Izolacja 1-ATPazy F z pasożytniczego protisty Trypanosoma brucei

Ten protokół opisuje oczyszczanie F 1-ATPazy z hodowli owadów Trypanosoma brucei. W wyniku zabiegu powstaje wysoce czysty, jednorodny i aktywny kompleks odpowiedni do badań strukturalnych i enzymatycznych.

Oczyszczanie F1-ATPazy opiera się na klasycznych metodach biochemicznych, które okazały się kluczowe dla zrozumienia mechanizmu wytwarzania ATP przez inne syntazy ATP. Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza ona wysoce czysty enzym odpowiedni do określania struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub mikroskopii krioelektronowej. Chociaż protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem izolacji F1-ATPazy z trypanosomów, można go dostosować do innych źródeł, takich jak komórki tkankowe lub hodowlane, oraz do różnych patogennych protistów.

Technika ta może prowadzić do identyfikacji nowych leków stosowanych w leczeniu ciężkich chorób u ludzi. Na przykład F-ATPaza Mycobacterium tuberculosis jest uwierzytelnionym celem leku w leczeniu gruźlicy. Aby rozpocząć protokół, rozmrozić i delikatnie ponownie zawiesić pęcherzyki mitochondrialne, znane również jako mitoplasty, wcześniej wyizolowane przez hipotoniczną lizę od jednego razy 10 do 11 do dwóch razy 10 do 11 komórek procyklicznego Trypanosoma brucei w pięciu mililitrach lodowatego buforu A. Utrzymuj próbkę w chłodzie.

Następnie należy określić stężenie białka w zawiesinie za pomocą kwasu bicinchoninowego lub BCA, testu białkowego zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonać serię rozcieńczeń BSA w ultra czystej wodzie, aby skonstruować krzywą standardową. Rozcieńczyć niewielką ilość próbki od 20 do 100 razy ultra czystą wodą, aby dopasować się do zakresu norm BSA.

Po obliczeniu całkowitej ilości białka w próbce, doprowadzić stężenie białka do 16 miligramów na mililitr, rozcieńczając je dodatkowym buforem A. Następnie rozdrobnić mitoplasty na odwrócone pęcherzyki i kawałki błony przez sonikację siedem razy przez 15 sekund każdy, z całkowitą energią od 70 do 100 dżuli na impuls za pomocą mikrokońcówki o średnicy 3,9 milimetra. Podczas rozdrobnienia należy inkubować próbkę na lodzie przez 30 sekund między impulsami. Po sonikacji zawiesina może wydawać się nieco ciemniejsza.

Osadzać fragmenty membrany przez ultrawirowanie w temperaturze 54 000 g przez 16 godzin lub w temperaturze 98 000 g przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zdekantować supernatant i przystąpić do ekstrakcji chloroformem. Obliczyć objętość bufora B na podstawie całkowitej ilości wykorzystanego buforu A.

Przenieść zamrożony osad z probówki wirówkowej do homogenizatora. Zawiesić osad błon mitochondrialnych w buforze B za pomocą małego homogenizatora Dounce. Przenieś zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.

Usunąć próbkę z lodu i przechowywać próbkę wraz ze wszystkimi roztworami w temperaturze pokojowej przez pozostałe etapy. Następnie dodać chloroform nasycony dwoma trzonowymi tris dostosowanymi HCl do pH 8,5, jeden do jednego. Zamknąć szczelnie nakrętkę i energicznie potrząsać próbką dokładnie przez 20 sekund.

Natychmiast odwirować mieszaninę w temperaturze 8,400 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś górną, mętną fazę wodną do mikroprobówek o pojemności 1,6 mililitra. Dodać inhibitory proteazy do próbki, aby zastąpić inhibitory usunięte przez leczenie chloroformem.

Odwirować próbki o masie 13 000 g przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przenieść supernatant do świeżych mikroprobówek i powtórzyć wirowanie w celu usunięcia pozostałego nierozpuszczalnego materiału. Zrównoważyć pięciomililitrową kolumnę Q z anionowymiennikiem podłączoną do systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek z 50 mililitrami buforu kolumny Q przy natężeniu przepływu pięciu mililitrów na minutę, aż do ustabilizowania się absorbancji na poziomie 280 nanometrów i przewodności.

