Name: Pierwotna hodowla komórkowa oczyszczonych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego uzyskanych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych neuronów GABA-ergicznych i glutaminergicznych z myszy szczepionych, uzyskiwaną przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Technika umożliwia badania elektrofizjologiczne i morfologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować doskonałemu wsparciu technicznemu udzielonego przez Jenny Kirsch i Anę Teichmüller w Flow Cytometry Core Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Berlin. Chcielibyśmy podziękować Jie Songowi za jego pomoc w analizie przetrwania. Chcielibyśmy również podziękować Ricie Loureiro za pomoc w uchwyceniu obrazów myszy fluorescencyjnych oraz Christianowi Ebnerowi za krytyczną lekturę protokołu. Transgeniczne szczury VGAT-Venus zostały wygenerowane przez dr Y. Yanagawę, M. Hirabayashi i Y. Kawaguchi w Narodowym Instytucie Nauk Fizjologicznych w Okazaki, Japonia, przy użyciu pCS2-Venus dostarczonej przez dr A. Miyawaki. Prace te były wspierane przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 do IV).

<ol><li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Basics of flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).</li>
<li>Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+population+identification+using+fluorescence-minus-one+controls+with+a+one-class+classifying+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3372-3378 (2014).</li>
<li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+activated+cell+sorting+%28FACS%29%3A+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
<li>Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Dependence+of+GABAergic+and+Glutamatergic+Neurons+on+Glia+for+the+Establishment+of+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission.</a> Cerebral Cortex. , (2018).</li>
<li>Uematsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+composition+of+cortical+gabaergic+neurons+revealed+in+transgenic+venus-expressing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats.</a> Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).</li>
<li>Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+targeting+of+principal+neurons+in+neocortex+and+hippocampus+of+NEX-Cre+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice.</a> Genesis. 44, 611-621 (2006).</li>
<li>Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+interactions+between+astroglial+cells+and+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture.</a> Science. 209, 809-810 (1980).</li>
<li>Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+brain+astrocytes+support+survival+of+both+NGF-dependent+and+NGF-insensitive+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones.</a> Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hippocampal+neurons%2C+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules%2C+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+both+gabaergicand+glycinergic+neurons+in+vesicular+GABA+transporter+%28VGAT%29-venus+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse.</a> Neuroscience. 164 (3), 1031-1043 (2009).</li>
<li>Höltje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+gtpasein+astrocyte+morphology+and+migratory+response+during+in+vitro+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing.</a> Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).</li>
<li>Booker, S. A., Song, J., Vida, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+from+Morphologically-+and+Neurochemically-identified+Hippocampal+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51706(2014).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Berghuis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+controls+functional+differentiation+and+microcircuit+formation+of+selectively+isolated+fast-spiking+gabaergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).</li>
<li>Liddelow, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+microglia+induce+neurotoxic+reactive+astrocytes+via+Il-1%CE%B1%2C+tnf%CE%B1%2C+and+c1q%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1α, tnfα, and c1q.</a> Nature. 541, 481-487 (2017).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal%2C+a+new+serum-free+medium+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisujemy tutaj metodę, która łączy sortowanie i hodowlę pierwotnych neuronów w celu wygenerowania oczyszczonych kultur komórek neuronalnych. Metoda ta trwa około 1 godziny dłużej niż typowy protokół pierwotnej hodowli neuronów dysocjowanych, ale pozwala na wygenerowanie setek powtórzonych kultur zawierających określone typy neuronów. Oczyszczone neurony, które mogą być hodowane w izolacji przez co najmniej 16 dni, rozszerzają aksony i dendryty i mogą wystrzeliwać powtarzalne ciągi potencjałów czynnościowych (ryc. 2 i ryc. 3). Co ważne, komórki te podlegają tym samym analizom eksperymentalnym, co zwykłe pierwotne zdysocjowane hodowle neuronów, w tym analizom elektrofizjologicznym, morfologicznym i przeżyciu. Główną korzyścią płynącą z pracy z tymi oczyszczonymi kulturami jest to, że rozwój określonych typów komórek może być badany w izolacji. Aby wspomóc rozwój oczyszczonych kultur, przedstawiamy również protokół kohodowli oczyszczonych neuronów z komórkami glejowymi. Jak wykazano wcześniej, kokulturacja oczyszczonych neuronów z komórkami glejowymi poprawia ich przeżycie, wzrost i może promować tworzenie sieci7 (ryc. 4). W związku z tym przedstawiamy tutaj kombinację metod, które powinny przyczynić się do dalszych badań nad interakcjami glej-neuron i mogą okazać się przydatne do badania rozwoju i interakcji między innymi typami komórek będących przedmiotem zainteresowania.
Badania nad kulturami oczyszczonych neuronów glutaminergicznym ujawniły fundamentalne informacje na temat sposobu, w jaki komórki glejowe wydzielają czynniki sprzyjające rozwojowi sieci neuronalnych i tworzeniu synaps 16,17,18. Ogólnie rzecz biorąc, metody oczyszczania określonych typów neuronów były z większym powodzeniem stosowane do badania rozwoju neuronów glutaminergicznego niż neuronów GABA-ergiczne. Doprowadziło to do rozbieżności w naszym zrozumieniu tego, jak rozwijają się te dwa typy komórek. Biorąc pod uwagę, że neurony GABA-ergiczne i glutaminergiczne różnią się znacznie pod względem anatomii, fizjologii i pochodzenia rozwojowego, ważne jest, abyśmy badali neurony GABA-ergiczne same w sobie, aby lepiej zrozumieć ich funkcję i fizjologię. Korzystając z przedstawionego tutaj protokołu, wcześniej zidentyfikowaliśmy ważne różnice w sposobie, w jaki neurony GABA-ergiczne i glutaminergiczne zależą od czynników wydzielanych przez glej w celu ustanowienia transmisji synaptycznej7. Publikując ten protokół, mamy nadzieję, że inni będą mogli uzyskać dalsze informacje na temat ważnych interakcji między neuronami a komórkami glejowymi.
