Name: Test tworzenia rurki HUVEC w celu oceny wpływu produktów naturalnych na angiogenezę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj test tworzenia rurki HUVEC w celu oceny wpływu ekstraktu wodnego Ruta graveolens na angiogenezę. Ta metoda pozwala badać mechanizmy formowania naczyń krwionośnych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez Fondi di Ateneo dla Luca Colucci-D'Amato i fundusze programu VALERE dla Marii Teresy Gentile oraz fundusz AIRC IG18999 dla Maurizio Bifulco.

1. Przygotowanie RGWE
<ol>
	<li>Zbieraj liście R. graveolens z roślin w miesiącach wiosenno-letnich pod nadzorem botanika. 
	nuta: W tym przypadku liście zostały zebrane w Sekcji Doświadczalnej Roślin Leczniczych w Ogrodzie Botanicznym w Neapolu, Włochy5. Roślina jest spontaniczna, wieloletnia i występuje w regionach śródziemnomorskich (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Zważ 250 g liści i drobno posiekaj je nożyczkami.</li>
	<li>Umieścić liście w kolbie stożkowej i dodać 1 l wody destylowanej do 250 g posiekanych liści i doprowadzić do wrzenia w temperaturze 110 °C przez 60 minut. Przykryć kolbę folią aluminiową, aby uniknąć nadmiernego parowania.</li>
	<li>Użyj bibuły filtracyjnej z lejkiem o średnicy 3 mm, aby oddzielić ugotowane liście od fazy ciekłej, która reprezentuje ekstrakt wodny.</li>
	<li>Przefiltruj fazę ciekłą przez filtr 0,22 μm, zbierając ją do zlewki. Przykryj zlewkę parafilmem i zamroź ekstrakt w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
	<li>Wykonaj 10 - 15 otworów igłą w parafilmie i liofilizuj ekstrakt w liofilizatorze. Należy pamiętać, że uzyskanie proszku może zająć kilka dni.</li>
	<li>Odważyć otrzymany proszek, podzielić go na porcje i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie to konieczne. Istnieje możliwość przechowywania go przez rok.</li>
	<li>Jeśli jest to konieczne do eksperymentów, należy przygotować roztwór podstawowy, rozcieńczając proszek wodą destylowaną do standardowego stężenia 50 mg/ml. Podzielić go na porcje o małej objętości (np. 1 ml). Preparat ten może być przechowywany w temperaturze -20 °C do czasu użycia, ale nie może być przechowywany w temperaturze 4 °C dłużej niż kilka dni ze względu na utlenianie cząsteczek. Unikaj zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodować HUVEC w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka: śródbłonkowe podłoże podstawowe uzupełnione 1 μg/ml hydrokortyzonu i 1 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 10% FBS i penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy 80% zlewa się, podziel komórki w stosunku 1:3 na każde przejście. Użyj komórek z dwóch do pięciu pasaży, które nie wykazują widocznych różnic w odpowiedzi na czynniki wzrostu. Po szóstym pasażu komórki starzeją się i nie tworzą rurek na zżelowanej macierzy podstawy.</li>
</ol>
3. Transfekcja
<ol>
	<li>Gdy HUVEC są w 70% zlewne, przetransfekuj je pożądanym genem.</li>
	<li>W przypadku płytki o średnicy 100 mm należy użyć 1 μg pustego wektora pCDNA3 jako kontroli i 1 μg wektora pCDNA3 zawierającego interesujący nas gen (w tym przypadku konstytutywnie aktywny MEK [caMEK]).</li>
	<li>Kompleks 1 μg DNA z 3 μl lipofektaminy 2 000, rozcieńczony zredukowaną pożywką surowicy (patrz tabela materiałów) do końcowej objętości 200 μl. Usunąć pożywkę z komórek i zastąpić ją 1 ml świeżej kompletnej pożywki; następnie dodać roztwór transfekujący do komórek. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy stężeniu 5% CO2 . Możliwe jest również stosowanie innych środków do transfekcji innych niż lipofektamina 2,000, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dodać 7 ml kompletnej świeżej pożywki 3 godziny po transfekcji, a następnie kontynuować inkubację komórek w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin przed przystąpieniem do następnych testów. Dzień po transfekcji zastąpić pożywkę świeżą, kompletną pożywką.</li>
</ol>
4. Test tworzenia probówek
<ol>
	<li>Schłodzić 96-dołkową płytkę i końcówki pipet w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę przed przygotowaniem nażelowanej podstawy.</li>
	<li>W momencie przygotowania do piwnicy należy umieścić płytkę na lodzie (0 °C) i dodać 50 μl zimnej matrycy do każdej studzienki, unikając tworzenia się pęcherzyków. Należy pamiętać, że fiolka zawierająca matrycę powinna być przechowywana na lodzie podczas zabiegu, ponieważ matryca staje się twarda w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na co najmniej 30 minut, aby umożliwić polimeryzację podłoża.</li>
	<li>W międzyczasie zbierz komórki. Umyj HUVEC 1 ml 0,25% roztworu trypsyny/0,53 mM EDTA; następnie dodać 2 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aby sprawdzić, czy warstwa komórkowa jest całkowicie rozproszona. Następnie zebrać pożywkę, w której zawieszone są komórki, i zebrać oderwane komórki przez odwirowanie w temperaturze 264 x g przez 3 minuty. Zawiesić je ponownie w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Aby policzyć komórki, dodaj 0,2 ml zawiesiny komórek do 0,5 ml PBS i 0,3 ml 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Po 5 minutach w temperaturze pokojowej policz komórki w komorze Bürkera.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w kompletnym podłożu o stężeniu 2 x 104 komórek/50 μl. Wysiać je na zżelowaną podstawkę w stężeniu 2 x 104 komórki na studzienkę i pozwól im na niej osiąść.</li>