Załadować supernatant na zrównoważoną kolumnę z natężeniem przepływu jednego mililitra na minutę. Poczekaj, aż absorbancja przy 280 nanometrach ustabilizuje się w tle. Zastosuj 25-mililitrowy gradient liniowy buforu elucyjnego kolumny Q od 0% do 100% przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę i zbierz frakcje jednego mililitra.

Oznaczyć 10 mikrolitrów każdej pojedynczej frakcji odpowiadającej głównemu pikowi elucji dla aktywności hydrolitycznej ATP na mililitr mieszaniny reakcyjnej za pomocą testu ATPazy Pullmana przy pH 8,0. Połącz frakcje, które wykazują aktywność ATPazy. Zagęścić zbiorczą próbkę za pomocą ultrafiltracji membranowej przy użyciu kolumny wirowej z filtrem PES o masie cząsteczkowej 100 000 do 200 do 500 mikrolitrów.

Następnie przejdź do chromatografii wykluczania wielkości. Zrównoważyć kolumnę Superose 6 Increase podłączoną do systemu chromatografii cieczowej z co najmniej 48 mililitrami buforu SEC przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę. Zastosuj próbkę do kolumny.

Uruchom chromatografię z natężeniem przepływu 0,25 mililitra na minutę, zbierając frakcje 0,25 mililitra. Następnie uruchom 10 mikrolitrów frakcji, które odpowiadają pikom śladu absorbancji UV 280 nanometrów na SDS-PAGE. Następnie wybarwić próbki kolorem Coomassie Blue.

Oznaczyć frakcje odpowiadające pierwszemu głównemu pikowi zawierającemu pik F1 dla aktywności hydrolitycznej ATP i wrażliwości azydku za pomocą testu ATPazy Pullmana. Następnie wykonaj test BCA, aby określić stężenie białka. Na koniec utrzymuj oczyszczoną F1-ATPazę w temperaturze pokojowej i użyj jej w ciągu trzech dni po oczyszczeniu do dalszych zastosowań.

Ten profil elucji chromatografii anionowymiennej przedstawia absorbancję UV przy 280 nanometrach i stężenie chlorku sodu w buforze elucyjnym. Wybrane frakcje wydzielono na żelu SDS-PAGE i wybarwiono barwnikiem Coomassie Blue. Frakcje, które odpowiadają głównemu pikowi elucji z chromatografii anionowymiennej i zawierają ATPazę F1, zostały połączone, zagęszczone i wykorzystane jako dane wejściowe do chromatografii wykluczającej rozmiar.

Głównym zanieczyszczeniem jest dehydrogenaza dihydrolipoylowa, która wymywa się z kolumny chromatografii wykluczającej wielkość jako dyskretny pik. F1-ATPaza eluuje w pierwszym dominującym, w dużej mierze symetrycznym piku. Zabarwienie Coomassie Blue typowego wzoru pasmowego po oddzieleniu oczyszczonej F1-ATPazy za pomocą SDS-PAGE pokazuje sporadyczne słabe pasma widoczne powyżej podjednostki beta, które reprezentują podkompleksy głowicy alfa trzy beta trzy, dimery i oligomery podjednostek alfa i beta i są pozbawione jakichkolwiek zanieczyszczeń wykrywalnych przez spektrometrię mas.

Podczas wykonywania ekstrakcji chloroformem, krytycznego etapu protokołu, konieczne jest energiczne potrząśnięcie próbką i natychmiastowe przejście do odśrodkowego oddzielania fazy organicznej i wodnej. Po tej procedurze wyizolowaną F1-ATPazę można szczegółowo scharakteryzować za pomocą spektrometrii mas. Ponadto może być stosowany w testach aktywności lub w badaniach strukturalnych, samodzielnie lub w obecności różnych inhibitorów lub analogów substratów.