Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące terapii fotodynamicznej, znanej również jako PDT. Pytania, na które można odpowiedzieć za pomocą tej metody, obejmują czas trwania inkubacji fotouczulacza lub zastosowanie różnych parametrów w eksperymencie, takich jak zmiana temperatury poprzez ogrzewanie lub chłodzenie komórek. Technika ta może ułatwić opracowanie in vitro nowych fotouczulaczy, protokołów i wskazań do PDT.

Rozpocznij od posiewu dwóch razy od 10 do czwartej komórki w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki przy użyciu sterylnej techniki przez 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia umyj komórki co najmniej dwoma mililitrami PBS i potraktuj kultury roztworami zerowym, punktowym zerowym, pięciomilimetrowym, jedno- lub dwumilimetrowym rozcieńczeniem świeżo przygotowanego 5-ALA. Następnie umieść płytkę na bloku grzewczym o temperaturze 36-37 stopni Celsjusza na 30 minut, chronionym przed światłem.

Podczas zabiegu zalecamy, aby w fazie inkubacji badacze używali bloku grzewczego w celu osiągnięcia stałej temperatury przez cały okres inkubacji. Dodatkowo zalecamy przykrycie komórek w okresie inkubacji folią aluminiową, aby zapobiec aktywacji fotouczulacza. Pod koniec inkubacji umyj komórki w każdej studzience dwoma mililitrami PBS.

I odśwież kultury za pomocą dwóch mililitrów świeżej pożywki hodowlanej do napromieniania światłem niebieskim. Przed naświetlaniem komórek rozgrzej urządzenie do niebieskiego światła przy długości fali wyjściowej 417 nanometrów przez jeden cykl 1,000 sekund i użyj fotometru do pomiaru natężenia promieniowania na powierzchni komórki, dostosowując odległość światła, aby uzyskać odpowiednie natężenie promieniowania w zależności od intensywności źródła światła. Następnie umieść komórki potraktowane 5-ALA na czarnej powierzchni pod niebieskim światłem na 1000 sekund, aby uzyskać całkowitą fluencję 10 dżuli na centymetr kwadratowy.

Podczas aktywacji fotograficznej zalecamy umieszczenie komórek na czarnej powierzchni, aby zapobiec odbiciu światła i niespójnemu dozowaniu. Pod koniec zabiegu fototerapii umyj komórki w każdej studzience dwoma mililitrami PBS i odłącz komórki jednym mililitrem 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę. Po trzech do pięciu minutach potwierdź odłączenie i dezaktywuj trypsynę za pomocą 10% FBS i PBS.

Przenieś komórki z każdej studzienki do indywidualnych pięciomililitrowych probówek przepływowych i zbierz komórki przez odwirowanie. Do każdej próbki dodać 200 mikrolitrów buforu przepływowego ze sprzężonym przeciwciałem aneksyny-V. Ponownie zawiesić komórki i umieścić probówki w inkubatorze na 20 minut, aby umożliwić związanie aneksyny-V.

Pod koniec inkubacji dodać trzy mikrolitry 7-AAD do każdej próbki i ponownie inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie przeprowadzić analizę próbki zgodnie ze standardowymi protokołami analizy cytometrii przepływowej. Po pięciu zabiegach ALA i fototerapii światłem niebieskim obserwuje się zależny od dawki wzrost apoptozy komórek. Aby obliczyć procent komórek ulegających apoptozie, dodaje się odsetek komórek w kwadrantach wysokiego aneksyny V, niskiego 7-AAD i anektyny V wysokiego, 7-AAD wysokiego.

Niespójności w długości pięciu okresów inkubacji ALA, temperaturze inkubacji lub dawce napromieniania fotoaktywacji mogą zmienić skuteczność fototerapii, powodując na przykład zależny od temperatury wzrost apoptozy. Po tej procedurze można wykonać inne techniki, w tym RTQPCR i western blot, w celu określenia, w jaki sposób PDT zmienia ekspresję genów i aktywność białek. Metoda ta pozwala naukowcom zainteresowanym terapią fotodynamiczną odkryć wpływ na komórki raka skóry i inne choroby skóry in vitro.