Postępowanie z ludzką pierwotną hodowlą organoidów gruczołu krokowego i ich ocena

Tutaj prezentujemy protokół, który pomaga w postępowaniu z ludzkimi organoidami pierwotnymi prostaty, a następnie sugerujemy punkty końcowe do oceny fenotypu. Opisano wysiew, utrzymanie kultur, odzysk z żelu matrycowego, kwantyfikację morfologiczną, osadzanie i sekcjonowanie, cięcie FFPE, barwienie całego mocowania oraz zastosowanie testów komercyjnych.

Organoidy prostaty są ekscytującym systemem in vitro do badania rozwoju i choroby. Pokonują wyzwania związane z unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi i stanowią niedrogą alternatywę dla modeli zwierzęcych. Można je hodować z ludzkich komórek prostaty, jak wykazaliśmy w tym protokole, a także z mysich komórek prostaty, jako system modelu przedklinicznego istotnego z punktu widzenia choroby.

Wiele laboratoriów opisało przydatne metody hodowli i punkty końcowe. Mamy jednak nadzieję, że uda nam się zebrać te szczegóły w jednym protokole i zademonstrować szczególnie trudne kroki dla nowych użytkowników. Wraz z doskonaleniem technik organoidy raka prostaty mogą być hodowane z próbek pobranych od pacjentów jako podejście medycyny precyzyjnej do modelowania choroby i odpowiedzi na terapie.

Warunki hodowli są specyficzne dla organoidów gruczołu krokowego, jednak wiele punktów końcowych zostało zaadaptowanych z innych typów tkanek. Użytkownik może dostosować części tego protokołu do swojego typu komórki. Rozpocznij ten eksperyment od wyhodowania komórek nabłonkowych na 96-dołkowych płytkach oznaczonych żelem matrycowym, jak opisano w manuskrypcie.

Aby zebrać organoidy z płytek po 12 dniach, usuń pożywkę z dołków, nie naruszając żelu matrycowego. Następnie natychmiast dodaj około 200 mikrolitrów neutralnej proteazy do każdej studzienki w stosunku około jeden do dwóch żelu matrycowego do neutralnej proteazy. Inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie pipetować w górę i w dół, aby mechanicznie zdysocjować mieszaninę, i ponownie inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przenieść obojętną mieszaninę żelowo-komórkową macierzy proteazy z kilku studzienek do probówki mikrowirówkowej. Granulować komórki przez odwirowanie 300 razy g przez trzy do pięciu minut.

Usunąć supernatant i zachować osad organoidowy do dalszych analiz. Aby stworzyć formy do zatapiania, wytnij niewielką część końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby uzyskać cylinder o pojemności 50 mikrolitrów. Następnie z szerszej części tej samej końcówki wykonaj drugą szerszą formę, która pasuje do pierwszej formy.

Aby stworzyć zimny blok, owiń folię lodową taśmą klejącą do góry. Następnie przyklej formy prostopadle do taśmy. Aby osadzić organoidy w zatyczce żelu histologicznego do przetworzenia, najpierw umyj wcześniej uzyskane osady organoidowe jednym mililitrem zbilansowanego roztworu soli Hanka.

Po odwirowaniu w stężeniu 300 razy g przez trzy do pięciu minut, usunąć supernatant. Następnie dodaj od 30 do 50 mikrolitrów płynnego żelu histologicznego do osadu organoidowego i delikatnie wymieszaj, powoli pipetując w górę iw dół, aby ponownie zawiesić osad. Przenieś tę mieszaninę do formy na zimnym bloku i pozwól próbce ostygnąć i zestalić się w korku.

Następnie za pomocą tłoka wypchnij korek z małej formy do środka większej formy i napełnij go, pipetując przezroczysty 2% agar wokół korka. Aby oznaczyć górną część próbki, należy nałożyć na wierzch zatyczki odpipetowany 2% agar o barwie histologicznej. Gdy agar ostygnie, użyj tłoka, aby przenieść zatyczkę do kasety histologicznej.

Oznacz kasetę ołówkiem i umieść ją w 10% neutralnej buforowanej formalinie w celu utrwalenia na noc. Następnego dnia przenieś kasetę z 10% neutralnej buforowanej formaliny na 70% etanol klasy histologicznej, a następnie poddaj ją dalszej obróbce i zatopić w parafinie. Zacznij od przycięcia podstawy bloku o grubości 10 mikrometrów.