W tym protokole opisujemy metodę sortowania komórek opartą na cytometrii przepływowej, którą zastosowaliśmy do oczyszczenia neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego z różnych transgenicznych linii gryzoni. Wenus dodatnie neurony GABAergiczne posortowano od myszy VGAT Venus13 lub szczurów8, a neurony glutaminergiczne TdTomato dodatnie posortowano z NexCre; Myszy Ai9 (wyhodowane pierwotnie z linii reporterskich NexCre9 i Ai96, patrz Turko i in., 20187). W ostatnich latach, ze względu na postęp technologiczny, wytwarzanie zwierząt transgenicznych stało się znacznie łatwiejsze. W związku z tym dostępność zwierząt wykazujących ekspresję cząsteczek fluorescencyjnych w wielu różnych typach komórek gwałtownie wzrosła. To z kolei zwiększyło wykorzystanie i możliwość zastosowania fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych. Chociaż obecnie istnieją alternatywne metody izolowania komórek będących przedmiotem zainteresowania 16,19,20, są one nieco utrudnione ze względu na ich zależność od dostępności odpowiednich przeciwciał przeciwko naturalnie występującym antygenom powierzchniowym. Ogranicza to ich wszechstronność w porównaniu z metodami sortowania komórek opartymi na fluorescencji, które można już wykorzystać do sortowania komórek od wielu specyficznych dla komórek transgenicznych zwierząt reporterowych, które są już dostępne. Niemniej jednak, po optymalizacji, metody sortowania oparte na przeciwciałach mogą być szybkie i wysokowydajne, a nawet mogą lepiej zachować anatomię komórki, umożliwiając oczyszczanie komórek z nienaruszonymi aksonami i dendrytami21. W związku z tym metody sortowania przeciwciał powinny być nadal brane pod uwagę przy podejmowaniu decyzji o strategii sortowania. Ostatecznie, rodzaj komórek będących przedmiotem zainteresowania, wiek, w którym komórki mają być sortowane, dostępność zwierząt transgenicznych lub antygenów powierzchniowych oraz liczba potrzebnych komórek będą czynnikami decydującymi o wyborze najbardziej odpowiedniej strategii sortowania.
Chociaż sortowanie komórek na podstawie fluorescencji jest prostą i powtarzalną metodą oczyszczania komórek, należy zachować ostrożność podczas niektórych etapów protokołu, aby zachować jakość komórek. Na przykład po każdym etapie wirowania ważne jest, aby upewnić się, że osad komórkowy jest ponownie zawieszony tak szybko, jak to możliwe i że komórki zostały pomyślnie odzyskane. Czasami osad komórkowy może zostać naruszony podczas usuwania supernatantu. Dlatego zaleca się, aby pomiędzy etapami wirowania sprawdzać obecność komórek pod mikroskopem, aby wykluczyć jakąkolwiek rozległą utratę komórek. Po posiewie komórek komórki powinny przylegać przez co najmniej 1 godzinę przed karmieniem. Jeśli komórki zostaną karmione zbyt wcześnie, niektóre komórki mogą zostać usunięte ze szkiełka nakrywkowego, zmniejszając w ten sposób gęstość hodowli. Po 1 godzinie w hodowli rozsądnie jest ocenić stan zdrowia komórek. Jeśli komórki nie wydają się zdrowe (przykład zdrowych komórek pokazano na rysunku 2A) lub występuje znaczna śmierć komórki, może to wskazywać na problem podczas procedury dysocjacji lub sortowania. Kolejną ważną kwestią, podczas hodowli dowolnego typu komórek, jest ostrożność podczas zarządzania pożywką do hodowli komórkowych. Pożywka NBA zawiera czerwień fenolową, która działa jako wskaźnik pH22. Jeśli podłoże stanie się zbyt żółte, oznacza to, że pH jest zbyt kwaśne; Jeśli podłoże stanie się zbyt różowe, oznacza to, że roztwór jest zbyt zasadowy. Roztwory podstawowe otwarte przez długi czas, szczególnie media podawane w stożkowe probówki, mają tendencję do stawania się z czasem bardziej zasadowe. Dlatego zaleca się sporządzanie co tydzień świeżych, kompletnych pożywek NBA i kompletnych pożywek co dwa tygodnie (podłoże buforuje się w warunkach atmosferycznych i dlatego powinno być bardziej stabilne). Biorąc pod uwagę te punkty, powinno być możliwe ustanowienie oczyszczonych kultur komórkowych w każdym laboratorium posiadającym dostęp do sprzętu do sortowania komórek i hodowli komórkowych.
W większości naszych eksperymentów wyprodukowaliśmy oczyszczone kultury z jednego zwierzęcia. Jednak podczas oczyszczania komórek do analiz biochemicznych może być konieczne zebranie wielu zwierząt w celu sortowania. Udało nam się posortować do 8 myszy embrionalnych (zwierzęta w 13. dniu zarodkowym) przy użyciu powyższego protokołu (dane nie pokazane). Jednakże, jeżeli ma zostać posortowanych więcej zwierząt, może być konieczne zwiększenie objętości zarówno roztworów papainy, jak i roztworów BSA (opisanych w krokach 2.1.1–2.1.4) w celu dostosowania do wzrostu ilości tkanek. Dodatkowo, jeśli w hodowli posieje się więcej komórek, może być wymagany częstszy harmonogram karmienia. Na początek komórki można karmić co 7 dni, usuwając 100 μl kondycjonowanej pożywki i dodając 200 μl świeżej, kompletnej pożywki NBA. Ze względu na żywotność neuronów, w przypadku sortowania większej liczby zwierząt, należy pomyśleć o zminimalizowaniu czasu sortowania tak bardzo, jak to możliwe. Często wymaga to starannej optymalizacji dalszych analiz w celu efektywnego wykorzystania oczyszczonych komórek. Rutynowo sortowaliśmy neurony myszy z szybkością 600 zdarzeń / s, do 500 000-800 000 komórek na zwierzę (dzień po urodzeniu 0-2). Odbyło się to jednak bez wyczerpującej optymalizacji prędkości i warunków sortowania. W związku z tym powinna być możliwa dalsza poprawa szybkości sortowania i wydajności.
Oczyszczone neurony potrzebują do przetrwania pożywki kondycjonowanej glejem. Wykazano to już wcześniej, hodując neurony i komórki glejowe oddzielnie, przed potraktowaniem neuronów pożywką kondycjonowaną glejowo10. W naszych eksperymentach zdecydowaliśmy się wspierać oczyszczone neurony poprzez hodowlę komórek glejowych na półprzepuszczalnych wkładkach do hodowli komórkowych, które są umieszczane wewnątrz płytki do hodowli komórkowej. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do badania białek macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzących z komórek glejowych i ich interakcji z neuronami12. Bezdotykowe, ale ciągłe wsparcie zapewniane przez tę metodę ma szereg zalet w porównaniu z oddzielną hodowlą komórek. Przede wszystkim kohodowla komórek glejowych z neuronami pozwala na ciągłą regulację i kondycjonowanie pożywki do hodowli komórkowych, co bardziej przypomina sytuację in vivo. Ponadto ciągła kohodowla komórek pozwala na potencjalną sygnalizację sprzężenia zwrotnego między neuronami a glejem, co nie jest możliwe w oddzielnych hodowlach. W naszym protokole, w razie potrzeby, metodę ciągłej kohodowli można łatwo pominąć i przeprowadzić klasyczne leczenie neuronów za pomocą pożywek kondycjonowanych glejem.
Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół ma na celu zapewnienie czytelnikowi solidnej podstawy, na której może on ustanowić własne eksperymenty z oczyszczonymi kulturami komórkowymi. Przewidujemy, że dostępność zwierząt transgenicznych i konstruktów wirusowych będzie nadal rosła w dającej się przewidzieć przyszłości. W związku z tym techniki sortowania komórek oparte na fluorescencji prawdopodobnie staną się jeszcze szerzej stosowane i wartościowe.