	<li>Zwróć uwagę na liczbę komórek. Zbyt wiele lub zbyt mało komórek może nie tworzyć rurek we właściwy sposób na zżelowanej podstawie.</li>
	<li>Przygotować zwiększające się dawki RGWE (0,01, 0,1 i 1 mg/ml), rozcieńczając roztwór podstawowy w pożywce hodowlanej lub rutynie (12, 120 i 300 μg/ml), wszystko w końcowej objętości 50 μl/basenik, i dodać je do 50 μl/studzienkę zawiesiny komórek. Ostateczna objętość w każdym dołku będzie wynosić 100 μl. Przygotuj od czterech do sześciu studzienek dla każdego warunku doświadczalnego. Jako kontrolę, rozcieńczyć wodę destylowaną (nośnik) w pożywce w stosunku 1:50.</li>
	<li>Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez czas od 6 do 24 godzin.</li>
	<li>Obserwuj komórki w zakresie czasu od 6 do 24 godzin po wysiewie, używając mikroskopu z kontrastem fazowym przy powiększeniu 10X. HUVEC są w stanie utworzyć struktury podobne do probówek w ciągu 6 godzin, ale możliwe jest zaobserwowanie lepszych wyników po 12 - 18 godzinach. Sfotografuj struktury przypominające rurki na każdym dołku i wyobraź sobie średnio od trzech do pięciu losowych pól w każdym dołku.</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazu komórki można odłączyć od macierzy podstawnej i policzyć w celu oceny wpływu leczenia na liczbę komórek. Do każdego dołka usunąć pożywkę, dodać dypazę o stężeniu 24 U/ml i umieścić płytkę w temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Następnie z każdej studzienki zebrać pożywkę, w której zawieszone są komórki, i zebrać oderwane komórki przez odwirowanie przy 264 x g przez 3 minuty. Zawiesić je ponownie w 0,2 ml PBS. Aby policzyć komórki, dodaj 0,2 ml zawiesiny komórek do 0,5 ml PBS i 0,3 ml 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Po 5 minutach w temperaturze pokojowej policz komórki w komorze Bürkera.</li>
	<li>Aby określić ilościowo wyniki testu tworzenia probówek, można policzyć liczbę punktów rozgałęzień, w których łączą się co najmniej trzy probówki. Korzystając z odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, policz dla każdego pola na każdym mikrografie liczbę punktów rozgałęzień i oblicz średnią ± błędu standardowego (SE) dla każdego warunku doświadczalnego. Użyj dwustronnego testu t, aby ocenić istotność statystyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li>
<li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li>
<li>Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoids+as+prospective+compounds+for+anti-cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).</li>
<li>Gentile, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruta+graveolens+water+extract+inhibits+cell-cell+network+formation+in+human+umbilical+endothelial+cells+via+MEK-ERK1%2F2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway.</a> Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).</li>
<li>Butler, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+products+to+drugs%3A+natural+product-derived+compounds+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials.</a> Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).</li>
<li>Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+product+inhibitors+of+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Natural product inhibitors of ocular angiogenesis.</a> Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).</li>
<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li>
<li>Trung, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+for+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Science+%26+Development%22%5BJournal%5D)">In vitro models for angiogenesis.</a> Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).</li>
<li>Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">In vitro Models of Angiogenesis.</a> World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).</li>
<li>Simons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+Heart+Association+Council+on+Basic+Cardiovascular+Sciences+and+Council+on+Cardiovascular+Surgery+and+Anaesthesia.+State-of-the-Art+Methods+for+Evaluation+of+Angiogenesis+and+Tissue+Vascularisation%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).</li>
<li>DeCicco-Skinner, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+tube+formation+assay+for+the+in+vitro+study+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51312(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Związki naturalne charakteryzują się dużą różnorodnością chemiczną i specyficznością biochemiczną oraz stanowią źródło cząsteczek potencjalnie terapeutycznych. Tutaj pokazujemy, jak uzyskać ekstrakt wodny z rośliny R. graveolens i proponujemy test tworzenia probówek jako łatwą do wykonania, wiarygodną i ilościową metodę przydatną do badania wpływu RGWE na angiogenezę. Ważne jest, aby gotować liście R. graveolens przez 1 godzinę, aby mieć pewność, że uzyskasz kompletny ekstrakt wodny. Gotowanie krócej ni...

