Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Tutaj demonstrujemy test transportu receptorów o wysokiej zawartości, który jest zgodny z przygotowaniem pierwotnej hodowli neuronów. Ta metoda oddzielnie oznacza powierzchnię międzypiwnicznych pul receptorów stałych neuronów. Umożliwienie prezentacji danych jako stosunku znormalizowanej powierzchni lub zinternalizowanej gęstości receptora do ogólnej gęstości tego receptora.

Test wysokiej zawartości i transportu receptorów zapewnia skuteczny sposób pomiaru masowych zmian w profilach transportu receptorów w sieci neuronowej w odpowiedzi na różne czynniki. Zużywa znacznie mniej czasu i materiałów niż metody alternatywne. Zakłócenia i handel preceptorami są powiązane z wieloma zaburzeniami neurologicznymi i są uważane za atrakcyjne cele terapii farmakologicznej.

Na przykład badania wykazały, że jednym z najwcześniejszych objawów choroby Alzheimera jest utrata synaps i zmniejszone pule synaps i preceptorów. Ta technika wymaga wielu różnych kroków o różnym stopniu trudności. Zwłaszcza, że obsługa płytki 96-dołkowej i manipulowanie studniami może okazać się trudne dla kogoś bez doświadczenia.

A ponieważ wyniki eksperymentu są bardzo wrażliwe na niewłaściwą obsługę, przydatne jest przyjrzenie się różnym wykonywanym krokom. Instruktor: Na początek nakarm neurony w 96-dołkowej płytce, usuwając 100 mikrolitrów wcześniej istniejących pożywek z każdej studzienki. I zastąpienie go 100 mikrolitrami pożywki podgrzanej do 37 stopni Celsjusza.

Co trzy do czterech dni. Dziennie in vitro 14 użyj wielopipetowej, aby usunąć 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki i połączyć pożywkę. Dodaj dwa mikrolitry roztworu podstawowego TTX do jednego mililitra połączonej kondycjonowanej pożywki, aby utworzyć czteromikromolowy roztwór TTX.

Potraktuj neurony w każdej studzience 100 mikrolitrami czteromolowego roztworu TTX. Jeśli nie ma wystarczającej ilości nośników warunku puli, dodaj część wcześniej zapisanych nośników. Inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Następnie usuń istniejącą pożywkę zawierającą TTX i dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanych pożywek neuronalnych i inkubuj mikropłytkę w temperaturze pokojowej przez piętnaście minut. Najpierw usuń pożywkę neuronalną z mikropłytki. Dodaj pięćdziesiąt mikrolitrów roztworu przeciwciała anty gluA1 lub anty gluA2 do odpowiednich dołków mikropłytki.

Dodaj pięćdziesiąt mikrolitrów pożywki neuronalnej do drugorzędowych studzienek kontrolnych tylko z przeciwciałami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwadzieścia minut, aby umożliwić wiązanie przeciwciał. Następnie usuń istniejące media ze studzienek.

Umyj mikropłytkę trzykrotnie 100 mikrolitrami pożywki neuronalnej o temperaturze pokojowej na studzienkę, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 100 mikromoli roztworu podstawowego DHPG do każdej studzienki. Inkubować w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dziesięć minut.

Następnie usuń roztwór DHPG i dodaj 100 mikrolitrów pożywki neuronalnej do każdej studzienki. Powtórz ten proces po raz drugi. Następnie inkubować w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

W dniu eksperymentu należy przygotować roztwór 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy NPBS. Usuń pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 100 mikrolitrami roztworu paraformaldehydu i sacharozy. Powtórz ten proces dla każdego punktu czasowego dodawania.

Inkubuj mikropłytkę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwadzieścia minut. Następnie usuń utrwalacz i dodaj 100 mikrolitrów DPBS do każdej studzienki. Usuń DPBS i dodaj 150 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez dziewięćdziesiąt minut. Usunąć bufor blokujący i dodać 50 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciała do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez sześćdziesiąt minut, chroniąc płytkę przed światłem.

Usuń roztwór przeciwciała i dodaj 100 mikrolitrów TBS do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powtórz ten proces, usuwając pożywkę z dołków, dodając TBS i inkubując w temperaturze pokojowej jeszcze cztery razy.

Następnie wyjmij TBS z mikropłytki. Do każdej studzienki dodać 100 mikrolitrów roztworu 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez piętnaście minut.

Usuń roztwór paraformaldehydu i dodaj 100 mikrolitrów TBS do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy. Najpierw przygotuj roztwór TBS zawierający 2% saponiny i krótko zmieszaj roztwór, aby całkowicie rozpuścić proszek saponiny.