Sortowanie komórek to potężne narzędzie do izolowania interesujących żywych komórek z niejednorodnej mieszaniny komórek. Komórki można sortować na podstawie kryteriów rozmiaru i kształtu, a także wyrażenia markerów fluorescencyjnych1,2. Często przeciwciała sprzężone z fluoroforem są używane do oznaczania różnych typów komórek poprzez celowanie w specyficzne dla komórki antygeny powierzchniowe3,4. Alternatywnie, transgeniczne zwierzęta lub systemy dostarczania wirusów zostały zaprojektowane tak, aby wyrażały fluorofory pod specyficznymi dla komórek promotorami5,6. Historycznie rzecz biorąc, rozwój transgenicznych narzędzi i zwierząt był kosztowny i czasochłonny. W ostatnim czasie malejące koszty i mniej trudności technicznych doprowadziły do znacznego wzrostu liczby dostępnych linii reporterskich. Wraz ze wzrostem dostępności narzędzi transgenicznych i zwierząt reporterowych, powinna również rosnąć przydatność i możliwość zastosowania metod sortowania komórek opartych na fluorescencji.
Niedawno pokazaliśmy, że sortowanie komórek od zwierząt transgenicznych może być rutynowo stosowane do oczyszczania pierwotnych neuronów w ramach przygotowań do hodowli komórek7. Sortując komórki od szczurów lub myszy, byliśmy w stanie wyizolować i wyhodować neurony fluorescencyjne, które wyrażają fluorescencyjne białka reporterowe specyficznie w neuronach GABA-ergicznych lub glutaminergicznych6,8,9. Badając te oczyszczone kultury neuronów, byliśmy w stanie zidentyfikować istotną różnicę w sposobie, w jaki neurony GABA-ergiczne i glutaminergiczne zależą od czynników wydzielanych przez glej w celu ustanowienia transmisji synaptycznej7. Dodatkowo, poprzez kokulturację komórek glejowych z oczyszczonymi neuronami, byliśmy w stanie rozszerzyć wcześniejsze obserwacje wykazujące krytyczną rolę, jaką komórki glejowe odgrywają we wzroście i przetrwaniu neuronów10,11. W ten sposób, dzięki połączeniu sortowania komórek i hodowli komórek, byliśmy w stanie nie tylko zbadać rozwój określonych typów neuronów w izolacji, ale także byliśmy w stanie zbadać wpływ komórek glejowych na ich funkcję.
Prezentujemy tutaj protokół oczyszczania i hodowli neuronów GABA-ergicznych i glutaminergicznego z kory i hipokampa transgenicznych myszy lub szczurów. Przedstawiamy również metodę bezkontaktowej kohodowli oczyszczonych neuronów i komórek glejowych, zaadaptowaną z Geissler et al.12. W celu wygenerowania oczyszczonych kultur GABA-ergicznych, posortowaliśmy neurony fluorescencyjne z VGAT-Venus-A Wistar rats8 lub VGAT-Venus mice13, które selektywnie wyrażają wzmocniony wariant białka żółtej fluorescencji (Venus) w >95% korowych neuronów GABA-ergicznych. Aby wygenerować oczyszczone kultury glutaminergiczne, posortowaliśmy neurony fluorescencyjne z NexCre; Ai9 mice6,9, które wyrażają tdTomato w korowych neuronach glutaminergicznym. Cała procedura sortowania i hodowli może być przeprowadzona w ciągu 3-4 godzin i może być wykorzystana do wygenerowania setek powtórzonych kultur nadających się do analizy elektrofizjologicznej, morfologicznej i przeżywalności komórek. Metoda jest prosta, powtarzalna i może wytwarzać oczyszczone kultury neuronów, które są czyste w ponad 97% dla danego typu komórki.

