Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Zbieranie kondycjonowanej pożywki wzbogaconej egzosomami z komórek hodowanych w kolbach bioreaktora i izolacja za pomocą ultrawirowania z poduszką sacharozową skutkuje przygotowaniem egzosomów o wysokiej wydajności z minimalną ilością zanieczyszczających białek lub pęcherzyków nieegzosomalnych. Użycie pojedynczej poduszki sacharozowej przygotowanej w tlenku deuteru pozwala uniknąć pracochłonnego przygotowania nieciągłego gradientu sacharozy i zmniejszyć ilość sacharozy potrzebną do osiągnięcia wymaganej gęstości. Skuteczne dostarczanie in vitro siRNA enkapsulowanych w egzosomach przygotowanych w tym protokole podkreśla potencjał tego systemu jako terapii opartej na interferencji RNA nowej generacji w raku trzustki.

Na początek hoduj komórki HEK-293 w normalnej pożywce, jak opisano w manuskrypcie. Rozbuduj komórki do czterech kolb T75 i rosnąć, aż osiągną 90% konfluencji. Aby przygotować kolbę bioreaktora, dodaj od 50 do 100 mililitrów normalnego podłoża do zbiornika pożywki kolby bioreaktora w celu zwilżenia membrany.

Zbierz wszystkie komórki HEK-293 z czterech kolb T75 i zawieś je ponownie w 15 mililitrach pożywki zubożonej w egzosomy w probówce wirówkowej. Następnie użyj 20-mililitrowej strzykawki podłączonej do igły do napełniania, aby ostrożnie dodać tę zawiesinę komórek do komory komórkowej kolby bioreaktora. Następnie napełnij zbiornik pożywki kolby bioreaktora normalnym podłożem, do 500 mililitrów, i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 przez tydzień.

Po tygodniu inkubacji usunąć całą pożywkę ze zbiornika pożywki kolby bioreaktora, wylewając ją. Za pomocą 20-mililitrowej strzykawki połączonej z igłą do napełniania, usuń całe podłoże z komory celi. Następnie dodaj od 50 do 100 mililitrów normalnej pożywki do zbiornika pożywki i 15 mililitrów świeżej pożywki zubożonej w egzosomy do komory komórkowej za pomocą 20-mililitrowej strzykawki podłączonej do igły do napełniania.

Następnie napełnij zbiornik pożywki kolby bioreaktora zwykłym medium do 500 mililitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 przez kolejny tydzień. Aby wstępnie oczyścić zebrane kondycjonowane podłoże, odwiruj je z prędkością 500 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieść supernatant do nowej probówki i wyrzucić osad. Po powtórzeniu tego etapu wirowania z odzyskanym supernatantem, ponownie odzyskać supernatant i wyrzucić osad. Następnie odwirować odzyskany supernatant w temperaturze 2000 razy g przez 15 minut i cztery stopnie Celsjusza.

Zachować supernatant i wyrzucić osad. Przefiltrować supernatant raz przez 22-mikrometrowy filtr podłączony do 20-mililitrowej strzykawki do świeżej probówki wirówkowej. Tymczasem, aby przygotować 25% roztwór sacharozy w tlenku deuteru, dokładnie odważ 1,9 grama sacharozy w uniwersalnej probówce.

Następnie dodaj tlenek deuteru, aż waga osiągnie 7,6 grama. Następnie napełnij probówkę ultrawirówkową 22,5 mililitrami wstępnie oczyszczonego, kondycjonowanego podłoża. Umieść szklaną pipetę w probówce.

Dodaj trzy mililitry roztworu sacharozy przez pipetę, tak aby roztwór utworzył oddzielną warstwę pod kondycjonowanym podłożem. Ostrożnie umieścić probówkę zawierającą kondycjonowaną warstwowo pożywkę/roztwór sacharozy w wiadrze odchylanego wirnika. Zamocuj łyżkę w wirniku.

Umieść wirnik w ultrawirówce i wiruj z prędkością 100 000 g w czterech stopniach Celsjusza przez 1,5 godziny. Zebrać dwa mililitry warstwy sacharozy z probówki, po jednym mililitrze na raz za pomocą pipety P1000, z końcówką przymocowaną do końcówki o pojemności 10 mikrolitrów, i dodać do butelki ultrawirówki zawierającej 20 mililitrów przefiltrowanego PBS do mycia. Umieść probówkę w wirniku o stałym kącie i odwiruj ją z prędkością 100 000 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 1,5 godziny.

Użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby ostrożnie usunąć supernatant. Zawiesić osad z 400 mikrolitrami przefiltrowanego PBS. Przed rozpoczęciem elektroporacji należy wstępnie schłodzić kuwetę do elektroporacji na lodzie przez 30 minut.

Wymieszaj siedem mikrogramów egzosomów z 33 mikrogramami siRNA w probówce mikrowirówkowej. Dodaj bufor kwasu cytrynowego, aby uzyskać objętość 150 mikrolitrów. Dodaj mieszaninę egzosom-siRNA do kuwety do elektroporacji za pomocą plastikowej pipety i zakręć kuwetę.

Umieść kuwetę we właściwej orientacji w uchwycie kuwety elektroporatora i obróć pokrętło elektroporatora o 180 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Wybierz żądany program i naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć elektroporację. Wyświetlacz wskaże udany impuls.

Następnie obróć koło o 180 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara i wyjmij kuwetę. Użyj plastikowej pipety, aby wyjąć próbkę z kuwety do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj probówkę na lodzie lub w lodówce przed dalszą obróbką, jeśli nie zostanie natychmiast użyta.

Aby rozpocząć usuwanie wolnego siRNA, przepuść 3,5 mililitra przefiltrowanego PBS dwukrotnie przez kolumnę chromatografii wykluczającej rozmiar, aby ją zrównoważyć. Następnie rozpuść 150 mikrolitrów elektroporowanej próbki w 350 mikrolitrach przefiltrowanego PBS i przenieś ją do kolumny SEC. Zbierz pierwszą 500-mikrolitrową frakcję wymytą z kolumny do probówki do mikrofuge i oznacz ją jako F0. Następnie dodaj 500 mikrolitrów przefiltrowanego PBS do kolumny.

Zbierz następną frakcję i oznacz ją jako F1. Powtarzać dodawanie PBS i zbieranie frakcji elucyjnych, aż do uzyskania łącznie 10 frakcji o pojemności 500 mikrolitrów lub do F9. Na koniec, aby usunąć wszelkie pozostałości próbki, należy przemyć kolumnę przefiltrowanym PBS co najmniej dwa razy, a następnie kontynuować eksperymenty, jak opisano w manuskrypcie. Analiza morfologiczna z wykorzystaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej wykazała, że egzosomy HEK-293 były sferycznymi strukturami nieco większymi niż 100 nanometrów.

Wynik ten zgadza się z wynikami analizy śledzenia nanocząstek, która wykazała również rozkład wielkości egzosomów. Co więcej, były dodatnie dla markerów egzosomalnych CD81, CD9 i CD63. Procentowy odzysk egzosomów oczyszczonych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości i procentowy odzysk siRNA obliczono zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Odzysk egzosomu po oczyszczeniu wynosił 75%Korzystając ze standardowej krzywej siRNA, obliczono, że skuteczność enkapsulacji siRNA w egzosomach wynosi około 10 do 20%Analiza jakościowa cytometrii przepływowej wychwytu in vitro egzosomów obciążonych fluorescencyjnym Atto655-siRNA wykazała, że komórki PANC-1 potraktowane egzosomami zamkniętymi w kapsułkach siRNA miały największe przesunięcie sygnału fluorescencji. Zostało to potwierdzone przez odkrycie, że komórki PANC-1 traktowane egzosomami otoczonymi siRNA odnotowały wyższy odsetek populacji z pozytywnym wynikiem dla sygnału Atto655 w porównaniu z tymi, które były traktowane niezaładowanymi egzosomami i mieszaniną siRNA. Wychwyt komórkowy siRNA był również znacznie wyższy w komórkach PANC-1 traktowanych egzosomami otoczonymi siRNA w porównaniu z tymi traktowanymi mieszaniną egzosom-siRNA, co potwierdza, że egzosomy otoczone siRNA zostały zinternalizowane przez komórki PANC-1 i że skutecznie dostarczają siRNA wewnątrzkomórkowo.

Ważne jest, aby podczas przygotowywania roztworu sacharozy bardzo dokładnie zważyć sacharozę i tlenek deuteru i zawsze używać świeżo przygotowanego roztworu sacharozy, aby uniknąć zmiany gęstości podczas przechowywania. Mikroskopię konfokalną można przeprowadzić w celu dalszej walidacji internalizacji siRNA zamkniętego w egzosomach do komórek i zbadania jego transportu wewnątrzkomórkowego po wychwycie komórkowym. Protokół ten pozwala nam ocenić specyficzny dla genu knockdown siRNA dostarczany przez egzosom i służy jako narzędzie do walidacji nowego celu w terapii przeciwnowotworowej opartej na interferencji RNA.