Gdy pojawi się sekcja zawierająca obszar wtyczki, przestań przycinać. Zablokuj wirnik mikrotomu i przenieś blok z powrotem na lód, aby schłodzić. Przenieś ostrze do nowej, nieużywanej części.

I przenieś blok z powrotem do zacisku. Odblokuj maszynę i rozpocznij przycinanie z prędkością pięciu mikrometrów na sekcję. Użyj pęsety, aby przenieść sekcję do łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza i pozwól jej się rozprowadzić.

Zanurz zjeżdżalnię pionowo w wodzie, aby przenieść na nią sekcję. Następnie obserwuj szkiełko pod mikroskopem jasnego pola, aby upewnić się, że w przekroju znajduje się organoid. Piecz przez noc w temperaturze od 45 do 50 stopni Celsjusza, a następnie przystąp do barwienia zgodnie z opisem w rękopisie.

Rozpocznij tę część eksperymentu od niewykorzystanych studzienek 96-dołkowej płytki pokrytej żelem matrycowym z organoidami. Pipetując do boku studzienki, pozostawiając przestrzeń między pożywką a żelem matrycowym, ostrożnie usuń jak najwięcej pożywki, nie zakłócając hodowli organoidów. Użyj przyciętej końcówki pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, wstępnie zwilżonej PBS, aby pobrać jedną kroplę żelu matrycowego, który zawiera interesujące organoidy.

Dozuj kroplę na środek szkiełka komory. Gołym okiem odessać nadmiar podłoża i żelu matrycowego ze szkiełka komorowego za pomocą pipety z cienką końcówką. Sprzyja przyleganiu organoidów do szkła i zapobiega utracie próbek podczas kolejnych etapów mycia.

Umieść szkiełko w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 do 45 minut. Powoli pipetując, aby zapobiec oderwaniu się od naczynia, dodać 200 mikrolitrów 1X PBS, aby myć organoidy przez pięć minut w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem. Ostrożnie wyjmij 1X PBS i dodaj 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu.

Utrwalaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. W PFA umyj i kontynuuj kolejne etapy przepuszczalności i barwienia, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Zamontuj i natychmiast zobrazuj.

Niebarwione, świeżo wycięte szkiełko wyraźnie pokazuje ludzkie pierwotne organoidy prostaty, podczas gdy na niebarwionym suchym szkiełku organoidy wydają się półprzezroczyste i trudniej je wykryć pod mikroskopem jasnego pola. Barwienie hematoksyliną i eozyną pokazuje uszkodzony ludzki organoid pierwotny prostaty spowodowany niewłaściwym obchodzeniem się, takim jak agresywne pipetowanie, niewłaściwy protokół przetwarzania w porównaniu z dobrze obsługiwanym organoidem. Ludzki pierwotny organoid prostaty został utrwalony formaliną, zatopiony w parafinie, pocięty i wybarwiony bazalną cytokeratyną 5 i luminalną cytokeratyną 8, podstawową p63 i luminalną cytokeratyną 8 oraz zobrazowany za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Całkowicie zamontowany ludzki organoid pierwotny prostaty wybarwiono bazalną cytokeratyną 5 lub luminalną cytokeratyną 8, a następnie przeciwbarwiono falloidyną i DAPI oraz zobrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Cały organoid ludzkiej pierwotnej komórki prostaty został wybarwiony fluorescencyjnie znakowanym Edu i wybarwiony przeciwstawnie Hoeschtem, a następnie zobrazowany za pomocą mikroskopu konfokalnego. Ważne jest, aby wizualizować organoidy podczas całej procedury.

Po zebraniu skrawków upewnij się, że wizualizujesz próbki na szkiełku i upewnij się, że obserwujesz organoidy podczas całego montażu. Po zebraniu organoidów z żelu matrycowego można je zamontować w całości i użyć komercyjnych testów lub zdysocjować na pojedyncze komórki w celu cytometrii przepływowej lub sekwencjonowania pojedynczych komórek. Hodowla 3D zapewnia naukowcom nowatorski sposób badania tkanek w otoczeniu naczynia laboratoryjnego.

Można go zastosować do organogenezy lub do zrozumienia patologii choroby pacjenta. Podczas pracy z próbkami pobranymi od pacjentów należy zawsze zachować ostrożność i obchodzić się z materiałami, ponieważ mogą one być narażone na patogeny przenoszone przez krew.