<table><tbody><tr><td>Pożywka neuronalna A (NBA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888022</td><td>Bufor do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>Suplement do hodowli</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050-038</td><td>Suplement do hodowli</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antybiotyk</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>SIGMA</td><td>P1399</td><td>Powłoka nakrywkowa</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>SIGMA</td><td>P4762-1G</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>SIGMA</td><td>A3294-100G</td><td>Surowica</td></tr><tr><td>hibernacji A podłoże o niskiej fluorescencji</td><td>Brain Bits Ltd</td><td>HALF</td><td>Cell Transport Media</td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Biochrom</td><td>F0435</td><td>Bufor do hodowli glejowych</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td>Surowica</td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2163</td><td>Enzymatyczna</td></tr><tr><td>pipeta Pasteura z cienką końcówką</td><td>Neo Labs-Służy</td><td></td> <td>do rozcierania komórek</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>BD</td><td>353047</td><td>Płytka hodowlana</td></tr><tr><td>50 ml Probówki Falcon</td><td>BD</td><td>352070-15</td><td></td></tr> <tr><td>ml Probówki Falcon</td><td>BD</td><td></td><td>352096-szklane</td></tr> <tr><td>szkiełka nakrywkowe: 12 mm okrągłe</td><td>Roth</td><td>P231.1-35</td><td></td></tr> <tr><td>mm szalka Petriego</td><td>Corning</td> <td>353001-100</td><td></td></tr> <tr><td>mm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>353003-30 &mikro; m CellTrics Sito</td> komórkowe <td>sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>Do usuwania grudek komórek przed sortowaniem komórek</td></tr><tr><td>Rurki z polistyrenu okrągłodennego</td><td>BD</td><td>352054</td><td>Rurka transportowa do sortowanych komórek</td></tr><tr><td>Rurki polipropylinowe z okrągłym dnem</td><td>BD</td><td>352063</td><td>Probówka zbiorcza do posortowanych komórek</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych &ndash; 0,4 &micro; m przezroczysty PET</td><td>Falcon</td><td>353 095</td><td>Do wspólnej hodowli neuronów i gleju</td></tr><tr><td>Bardzo drobne nożyczki Bonn</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14084-08</td><td>Do usuwania leżącej na powierzchni skóry i kości myszy</td></tr><tr><td>Bardzo wąskie nożyczki</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14088-10</td><td>Do usuwania pokrywającej skórę i kości szczurów</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11242-40</td><td>Aby przytrzymać głowę na miejscu</td></tr><tr><td>Szpatułka (130 mm długości/5 mm szerokości końcówki)</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>3006.1</td><td>Aby usunąć mózg do filtrowania bibuły</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Swan-Morton</td><td>#0308</td><td>Aby mechanicznie dysocjować tkankę nerwową</td></tr><tr><td>Hemocytometr (Neubauer Imroved)</td><td>Optik Liczba</td> komórek <td>Labor-To</td> <td>zdysocjowane komórki</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne gogle górnicze (światło wzbudzające)</td><td>Biologiczny sprzęt laboratoryjny Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td><td>FHS/LS-1G</td> Aby wzbudzić gogle górnicze <td>TdTomato</td></tr><tr><td>Fluorescent (filtr emisyjny)</td><td>Biologiczny sprzęt laboratoryjny Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td><td>FHS/EF-4R2</td><td>Td Filtr emisyjny kompatybilny z pomidorami</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne gogle górnicze (światło wzbudzające)</td><td>Biologiczny sprzęt laboratoryjny Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td><td>FS / ULS-02B2</td><td>Aby wzbudzić</td></tr><tr><td>gogle górników fluorescencyjnych Wenus (filtr emisyjny)</td> <td>Biologiczny sprzęt laboratoryjny Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td> <td>FS / TEF-3GY1</td><td>Filtr emisyjny kompatybilny</td>z</tr><tr><td>Venus Mysz-Przeciwciała pierwszorzędowe anty-GFP</td><td>UC Davis</td><td>75-132</td><td>Aby wzmocnić sygnał Wenus po fiksacji</td></tr><tr><td>Mysze przeciwciała pierwszorzędowe anty-GFAP</td><td>SIGMA</td><td>G-3893</td><td>Identyfikacja reaktywnych astrocytów</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe królika anty-CD11b</td><td>Southern Biotech</td><td>1561-15</td><td>Identyfikacja komórek mikrogleju</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe królika anty-MBP</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td>Identyfikacja oligodendrocyi</td></tr></tbody></table>

pierwotna hodowla komórkowa oczyszczonych neuronów gaba-ergicznych lub glutaminergicznego uzyskanych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Ogólnym celem tego protokołu jest generowanie oczyszczonych kultur neuronalnych pochodzących z neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergiczne. Oczyszczone neurony mogą być hodowane w określonych pożywkach przez 16 dni in vitro i są podatne na wszelkie analizy zwykle wykonywane na zdysocjowanych kulturach, w tym analizy elektrofizjologiczne, morfologiczne i przeżycia. Główną zaletą tych kultur jest to, że określone typy komórek mogą być selektywnie badane przy braku złożonych wpływów zewnętrznych, takich jak te powstające z komórek glejowych lub innych typów neuronów. Planując eksperymenty z oczyszczonymi komórkami, należy jednak pamiętać, że neurony silnie zależą od pożywek kondycjonowanych glejowo, aby mogły rosnąć i przetrwać. Ponadto neurony glutaminergiczne dodatkowo zależą od czynników wydzielanych przez glej w celu ustanowienia transmisji synaptycznej. W związku z tym opisujemy również metodę kohodowli neuronów i komórek glejowych w układzie bezkontaktowym. Korzystając z tych metod, zidentyfikowaliśmy główne różnice między rozwojem GABA-ergicznych i glutaminergijnych sieci neuronalnych. W związku z tym badanie kultur oczyszczonych neuronów ma ogromny potencjał w zakresie pogłębienia naszego zrozumienia tego, jak rozwija się i funkcjonuje układ nerwowy. Co więcej, oczyszczone kultury mogą być przydatne do badania bezpośredniego działania czynników farmakologicznych, czynników wzrostu lub do badania konsekwencji manipulacji genetycznych na określone typy komórek. W miarę jak coraz więcej zwierząt transgenicznych staje się dostępnych, oznaczając dodatkowe specyficzne typy komórek będących przedmiotem zainteresowania, spodziewamy się, że opisane tutaj protokoły będą miały coraz większe zastosowanie i potencjał.