Za pomocą filtra o długości 2 mikrometrów przefiltruj roztwór, aby usunąć wszelkie cząsteczki, które mogłyby powodować autofluorescencję. Dodaj 150 mikrolitrów tego 2% roztworu saponin do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez piętnaście minut. Następnie usuń roztwór saponin i dodaj 150 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez dziewięćdziesiąt minut. Następnie usuń bufor blokujący i dodaj pięćdziesiąt mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez sześćdziesiąt minut.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów TBS do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Powtórz ten proces, dodając TBS i inkubując w temperaturze pokojowej jeszcze cztery razy. Za pomocą systemu obrazowania laserowego w podczerwieni zobrazuj 96-dołkową mikropłytkę zgodnie z instrukcjami producenta.

Ustaw rozdzielczość skanowania na 84 mikrometry. Jakość skanowania do średniej i przesunięcie ostrości zgodnie z wysokością podstawy użytej 96-dołkowej mikropłytki. Kliknij przycisk menu Image Studio, wyeksportuj obraz do mediów cyfrowych, a następnie wyeksportuj obrazy w rozdzielczości 300 dpi w formacie TIFF.

Otwórz obraz w ImageJ Fidżi. Podziel kanały kolorów, klikając menu obrazu, a następnie kolor, podziel kanały. Następnie otwórz menedżera ROI z analizy, narzędzi.

Zaznacz pole wyboru etykiet w menedżerze ROI, aby sklasyfikować okręgi za pomocą numerów. W kanale 6 80 lub czerwonym wybierz obszar zainteresowania, wybierając narzędzie okrąg i rysując okrąg, który dokładnie pasuje do pierwszego dołka. Następnie naciśnij Ctrl plus T, przeciągając okrąg do następnego dołka.

Powtarzaj ten proces, aż wszystkie studzienki zostaną zakreślone. W menedżerze ROI kliknij pozycję Zmierz. Zaznacz wyświetlone wartości i skopiuj je do arkusza kalkulacyjnego.

Następnie kliknij zielony kanał i przenieś wybrane ROI na obraz. W menedżerze ROI kliknij pozycję Zmierz. Zaznacz wyświetlone wartości i skopiuj je do arkusza kalkulacyjnego.

Następnie oblicz zmiany wyrażenia receptora powierzchniowego, jak opisano w protokole tekstowym. W tej procedurze trwałość łuku w regulacji transportu receptora ampa jest badana za pomocą transportu i testu receptora ampa o wysokiej zawartości. Neurony są leczone blokerem kanału jonów sodowych TTX, który hamuje potencjały czynnościowe i zmniejsza poziom łuku.

Następnie DHPG, który indukuje translację łuku i ubikwitynację. Zarówno powierzchniowe, jak i internalizowane pule podjednostek receptora apa zawierających gluA1 i gluA2 mierzono po pięciu i piętnastu minutach od wypłukania DHPG. Neurony ArcKR wykazują zwiększoną endozytozę gluA1 podczas leczenia DHPG w porównaniu z neuronami typu białego.

Efekt ten nie jest widoczny, gdy neurony są leczone tylko TTX. Ekspresja powierzchniowa podjednostki gluA2 jest znacznie zwiększona w krótkich punktach czasowych w porównaniu z neuronami typu wile. Wskazanie potencjalnej wymiany podjednostki.

Upewnij się, że komórki są niepłynne, utrwalony paraformaldehyd powinien być przygotowany świeży w dniu eksperymentu. Komórki muszą być ponownie utrwalone po znakowaniu receptorów powierzchniowych. Inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, będą w stanie zapewnić rozdzielczość pojedynczych komórek, aby dokładniej scharakteryzować powiązane zmiany w strukturze neuronalnej i lokalizacji receptorów.

Zakłócenie czasowej dynamiki łuku zmienia transport receptorów ampa w odpowiedzi na LTD, w którym pośredniczy MgluR. Przyszłe kierunki będą polegały na pomiarze transportu receptorów ampa w odpowiedzi na inne bodźce. Test ten można dostosować do innych typów komórek, metod leczenia i receptorów, pod warunkiem, że procedura zostanie starannie dostosowana i odpowiednio zwalidowana.

Należy zadbać o to, aby gęstości komórek, czasy leczenia, etapy fiksacji, etapy przepuszczalności i dobór odczynników były zoptymalizowane pod kątem systemu, który Cię interesuje. Dla pomyślnego i efektywnego zakończenia testu ważne jest, aby w dniu eksperymentu przygotować roztwór DHPG i 4% roztwór paraformaldehydu i 4% sacharozy. Kontrola dobrze leczona vakeelem lub TTX jest wymagana, aby upewnić się, że obserwowane efekty są specyficzne dla leczenia.

Bardzo ważne jest również, aby włączyć studzienki potraktowane tylko przeciwciałami drugorzędowymi w celu kontrolowania fluorescencji tła wytwarzanej przez niespecyficzne wiązanie.