Angiogeneza to proces fizjologiczny, który prowadzi do powstania nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących i zachodzi podczas embriogenezy i wzrostu narządów. W wieku dorosłym angiogeneza jest aktywowana tylko w cyklicznym jajniku, w łożysku podczas ciąży oraz podczas gojenia i gojenia się ran. Angiogeneza zależy od zdolności komórek śródbłonka do proliferacji, różnicowania się i migracji w celu utworzenia nienaruszonej sieci naczyniowej1. Jednak w niektórych zaburzeniach, takich jak choroby zapalne, metaboliczne i reumatyczne, procesy angiogenne ulegają zmianie, a angiogeneza staje się nadmierna. Co więcej, niekontrolowane procesy angiogenne również stymulują progresję guza i przerzuty1. Z tych powodów w ostatniej dekadzie badania naukowe koncentrują się na opracowaniu nowych strategii terapeutycznych mających na celu zahamowanie nadmiernej angiogenezy w chorobach nowotworowych, ocznych, stawowych lub skóry2,3.
Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) stanowi główny cel obecnych terapii antyangiogennych4, a kilka przeciwciał monoklonalnych anty-VEGF zostało opracowanych i zsyntetyzowanych, aby zapobiec nadmiernej angiogenezie. Jednak te syntetyczne leki wykazują poważne skutki uboczne i mają niekorzystny stosunek kosztów do korzyści5,6. Dlatego konieczne jest znalezienie nowych strategii terapeutycznych w celu ograniczenia nadmiernej angiogenezy przy minimalnych skutkach ubocznych w celu uzupełnienia i połączenia z obecnie stosowanymi lekami. Te nowe leki można znaleźć wśród produktów naturalnych, które charakteryzują się dużą różnorodnością chemiczną i specyfiką biochemiczną.
W tym artykule proponujemy prostą metodę oceny wpływu RGWE na zdolność HUVEC do tworzenia kanalików na zżelowanej matrycy podstawowej in vitro5. Rzeczywiście, RGWE jest mieszaniną metabolitów wtórnych, takich jak flawonoidy i polifenole, wśród których rutyna jest głównym składnikiem5. Wiele z nich zostało już przetestowanych jako środki przeciwzapalne i wazoprotekcyjne7,8,9,10,11. Co więcej, niedawno wykazaliśmy, że RGWE, ale nie rutyna, jest w stanie hamować zdolność HUVEC do tworzenia kanalików na zżelowanej macierzy podstawowej i że zjawisko to jest pośredniczone przez szlak MEK-ERK, co wskazuje na RGWE jako potencjalne narzędzie terapeutyczne zdolne do zapobiegania nadmiernemu tworzeniu się nowych naczyń krwionośnych5.