Dysocjację oraz sortowanie komórkowe fluorescencyjnych neuronów z tkanki kory i hipokampa transgenicznych myszy lub szczurów można przeprowadzić w około 3–4 h. Wynikiem jest populacja wysoko oczyszczonych fluorescencyjnych neuronów, które mogą być hodowane w kulturze przez 16 dni.
W celu uzyskania oczyszczonych kultur, w pierwszej kolejności zidentyfikowano zwierzęta transgeniczne przy użyciu lampy fluorescencyjnej z odpowiednimi zestawami filtrów (przykłady fluorescencyjnych noworodków myszy VGAT Venus oraz NexCre;Ai9 przedstawiono na Rysunku 1A). Po identyfikacji zwierząt transgenicznych wypreparowaną tkankę zdysocjowano, a następnie wyselekcjonowano neurony o najsilniejszej fluorescencji, aby uzyskać oczyszczoną populację komórek. Przykładowe wykresy kropkowe intensywności fluorescencji dla neuronów mysich NexCre;Ai9 i VGAT Venus, otrzymane podczas FACS, przedstawiono na Rysunku 1B. Po optymalizacji możliwe jest pozyskanie od 50 00 do 80 0 komórek z kory mózgowej i hipokampa pojedynczych myszy NexCre;Ai9 lub VGAT Venus w wieku P0-2. Sortowanie komórek może odbywać się z prędkością przekraczającą 60 zdarzeń/s. Szacowanie czystości komórek przeprowadzono z wykorzystaniem DAPI jako markera jądrowego (Rysunek 1C). Dzięki sortowaniu komórek silnie pozytywnych rutynowo można osiągnąć czystość powyżej 97%7.
Po pomyślnym sortowaniu wysiane neurony powinny mieć okrągły kształt, gładką błonę oraz powinny zacząć wypuszczać neuryty po około 1 h in vitro (Rycyna 2A, B). Do 7 dnia in vitro, choć może wystąpić pewna śmierć komórek, żywe komórki powinny być obecne we wszystkich warunkach hodowli (Rycyna 2C, D). W 12–16 dniu in vitro, wykorzystując rejestrację whole-cell patch-clamp oraz wypełnianie biocytyną15, możliwe jest zbadanie rozwoju morfologicznego i elektrofizjologicznego oczyszczonych neuronów (Rycyna 3). Analiza oczyszczonych kultur wykazuje, że zarówno neurony glutaminergiczne, jak i GABAergiczne były w stanie wykształcić aksony i dendryty z ciał komórkowych (Rycyna 3A, B) oraz zachowały zdolność do generowania potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na wtryskiwanie ponadprogowych prądów depolaryzujących (Rycyna 3C, D). Należy jednak zauważyć, że po oczyszczeniu tylko neurony GABAergiczne otrzymywały znaczną ilość spontanicznej transmisji synaptycznej, natomiast neurony glutaminergiczne otrzymują bardzo niewielką transmisję synaptyczną w nieobecności komórek glejowych (Rycyna 3E, F)7.
Jak zgłaszaliśmy wcześniej, komórki w kulturach oczyszczonych mają tendencję do gorszego przeżycia niż te w kulturach nieposortowanych oraz posiadają znacznie mniejsze dendryty i aksony7. Aby zniwelować te niedobory, zaadaptowaliśmy i zastosowaliśmy metody wspierania rozwoju kultur oczyszczonych za pomocą komórek glejowych12,14. Skład komórkowy naszych kultur ze wsparciem glejowym (DIV7) przedstawiono na Rysunku 4A. Kultury te zawierały przede wszystkim astrocyty wykazujące dodatni wynik dla białka kwaśnego włókienka glejowego (GFAP), ale zawierały również niektóre mikrogleje dodatnie dla cząsteczki klastra różnicowania (CD1b) oraz oligodendrocyty dodatnie dla podstawowego białka mieliny (MBP). Po 7. dniu in vitro (DIV 7) komórki te można przenieść do insertów hodowlanych, aby zapewnić niekontaktowe wsparcie dla oczyszczonych neuronów (Rysunek 4B, C). Analiza kokultur glejowo-neuronalnych wykazuje, że około 40 00 komórek glejowych było wystarczających do poprawy długoterminowego przeżycia i wzrostu zarówno oczyszczonych neuronów glutaminergicznych, jak i GABAergicznych (Rysunek 4D, E)7. Co więcej, analiza elektrofizjologiczna wykazuje, że neurony glutaminergiczne hodowane w kokulturach z komórkami glejowymi były wysoce aktywne i wykazywały znacznie zwiększoną aktywność sieciową (procent neuronów glutaminergicznych wspieranych przez glej wykazujących serie potencjałów czynnościowych: 62%; n = 28; Rysunek 4F, G). Wsparcie glejowe jest zatem istotne nie tylko dla promowania wzrostu i przeżycia neuronów, ale także dla promowania transmisji synaptycznej i ustanowienia aktywności sieciowej w kulturach glutaminergicznych.
