In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u nowonarodzonych myszy

Prezentujemy protokół obrazowania in vivo dwufotonowego do obrazowania kory mózgowej noworodków myszy. Metoda ta jest odpowiednia do analizy dynamiki rozwojowej neuronów korowych, mechanizmów molekularnych kontrolujących dynamikę neuronów oraz zmian w dynamice neuronów w modelach chorób.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii, zwłaszcza te związane z tworzeniem gniazd neuronowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że naukowcy mogą analizować zmiany morfologiczne poszczególnych neuronów u żywych nowonarodzonych myszy. Rozpocznij od znieczulonego szczeniaka po urodzeniu w piątym dniu i kontynuuj tylko w przypadku braku reakcji na test szczypania ogona.

Najpierw wysterylizuj skórę głowy, przecierając ją 70% etanolem. Następnie użyj nożyczek wysterylizowanych 70% etanolem, aby usunąć około 20 milimetrów kwadratowych skóry pokrywającej czaszkę. Następnie użyj sterylnych kleszczy i czystego bawełnianego wacika nasączonego buforem kory mózgowej, aby usunąć powięź czaszki.

Użyj końcówki ładującej, aby nałożyć klej tkankowy na naciętą powierzchnię skóry, aby zatrzymać krwawienie, unikając jednocześnie obszaru, który ma być obrazowany. Umieść szczeniaka na innej poduszce grzewczej, ustawionej na 37 stopni Celsjusza i pozwól mu dojść do siebie po znieczuleniu. Odczekaj około 30 minut, aż klej tkankowy wyschnie i stwardnieje.

Po wyschnięciu kleju tkankowego rozpocznij przygotowanie okna czaszkowego na ponownie znieczulonej myszy. Nałóż jedną kroplę buforu kory na czaszkę, a następnie użyj sterylnej żyletki, aby ostrożnie otworzyć obszar czaszki o średnicy jednego milimetra, pozostawiając oponę twardą nienaruszoną. Zastosuj bufor kory, aby powierzchnia mózgu była wilgotna.

Użyj małego kawałka gąbki żelatynowej nasączonej buforem kory mózgowej, aby zatrzymać krwawienie. Użyj świeżego kawałka, aby ścisnąć jedną stronę kraniotomii i spuścić bufor i krew z powierzchni opony twardej bez dotykania opony twardej. Jest to najbardziej krytyczny krok do przygotowania przezroczystego okna.

Opona twarda musi być nieuszkodzona, a szczoteczkę należy wyjąć z odsłoniętej opony twardej. Następnie za pomocą końcówki pipety nałóż cienką warstwę jednoprocentowej agarozy o niskiej temperaturze topnienia, rozpuszczonej w buforze kory mózgowej. Nałóż okrągły, trzymilimetrowy szklany szkiełko nakrywkowe na warstwę żelu agarozowego.

Usuń wszystkie pęcherzyki między szkiełkiem nakrywkowym a warstwą żelu agarozowego, wlewając między nie nadmiar żelu agarozowego. Za pomocą pęsety usuń nadmiar żelu wystający spod szkiełka nakrywkowego. Wymieszaj proszek cementowy i płyn cementowy.

Użyj końcówki pipety, aby nałożyć mieszaninę na czaszkę, zanim stwardnieje. Następnie przymocuj wykonany na zamówienie pręt tytanowy do kości czaszki za pomocą cementu dentystycznego. Wyrównaj tytanową listwę i szkiełko nakrywkowe równolegle, aby łatwo uchwycić obrazy.

Przykryj odsłoniętą czaszkę cementem dentystycznym. Następnie wstrzyknij podskórnie środek przeciwbólowy. Umieść szczeniaka w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę, aż cement dentystyczny zastygnie.

Aby rozpocząć obrazowanie, najpierw ustaw dwufotonową długość fali lasera. Do wzbudzenia RFP użyj długości fali 1000 nanometrów. Przetrzyj powierzchnię szkiełka nakrywkowego 70% etanolem.

Przymocuj znieczulone szczenię do tytanowej płytki na stoliku do obrazowania za pomocą tytanowego pręta. Użyj stolika goniometru, aby wyregulować głowicę tak, aby szkiełko nakrywkowe było równoległe do soczewki obiektywu. Utrzymuj temperaturę ciała szczeniaka podczas obrazowania za pomocą poduszki grzewczej ustawionej na 37 stopni Celsjusza i zmniejsz stężenie izofluranu do 0,7% do 1%Umieść stolik obrazowania pod soczewką obiektywową 20x mikroskopu dwufotonowego.

Nałóż jedną kroplę wody na szkiełko nakrywkowe. Ustaw oprogramowanie tak, aby pobierało obrazy stosu Z w odstępach co 1,4 mikrona. W przypadku obrazowania neuronów warstwy czwartej ustaw szerokość Z w zakresie od 150 do 300 mikronów, aby zobrazować całą morfologię dendrytyczną.

Użyj powolnego skanowania i uśredniania, aby uzyskać wyraźne obrazy pokazujące morfologię neuronów. Uzyskanie całej morfologii dendrytycznej zajmuje zwykle więcej niż 20 minut. Ten obraz przedstawia reprezentatywny obraz stosu Z neuronów korowych warstwy czwartej szczeniąt P5.

Strzałka wskazuje neuron, który ma być analizowany. Neurony z niewyraźnymi dendrytami powinny zostać usunięte z analizy. Ten obraz pokazuje obraz w większym powiększeniu wskazanego neuronu na poprzednim obrazie.

Niebieskie groty strzałek wskazują dendrytyczne końcówki, które zostaną cofnięte w następnym punkcie czasowym, a małe białe groty strzałek wskazują akson sąsiedniej komórki. Po 4,5 godziny końcówki dendrytyczne z niebieskimi grotami są chowane, a końcówki dendrytyczne z żółtymi grotami są wydłużone. Przedstawiono reprezentatywną rekonstrukcję morfologii dendrytów, neurony wykazujące rozłączne dendryty, jak widać tutaj, powinny być wyłączone z analiz.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby opona twarda pozostała nienaruszona podczas procesu. Korzystając z tej procedury, można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie napędu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z wzorcem aktywności neuronów w mózgu noworodka.