<table><tbody><tr><td>Ogniwa HUVEC</td><td>Clontech</td><td>C2519A</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 podłoże podstawowe</td><td>Clontech</td><td>cc3156</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pojedynczych kwot - suplementy i czynniki wzrostu</td><td>clontech</td><td>cc4147</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>płytki 96-dołkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>10 ml jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Sarstedt</td><td>861,254,001</td><td></td></tr><tr><td>5 mL jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Sarstedt</td><td>861,253,001</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu; Pipeta L</td><td>Gilson</td><td>Pipetman classic</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L pipeta</td><td>Gilson</td><td>Pipetman classic</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; Pipeta L</td><td>Gilson</td><td>Pipetman classic</td><td></td></tr><tr><td>p1000 końcówki do pipet</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20-200 końcówki do pipet</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,502</td><td></td></tr><tr><td>Komora Burkera</td><td>Fortuna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blu stain</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>mill-ex 0,22 &mu; m filtry</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td>VirTis-SP Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>AirCos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Talerz 100 mm</td><td>Sarstedt</td><td>833,902</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>v79020</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Zredukowana pożywka surowicy</td></tr><tr><td>Rutyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5143-50G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Axiovert 25</td><td>Aparat Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AmScope MD500</td><td>AmScope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Thermo Scientific</td><td>D4818</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz laboratoryjny</td><td>Falc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ParaFilm</td><td>American National Can</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test tworzenia rurki huvec w celu oceny wpływu produktów naturalnych na angiogenezę

HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis

Angiogeneza to zjawisko, które obejmuje różne procesy, takie jak proliferacja komórek śródbłonka, różnicowanie i migracja, które prowadzą do tworzenia nowych naczyń krwionośnych i obejmują kilka ścieżek transdukcji sygnału. Tutaj pokazujemy, że test tworzenia probówek jest prostą metodą in vitro do oceny wpływu produktów naturalnych na angiogenezę i badania zaangażowanych mechanizmów molekularnych. W szczególności, w obecności ekstraktu wodnego z Ruta graveolens (RGWE), komórki śródbłonka nie są już w stanie tworzyć sieci komórka-komórka, a wpływ RGWE na tworzenie się rurki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) jest zniesiony przez konstytutywną aktywację MEK.

Aby ocenić wpływ RGWE na angiogenezę, przeprowadziliśmy test tworzenia cewek (tube formation assay) na żelowej macierzy błony podstawnej. Podczas hodowli na tym podłożu HUVECs tworzą struktury przypominające cewki, które wywodzą się z komórek o wydłużonym kształcie, łączących się ze sobą w sieć komórkową (Rysunek 2). Na Rysunku 3 pokazujemy, że liczba rozgałęzień w komórkach HUVECs traktowanych RGWE była znacznie niższa w porówna...