<img alt="Schemat obrazowania fluorescencyjnego i cytometrii przepływowej: analiza NexCre;Ai9, VGAT Venus, TdTomato, YFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Oczyszczanie neuronów glutaminergicznych i GABAergicznych. (AObrazy przedstawiające sygnał fluorescencyjny z ekspresji transgenu TdTomato u myszy NexCre;Ai9 (góra) oraz Venus u myszy VGAT Venus (dół). Paski skali = 5 mm.B) Wykresy rozrzutu intensywności fluorescencji TdTomato i Venus w rozproszonych komórkach korowo-hipokampalnych myszy NexCre;Ai9 (góra) oraz myszy VGAT Venus (dół). Do sortowania wybrano neurony o silnej fluorescencji TdTomato lub Venus (oznaczone ramkami bramkowania). (C, po lewej) Obrazy konfokalne wyselekcjonowanych neuronów pozytywnych pod kątem TdTomato (góra) i Venus (dół). (C, prawa) Połączony obraz przedstawiający komórki poddane podwójnemu barwieniu z użyciem DAPI (w niebieskim pseudokolorze). Fluorescencja TdTomato jest endogenna i pozostaje silna mimo utrwalenia (w magenta pseudokolorze). Ekspresja Venus została wzmocniona przy użyciu kombinacji przeciwciała pierwszorzędowego skierowanego przeciwko GFP oraz przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexa Fluor-48 (w zielonym pseudokolorze). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek z markerami TdTomato, Venus i GFP; analiza w jasnym polu i analiza nakładkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Hodowla komórkowa oczyszczonych neuronów glutaminergicznych lub GABAergicznych. (APołączone obrazy w podczerwieni (ciemne pole) z nałożonym sygnałem fluorescencyjnym z neuronów pozytywnych pod kątem TdTomato (lewo) i Venus (prawo), hodowanych in vitro przez 1 h. Białe strzałki wskazują położenie rosnących neurytów.BObrazy konfokalne neuronów wykazujących ekspresję TdTomato (lewo) oraz Venus (prawo), hodowanych in vitro przez 1 h.C, D) Obrazy w jasnym polu (góra) oraz połączone obrazy w jasnym polu i fluorescencyjne (dół) neuronów wykazujących ekspresję TdTomato (C) oraz Venus (D), hodowanych przez 7 dni in vitro (DIV). Białe strzałki wskazują położenie skondensowanych jąder martwych komórek. Kolorowe strzałki identyfikują neurony znakowane fluorescencyjnie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obrazowanie neuronów oraz wykres clampowania napięcia przedstawiające ekspresję TdTomato i Venus w analizie mikroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Właściwości morfologiczne, elektrofizjologiczne i synaptyczne oczyszczonych neuronów. (A, B) Obrazy konfokalne neuronów pozytywnych dla TdTomato (A) oraz Venus (B) odpowiednio w 13. i 14. dniu in vitro (DIV 13 i DIV 14). Komórki przedstawiono w kolorze czarnym przy użyciu odwróconej tablicy wyszukiwania (look-up table), aby ułatwić wizualizację neurytów. Wstawki pokazują sygnał fluorescencyjny emitowany przez zidentyfikowane neurony. (C, D) Odpowiedź napięciowa neuronu pozytywnego dla TdTomato (C) oraz Venus (D) na hiperpolaryzujące (od 20 do -20 pA, w krokach co 20 pA) i depolaryzujące (20 pA) impulsy prądowe, uzyskana za pomocą rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Wstawki przedstawiają odpowiadające im rejestrowane neurony. Potencjał spoczynkowy błony każdej komórki jest wskazany po lewej stronie śladu zapisu. (E, F) Reprezentatywne rejestracje metodą clampowania napięcia (10 s) uzyskane z neuronów dodatnich dla TdTomato (E) i Venus (F). Spontaniczne pobudzające prądy postsynaptyczne (EPSCs) rejestrowano z neuronów dodatnich dla TdTomato, utrzymując potencjał trzymania 50 mV. Spontaniczne hamujące prądy postsynaptyczne (IPSCs) rejestrowano z neuronów dodatnich dla Venus, utrzymując potencjał trzymania 0 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Kokultura gliałowo-neuronalna; markery immunofluorescencyjne GFAP, CD1b, MBP; zapisy aktywności neuronalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Wspieranie rozwoju neuronów poprzez kokulturę z glejem. (AObrazy konfokalne kultur glejowych immunoznakowanych pod kątem białka kwaśnego włókien glejowych (GFAP, lewo), cząsteczki klastra różnicowania (CD1b, środek) oraz podstawowego białka mieliny (MBP, prawo). Komórki glejowe hodowano przez 7 dni in vitro (DIV 7).B) Obrazy wkładów do hodowli komórkowych wykorzystanych do współhodowli komórek glejowych z oczyszczonymi neuronami w układzie bezkontaktowym. (CSchemat rozmieszczenia przestrzennego zastosowanego do kokultury neuronów i gleju.D, E) Obrazy konfokalne neuronów wykazujących ekspresję TdTomato (D) oraz Venus (E), hodowanych przez 14 dni, w obecności (po prawej) lub w nieobecności (po lewej) wsparcia glejowego. (F, G) Rejestracje w konfiguracji current-clamp (60 s) z neuronów pozytywnych pod względem TdTomato (F) oraz Venus (G), hodowanych przez 14 dni bez (góra) lub z (dół) wsparciem glejowym. Rejestracje neuronów przeprowadzono przy ich spoczynkowym potencjale błonowym (przedstawionym po lewej stronie każdego śladu rejestracji). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje metodę opartą na sortowaniu komórek do oczyszczania i hodowli fluorescencyjnych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego z kory nowej i hipokampa myszy lub szczurów po urodzeniu.

