivo do badania regeneracji aksonów, nerw kulszowy został spłaszczony i zobrazowany.Każdy zregenerowany akson o charakterystycznej trajektorii i rozpoznawalnym dystalnym końcu aksonu można prześledzić od miejsca zgniecenia wskazanego przez węzeł szwu. Biały grot strzały, strzałka i gwiazda wskazują trzy charakterystyczne końce aksonów, z których wszystkie rozciągają się od miejsca zgniecenia. Dodatkowo DRG poddano elektropostacji plazmidami EGFP i pobrano rdzeń kręgowy.Oznaczone EGFP aksony kolumny grzbietowej w rdzeniu kręgowym zostały zobrazowane i zidentyfikowane zarówno na obrazach rzutujących podłużnych, jak i strzałkowych. Oto szczegółowy widok aksonów w kolumnie grzbietowej, a tutaj jest szczegółowy widok aksonów w strefie wejścia korzenia grzbietowego. Ten obraz przedstawia rzuty strzałkowe aksonów oznaczonych EGFP w kolumnie grzbietowej.Alternatywnie, obrazy konfokalne mogą być przetwarzane za pomocą oprogramowania do wizualizacji mikroskopowej w celu zrekonstruowania obrazu 3D. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o prawidłowym ustawieniu DRG L4 i L5 oraz o wykonaniu węzła na błonie opony twardej bez nabijania nerwu kulszowego, jednocześnie oznaczając miejsce zmiażdżenia węzłem szwowym. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regeneracją aksonów do zbadania genów wymaganych do PNS, naturalnej regeneracji aksonów lub genów, które mogą dalej promować regenerację u dorosłych myszy in vivo.

investigating-mammalian-axon-regeneration-vivo-electroporation-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonów. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji specyficznych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacji epigenetycznych histonów i DNA, które są istotne dla regeneracji uszkodzonych aksonów zarówno w obwodowym, jak i ośrodkowym układzie nerwowym.

Immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonalnym

Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Źródło: Li, Q., et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje proces regeneracji aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia. Izolowany nerw jest utrwalony i przygotowany do obrazowania, a białka fluorescencyjne ulegają ekspresji w neuronach w celu wizualizacji wzrostu aksonów. Za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego śledzi się regenerację aksonów od miejsca urazu, aby ocenić zakres...

Regeneracja aksonów w nerwie kulszowym myszy po urazie zmiażdżenia

Źródło: Cheah, M., et al. Iniekcja ganglionu korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych. J. Vis. Exp. (2017). Ten film pokazuje krok po kroku procedurę wstrzykiwania zawiesiny wirusa do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i wywoływania kontrolowanego uszkodzenia aksonów poprzez zmiażdżenie korzenia grzbietowego u znieczulonego szczura. Protokół obejmuje odsłonięcie DRG, dostarczenie wektora wirusowego stymulującego wzrost w celu...

Modelowanie regeneracji aksonów czuciowych u szczura za pomocą iniekcji zwoju korzenia grzbietowego i uszkodzenia zmiażdżenia korzenia grzbietowego

Źródło: Li, Q. et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje transfekcję neuronów DRG myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu zbadania regeneracji aksonów. Przedstawiono w nim etapy dostarczania konstruktów kwasu nukleinowego do neuronów DRG, indukowania uszkodzenia nerwu kulszowego i oceny regeneracji aksonów.

Transfekcja zwojów korzenia grzbietowego myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu wspomagania regeneracji aksonów czuciowych

Tutaj prezentujemy technikę in vivo transferu genów do komórek Schwanna (SC) w nerwie kulszowym gryzoni. Ta prosta technika jest przydatna do badania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój i utrzymanie mielinizujących się SC.

In vivo (in vivo) Transfer genów do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Prezentujemy model in vitro do oceny zdolności neuroregeneracyjnej gleju otoczającego węch (OEG) po uszkodzeniu neuronalnym. Opiera się na kokulturze aksotomijnych dorosłych neuronów zwojowych siatkówki (RGN) na monowarstwach OEG, a następnie badaniu regeneracji aksonów, poprzez analizę markerów aksonalnych i somatodendrytycznych RGN.

Współkultura aksotomizowanych neuronów zwojowych siatkówki szczura z glejem otoczki węchowej, jako model in vitro regeneracji aksonów u dorosłych

Ten artykuł opisuje protokół immunopaningu dla zwojów korzenia grzbietowego dorosłej myszy. Przylegając przeciwciała do płytek hodowlanych, możemy negatywnie selekcjonować i usuwać komórki nieneuronalne. Pokazujemy, że kultury są wzbogacone o neurony przy użyciu tego protokołu, co pozwala na dogłębne badanie reakcji neuronów na manipulację.

Wzbogacanie kultur neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy za pomocą immunopanningu

Poznaj metodę elektroporacji in vivo do dostarczania genów do neuronów DRG dorosłej myszy w celu badania regeneracji aksonów. Technika umożliwia manipulację ekspresją genów i obrazowanie regeneracji nerwów obwodowych.

Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów