Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

W naturze Cas9 jest białkiem odpornościowym przeciwko atakującym wirusom, które ewolucja preferuje Cas9 o rozwiązłej specyficzności, która może rozszczepiać DNA wirusa spontanicznymi mutacjami. Zbudowaliśmy sztucznie ukierunkowany system ewolucji, który preferuje zoptymalizowany wariant Cas9 o wysokiej specyficzności. Zarówno negatywne, jak i pozytywne wybory działają jednocześnie w systemie selekcji snajperów.

Warianty Cas9 ze zmniejszoną aktywnością poza celem, a także utrzymujące aktywność na celu, mogą być natychmiast badane. Mutacje zostały wprowadzone losowo w całej sekwencji Cas9, aby stworzyć bibliotekę do przesiewu. A to umożliwiło znalezienie mutacji w nieoczekiwanych pozycjach.

Obecnie wielu badaczy ze środowisk akademickich i przemysłowych używa Cas9 typu Y do opracowywania środków terapeutycznych. Jednak specyfika Cas9 typu Y nie jest zoptymalizowana, co może skutkować ciasnym upakowaniem. U ludzi oznacza to nieoczekiwane mutacje w losowych genach, które mogą prowadzić do poważnych skutków ubocznych.

Istnieje wiele enzymów podobnych do Cas9, które są opracowywane w terapiach. Nasza technika może być wykorzystana do poprawy specyficzności innych DNA i nukleidów, takich jak Jipinger, Tajlandia i Cas9, takich jak CPF1. Sprawienie, aby biblioteka była wystarczająco duża, jest kluczem do zwiększenia możliwości uzyskania wariantu z ważną funkcją.

Upewnij się, że uzyskasz wysoką wydajność na etapie chłodzenia i użyj wysoce wydajnych kompetentnych ogniw. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj jeden nanogram zarówno plazmidu CCDB, jak i plazmidu SGRNA z podwójnymi niezgodnościami do pięćdziesięciu mikrolitrów rozmrożonych komórek BW25141 GOI. Delikatnie wymieszaj ogniwa za pomocą pipetowania i przenieś je do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji o średnicy 0,1 centymetra.

Przekształć E-coli za pomocą dwóch plazmidów za pomocą elektroporacji. Natychmiast po zakończeniu elektroporacji dodać 250 mikrolitrów pożywki SOC. Delikatnie odpipetuj roztwór, aby wymieszać komórki i pożywkę, a następnie przenieś mieszaninę do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.

Odzyskaj przekształcone komórki i inkubuj je w temperaturze 32 stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając przez godzinę. Kontynuuj przygotowywanie komórek przesiewowych Snypera zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Gdy będziesz gotowy do przeprowadzenia badań przesiewowych Snypera, przekształć komórki przesiewowe Snypera za pomocą 100 nanogramów przygotowanych plazmidów wariantu Cas9 z każdej biblioteki, korzystając z procesu elktroporacji, który został wcześniej opisany.

Następnie przenieś 250 mikrolitrów komórek do świeżej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 250 pikogramów ATC do końcowego stężenia 10 nanogramów na mililitr. Odzyskaj zarówno komórki zawierające ATC, jak i wolne od ATC, inkubując je w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez godzinę z delikatnym wstrząsaniem.

Umieść 25 mikrolitrów odzyskanych komórek wolnych od ATC na płytce agarowej LB, zawierającej chloramfenikol i kanamycynę. Dodać ATC do odzyskanych komórek zawierających ATC do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr na płytce agarowej LB o średnicy 245 milimetrów. Natychmiast umieść komórki zawierające ATC na płytce zawierającej agar LB zawierającej chloramfenikol, kanamycynę i arabinozę.

Inkubuj wszystkie płytki przez noc w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Następnego dnia sfotografuj talerze. Korzystając z otwartego oprogramowania CFU, policz liczbę żywotnych kolonii, upewniając się, że liczba kolonii na nieselektywnej płytce jest co najmniej dziesięć razy większa niż różnorodność biblioteki, aby objąć wszystkie warianty.

Wyciągnij kolonie, które przetrwały na wybranych płytach ze wszystkich trzech bibliotek. Przenieś te połączone kolonie do 250 mililitrów pożywki LB, uzupełnionej chloramfenikolem i inkubuj przez noc w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Najpierw załaduj oprogramowanie do wyszukiwania CAS OF, aby wybrać witryny docelowe.

Wybierz typ PAM odpowiedni dla określonego typu Cas9 i genomu docelowego. Wypełnij kartę sekwencji zapytań. Wybierz numer niezgodności i kliknij przycisk Prześlij.

Po kilku sekundach pojawią się witryny docelowe i niedocelowe. Ogólnie rzecz biorąc, wybieraj witryny niedocelowe z jedną lub trzema niezgodnościami. Następnie uporządkuj oligonukleotydy CRRNA i Track RRNA za pomocą sekwencji szablonów i amplifikuj szablon zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Przeanalizuj dwa mikrolitry amplifikowanego DNA matrycy na 2% żelu agarozowym, a następnie oczyść matrycę. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 0,5 mikrolitra DNAzy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut, a następnie oczyść SGRNA.

Następnie potraktuj 10 mikrogramów transkrybowanego RNA in vitro 250 jednostkami fosfatazy alkalicznej jelita cielęcia przez trzy godziny w temperaturze 3 stopni Celsjusza, w obecności 100 jednostek inhibitora RNAzy, a następnie oczyść poddane działaniu SGRNA. Po pierwsze, utrzymuj limfocyty T HEK293 w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie wymieszaj dwa mikrogramy białka typu dzikiego lub Snyper Cas9 z dwoma mikrogramami SGRNA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, aby uzyskać kompleksy RNP.

Trypsynizuj i policz komórki, a następnie umyj je i przygotuj w buforze do elektroporacji, jak opisano w protokole tekstowym. Elektroportować kompleksy RNP do komórek za pomocą jednego impulsu o napięciu 1300 woltów przez 30 milisekund. Bezpośrednio po elektroporacji umieść komórki na 48-dołkowej płytce wypełnionej 500 mikrolitrami DMEM, uzupełnionymi 10% FBS i 1% antybiotykami.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Utrzymuj limfocyty T HEK293 w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Dzień przed transfekcją trypsynizuj i policz komórki.

Jeśli pracujesz w skali 48-dołkowej, płytka 10 000 komórek na dołek i 250 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Używając odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, przygotuj 250 nanogramów plazmidu P3S Cas9 i 250 nanogramów SGRNA do transfekcji. Następnie wymieszaj plazmidy w 25 mikrolitrach MEM bez surowicy.

Rozcieńczyć jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji 25 mikrolitrami MEM bez surowicy. Inkubuj tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Połączyć mieszaninę plazmidów z mieszaniną odczynników do transfekcji i inkubować w pomieszczeniu przez 20 minut, aby utworzyć kompleksy lipofektamin plazmidowych.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów tej mieszaniny bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej komórki. Delikatnie kołysz talerzem w przód iw tył, aby wymieszać. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez 48 do 72 godzin po transfekcji, przed oznaczeniem ekspresji transgenu.

Po wyizolowaniu wcześniej przygotowanego genomowego DNA, wygeneruj biblioteki głębokiego sekwencjonowania poprzez amplifikację PCR GDNA ze starterami ukierunkowanymi na cel i poza nim. Następnie użyj starterów indeksowych, aby oznaczyć każdą próbkę. Użyj maszyny sekwencjonowania nowej generacji, aby poddać biblioteki puli sekwencjonowaniu sparowanym na końcu.

Po wykonaniu badania przesiewowego Snypera można obliczyć procent rodzin rodzinnych, które przeżyły, dzieląc liczbę kolonii na selektywnej płytce LB przez liczbę kolonii na nieselektywnej płytce LB. Chociaż ten procent jest zwykle bardzo niski, gdy jest wykonywany z bibliotekami SP Cas9, prawdziwie dodatnie trafienia można wzbogacić, powtarzając ekran z pulą ocalałych. Reprezentatywny ekran Snypera pokazuje, że po trzecim ekranie uzyskuje się 100% wskaźnik przeżycia.

Transfekcje za pomocą RNP lub kodowanego plazmidem Snypera Cas9 mogą być wykonywane dla różnych celów, a wynikające z nich działania na miejscu i poza celem mierzone za pomocą sekwencjonowania amplikonów celów. W przypadku większości celów Snyper Cas9 wykazuje ten sam poziom aktywności na celu i wyższe współczynniki swoistości w porównaniu z typem dzikim. Skrócone SGRNA mogą być również używane w celu dalszej poprawy specyficzności.

Wyższa wydajność transformacji w pierwszym etapie czyszczenia jest bardzo ważna, aby nie stracić klonów o wysokiej specyficzności. Późniejsze etapy badań przesiewowych powtarzają się z mniejszą wydajnością transformacji, ponieważ klony są już wzbogacone na pierwszym etapie badania przesiewowego i istnieje mniejsze prawdopodobieństwo ich utraty. Będzie więcej niż jeden klon, który znaleźliśmy na ekranie Snypera.

Działania tych klonów w celach i poza nimi powinny być scharakteryzowane w jak największej liczbie różnych celów, aby wybrać klony o najlepszych wynikach. Dzięki tej metodzie naukowcy mogą poprawić specyficzność enzymów podobnych do Cas9 bez utraty docelowej aktywności. Ponadto naukowcy nie potrzebują żadnej wcześniejszej wiedzy na temat struktury białka, aby dokonać ulepszeń.