Pierwotna hodowla komórkowa oczyszczonych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego uzyskanych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Protokół ten opisuje prostą i powtarzalną metodę oczyszczania i hodowli określonych typów neuronów pierwotnych. Kultury te nadają się do analizy elektrofizjologicznej, morfologicznej i przeżywalności. Kultury oczyszczonych neuronów można wykorzystać do badania podstaw fizjologii neuronów, tworzenia synaps, a także rozwoju sieci neuronowych.Podczas gdy skupiamy się na głównych komórkach glutaminergicznych kory mózgowej i interneuronach GABA-ergicznych, procedura ta może być łatwo zmodyfikowana w celu zbadania dowolnych linii neuronalnych wyrażających białka fluorescencyjne. Aby przygotować szklane szkiełka nakrywkowe, najpierw rozmrozić pięciomililitrową porcję 200 mikrogramów na mililitr roztworu PLL. Rozcieńczyć ten roztwór podstawowy do 20 mikrogramów na mililitr, dodając 45 mililitrów czystej wody do wstrzykiwań.Następnie przefiltruj, wysterylizuj roztwór do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i oznacz tę probówkę jako sterylną PLL. Następnie umieść 100 sterylnych okrągłych 12 milimetrowych szklanych szkiełek nakrywkowych w sterylnym roztworze PLL. Mieszaj probówkę co pięć do 10 minut przez dwie do trzech minut, aby zapewnić równomierne powlekanie.Po 40 minutach powlekania PLL weź dwa kawałki bibuły i połóż je płasko w komorze przepływowej. Wysterylizuj papier przy użyciu 70% etanolu, a następnie spłaszcz, aby usunąć zagniecenia i pozostaw do wyschnięcia. Po pokryciu szklanych szkiełek nakrywkowych przez godzinę PLL, usuń nadmiar roztworu PLL i dodaj sterylną wodę do wstrzykiwań.Delikatnie mieszaj szkiełka nakrywkowe przez dwie do trzech sekund, aby usunąć nadmiar PLL. Powtórz ten etap płukania jeszcze dwa razy. Usuń nadmiar wody, a następnie przenieś szkiełka nakrywkowe na sterylną bibułkę.Po wyschnięciu przenieś szkiełka nakrywkowe na 24-dołkową płytkę hodowlaną. Aby przygotować roztwory do hodowli komórkowych, odmierz 12 mililitrów buforu do hodowli komórkowych do 15-mililitrowej stożkowej probówki i oznacz jako BSA. Odmierz pięć mililitrów buforu do hodowli komórkowej do innej 15-mililitrowej probówki i oznacz jako papainę.Następnie inkubuj obie probówki przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj 120 miligramów BSA do probówki oznaczonej BSA. Następnie odwróć probówkę, aby pomóc rozpuścić roztwór.Następnie dodaj siedem miligramów papainy do probówki oznaczonej jako papaina. Włóż obie rurki z powrotem do łaźni wodnej na 15 minut. Filtruj roztwór BSA do świeżej stożkowej probówki.Podziel sterylny roztwór BSA na trzy probówki i oznacz każdą probówkę jako sterylną BSA oraz jedną, dwie lub trzy. Teraz przefiltruj, wysterylizuj probówkę papainy i oznacz probówkę jako sterylną papainę. Włóż wszystkie probówki z powrotem do łaźni wodnej i kontynuuj inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza aż do użycia.Aby przygotować się do wypreparowania tkanek, rozłóż skalpel, nożyczki, kleszcze i szpatułkę potrzebne do wypreparowania hipokampa i kory. Umieść dwie 35-milimetrowe szalki Petriego i 100-milimetrową szalkę Petriego zawierające sterylną bibułę filtracyjną w komorze przepływowej. Zbieraj transgeniczne NexCre; Ai9 lub pęcherzykowy transporter GABA młode myszy Wenus, które mają być rozcięte za pomocą lampy fluorescencyjnej z odpowiednimi filtrami wzbudzenia i emisji w celu odróżnienia świetlówek fluorescencyjnych od dzikich partnerów.Bezpośrednio przed sekcją zwierząt należy wypełnić każdą szalkę Petriego schłodzonym sterylnym buforem do hodowli komórkowych. Po sekcji ostrożnie przenieś mózg transgenicznego szczeniaka na sterylną bibułę filtracyjną. Najpierw wypreparuj móżdżek i oddziel dwie półkule.Następnie ostrożnie oddziel hipokamp i korę mózgową od każdej półkuli. Przenieść wypreparowaną tkankę na 35-milimetrową szalkę Petriego zawierającą schłodzony bufor do hodowli komórkowych. Następnie przenieś wypreparowany hipokamp i korę na pokrywę kolejnej 35-milimetrowej szalki Petriego.Używając płaskiej krawędzi ostrza skalpela, ostrożnie posiekaj tkankę ruchami krzyżowymi, aż pozostaną tylko małe kawałki. Następnie przenieś posiekaną tkankę z niewielką ilością roztworu papainy z pokrywki szalki Petriego do sterylnej probówki do papainy. Inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 minut.Po inkubacji papainy przenieś sterylną probówkę do papainy i sterylne probówki BSA do komory przepływowej. Następnie użyj jednomililitrowej pipety Pasteura, aby przenieść tylko tkankę korowo-hipokampową z rurki papainy do rurki z rurki BSA. Aby rozbić duże grudki tkanki, należy kilkakrotnie rozcierać tkankę za pomocą jednomililitrowej pipety Pasteura.Następnie rozcieraj tkankę siedmiokrotnie za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką. Po 30 sekundach przenieś jeden mililitr dolnego roztworu i tkankę z pierwszej probówki BSA do drugiej probówki BSA. Kilkakrotnie roztarć tkankę w probówce BSA dwa za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką.Po roztarciu przenieś jeden mililitr dolnej tkanki i roztworu z pierwszej probówki BSA do trzeciej probówki BSA. Kilkakrotnie roztarć tkankę w probówce BSA trzy. Po roztarciu przenieść cały roztwór i tkankę z probówki drugiej i trzeciej do probówki pierwszej BSA.Rozcierać jeszcze dwa do trzech razy i odwirowywać przy 3 000 razy g przez trzy minuty. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant z granulowanej tkanki i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety P1000 w dwóch mililitrach całkowicie hibernacyjnego podłoża o niskiej fluorescencji. Następnie rozcierać tkankę 20 razy, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie roztworu tkankowego.Następnie przefiltrować zawiesinę komórek przez sito komórkowe o średnicy 30 mikrometrów do probówki z polistyrenu. Przygotować probówki do sortowania komórek, pipetując 300 mikrolitrów całkowicie hibernującego podłoża A do wymaganej liczby probówek polipropylenowych. Dla każdego typu ogniwa fluorescencyjnego, które ma być sortowane, należy dobrać odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji.Wzbudz białko Wenus za pomocą długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i wykryj emitowane światło przez zestaw filtrów emisyjnych 530/40. Wzbudz białko TdTomato za pomocą długości fali wzbudzenia 531 nanometrów i wykryj emitowane światło za pomocą zestawu filtrów emisyjnych 575/30. Aby uzyskać wysoką czystość, sortuj jaskrawo oznaczone komórki fluorescencyjne.Po posortowaniu komórek przenieś zebrane komórki do dwóch mililitrowych probówek wirówkowych z okrągłym dnem. Następnie odwiruj komórki pod ciśnieniem 3 000 g przez trzy minuty, aby utworzyć osad komórkowy. Ponownie zawiesić osad komórkowy w wymaganej ilości wstępnie podgrzanego, kompletnego podłoża NBA, aby osiągnąć gęstość komórek 1,000 komórek na mikrolitr.Aby potwierdzić obecność zdysocjowanych komórek, sprawdź roztwór komórek pod mikroskopem za pomocą soczewki obiektywowej 4X lub 10X. Przed posianiem komórek należy wirować ze średnią prędkością przez dwie do trzech sekund, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek. Po wirowaniu szybko odpipetować 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do środka każdego szkiełka nakrywkowego.Po godzinie nakarm komórki 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki NBA i wróć do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wspólnie hodować oczyszczone neurony i komórki glejowe, należy przejść komórki glejowe do wymaganej liczby wkładów hodowli komórkowych. Odbywa się to poprzez posiew 40 000 komórek glejowych w kropli o pojemności 500 mikrolitrów kompletnej pożywki NBA.Po godzinie przenieś hodowlę komórek glejowych do oczyszczonych neuronów. Usuń nadmiar pożywki z wkładek hodowlanych i włóż płytki z powrotem do inkubatora w celu hodowli. Po udanym sortowaniu, posiane neurony powinny mieć okrągły kształt z gładką błoną i powinny być postrzegane jako oszczędzające nerwice po około jednej godzinie in vitro.Po siedmiu dniach in vitro, chociaż może być widoczna pewna śmierć komórki, żywe komórki powinny być obecne we wszystkich warunkach hodowli. Analiza oczyszczonych kultur ujawnia, że zarówno neurony glutaminergiczne, jak i GABA-ergiczne były w stanie wysunąć aksony i dendryty ze swoich ciał komórkowych i zachować zdolność do generowania potencjałów czynnościowych w odpowiedzi na super progowe zastrzyki prądu depolaryzującego. Warto zauważyć, że po oczyszczeniu tylko neurony GABA-ergiczne otrzymały znaczną ilość spontanicznej transmisji synaptycznej, a neurony glutaminergiczne otrzymały bardzo małą transmisję synaptyczną przy braku komórek glejowych.Co ważne, hodowla oczyszczonych neuronów za pomocą komórek glejowych poprawia wzrost i przeżycie neuronów, a także wspomaga przekaźnictwo synaptyczne w kulturach glutaminergicznym. Wystarczająca polaryzująca powłoka szkiełek nakrywkowych i utrzymanie fizjologicznego pH pożywki hodowlanej przez cały czas trwania procedury są kluczem do zapewnienia dobrej jakości kultur komórkowych. Zgodnie z tym protokołem powinno być możliwe przeprowadzenie sekwencjonowania RNA i spektroskopii mas białek na oczyszczonych kulturach, co pozwoli na zbadanie procesów translacyjnych i transkrypcyjnych w określonych typach neuronów.