Tutaj oceniamy wpływ ekstraktu wodnego z Ruta graveolens na tworzenie sieci naczyń krwionośnych, używając testu formowania probówek na zżelowanej matrycy podstawowej.

Test tworzenia rurki HUVEC w celu oceny wpływu produktów naturalnych na angiogenezę

Angiogenesis is a phenomenon that includes different processes, such as endothelial cell proliferation, differentiation, and migration, that lead to the ...

Test tworzenia probówek to test in vitro mający na celu zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kilku etapów, które prowadzą do powstania nowych naczyń krwionośnych. Test ten pozwala zidentyfikować związki i kaskady sygnałowe związane z angiogenezą. Za pomocą jednego testu jesteśmy w stanie wykazać, że naturalny związek, taki jak RGWE, zmniejsza zdolność komórek śródbłonka do tworzenia struktury przypominającej rurkę, nie wpływa na żywotność komórek i że efekt ten zależy od aktywacji szlaku MEK/ERK. Ważne jest, aby wykonać test z odpowiednią liczbą komórek. W rzeczywistości zbyt mała lub zbyt duża liczba komórek nie mogła pozwolić na prawidłowe uformowanie jajowodów. Z tego powodu wskazane jest wykonanie wstępnego testu, aby dowiedzieć się, jaka jest prawidłowa liczba komórek. Luca Olga Pastorino, doktorantka w moim laboratorium, pokaże procedury. Po pierwsze, zbieraj liście Ruta graveolens w miesiącach wiosennych i letnich. Umieść 250 gramów posiekanych liści w stożkowej kolbie i dodaj jeden litr wody destylowanej, zagotuj i przefiltruj, jak opisano w rękopisie. Następnego dnia użyj liofilizatora do liofilizacji ekstraktu z liści. Po uzyskaniu proszku zważyć go i pod

huvec-tube-formation-assay-to-evaluate-impact-natural-products-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.<br...

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Test tworzenia cewek stosuje się do oceny aktywności naczyniowej komórek nowotworowych.

Test tworzenia rurek na Matrigelu do oceny aktywności waskulogennej komórek nowotworowych

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

Ten manuskrypt opisuje test tworzenia rurki w celu ilościowego określenia wpływu danego związku lub stanu na angiogenezę za pomocą tworzenia komórek śródbłonka w kontrolowanym środowisku.

Strategiczny test tworzenia rurki śródbłonkowej: porównanie macierzy zewnątrzkomórkowej i zredukowanej macierzy zewnątrzkomórkowej czynnika wzrostu

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Przedstawiona tutaj metoda może ocenić wpływ odczynników na angiogenezę lub przepuszczalność naczyń in vivo bez barwienia. Metoda wykorzystuje wstrzyknięcie dekstranu-FITC przez żyłę ogonową w celu uwidocznienia naczyń nowych lub nieszczelności naczyniowej.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Obecny protokół pozwala na odzyskanie struktur przypominających rurki powstałych w klasycznym teście angiogenezy in vitro, gdzie komórki, takie jak komórki trofoblastu, organizują się w struktury podobne do naczyń włosowatych na warstwie zewnątrzkomórkowej macierzy błony podstawnej. Odzyskane struktury są wykorzystywane do izolacji RNA i białek do różnych analiz biochemicznych.

Odzyskiwanie komórek trofoblastu z testu tworzenia rurki angiogenezy do analizy ekspresji markerów różnicowania

Poznaj test tworzenia rurki HUVEC w celu oceny wpływu ekstraktu wodnego Ruta graveolens na angiogenezę. Ta metoda pozwala badać mechanizmy formowania naczyń krwionośnych in vitro.

Test tworzenia rurki HUVEC w celu oceny wpływu produktów naturalnych na angiogenezę

Przeglądaj więcej filmów