primary-cell-culture-purified-gabaergic-or-glutamatergic-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół wideo demonstruje nową metodę generowania i następnego oczyszczania neuronalnych komórek progenitorowych z odnawialnego źródła neuralnych komórek macierzystych (NSCs) w oparciu o ich właściwości fizyczne (rozmiar i ziarnistość wewnętrzną) oraz fluorescencyjne, z wykorzystaniem technologii cytometrii przepływowej.

Analiza neuroblastów: metoda generowania i wzbogacania populacji neuronalnych komórek progenitorowych z różnicujących się potomków neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Opisano zoptymalizowaną procedurę oczyszczania neuronalnych progenitorów pochodzących z grzebienia neuronalnego z tkanek zarodkowych myszy. Metoda ta wykorzystuje ekspresję fluorescencyjnych alleli reporterowych do izolowania odrębnych populacji za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Technikę tę można zastosować do izolowania neuronalnych subpopulacji na różnych etapach rozwoju lub z tkanek dorosłych.

Zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

W tym filmie izolujemy komórki mikrogleju danio pręgowanego za pomocą sortowania komórek sprzężonego z barwieniem immunologicznym. Wyizolowany mikroglej może być wykorzystany w dalszych eksperymentach w celu zrozumienia jego roli w patologiach mózgu.

Izolacja mikrogleju przez barwienie immunologiczne Sortowanie sprzężone z komórkami: metoda barwienia immunologicznego do izolowania mikrogleju z komórek mózgowych danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnego sortowania komórek aktywowanych

Wideo ilustruje technikę hodowli fluorescencyjnych neuronów GABA-ergicznych i glutaminergicznego z kory mózgowej i tkanek hipokampa transgenicznych szczeniąt myszy. Proces ten obejmuje uzyskanie oczyszczonych zawiesin pojedynczych komórek neuronów, sortowanie neuronów GABA-ergicznych na podstawie ich ekspresji białek fluorescencyjnych oraz umieszczanie ich na płytkach pokrytych poli-L-lizyną w celu ułatwienia przyczepiania i proliferacji komórek.

Hodowla fluorescencyjnych neuronów pobudzających z transgenicznego mózgu szczeniaka myszy

Film pokazuje izolację neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych od transgenicznego zarodka myszy. Zarodek wykazuje ekspresję neuronów ruchowych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu łatwej wizualizacji i identyfikacji. Neurony ruchowe są chirurgicznie izolowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i utrzymywane w pożywce hodowlanej.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych z zarodka myszy

Ten film pokazuje izolację fluorescencyjnie znakowanych neuronów od Caenorhabditis elegans. Zawiesinę komórkową uzyskuje się z transgenicznych robaków zaprojektowanych do ekspresji fluorescencyjnych, połączonych z białkiem transbłonowym transporterów pęcherzykowych w neuronach cholinergicznych. Znakowane fluorescencyjnie neurony są następnie izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i utrzymywane w hodowli.

Izolacja neuronów z Caenorhabditis elegans poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Ta praca przedstawia protokół do uzyskania jednorodnych kultur komórkowych pierwotnych neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych. Kultury te można wykorzystać do analiz porównawczych cech morfologicznych, komórkowych, molekularnych i elektrofizjologicznych neuronów ruchowych oka i rdzenia.

Izolacja i hodowla neuronów ruchowych okoruchowych, bloczkowych i rdzeniowych myszy transgenicznych z grupy prenatalnej mn:GFP

Opracowaliśmy metodę, która wzbogaca i izoluje ludzkie populacje astrocytów ze świeżo zamrożonej tkanki do wykorzystania w dalszych analizach molekularnych.

Izolacja populacji astrocytów dorosłych ludzi ze świeżo zamrożonej kory mózgowej przy użyciu sortowania jąder aktywowanych fluorescencją

Poznaj metodę hodowli pierwotnych neuronów GABA-ergicznych i glutaminergicznych z myszy szczepionych, uzyskiwaną przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Technika umożliwia badania elektrofizjologiczne i morfologiczne.

Pierwotna hodowla komórkowa oczyszczonych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego uzyskanych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (Wideo) | JoVE Journal

Pierwotna hodowla komórkowa oczyszczonych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego uzyskanych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

Przeglądaj więcej filmów