Name: Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę Sniper-screen do optymalizacji specyficzności Cas9 poprzez ukierunkowaną ewolucję. Technika ta pozwala zidentyfikować warianty białka z zachowaną aktywnością na celu i zmniejszonymi efektami niecelnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez granty Ministerstwa Nauki i ICT Korei (2017M3A9B4061406) oraz Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (MSIT) (numery grantów 2017M3A9B4061404 i 2018M3A9H3020844) dla Jungjoon K. Lee. Plazmid kodujący pGRG36 był prezentem od Nancy Craig (plazmid Addgene #16666), a p11-LacY-wtx1 był prezentem od Huimin Zhao.

<ol><li>Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+CRISPR-Cas+nuclease+specificity+using+truncated+guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proofreading+governs+CRISPR-Cas9+targeting+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhanced proofreading governs CRISPR-Cas9 targeting accuracy.</a> Nature. 550 (7676), 407-410 (2017).</li>
<li>Kleinstiver, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+CRISPR-Cas9+nucleases+with+no+detectable+genome-wide+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.</a> Nature. 529 (7587), 490-495 (2016).</li>
<li>Slaymaker, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+engineered+Cas9+nucleases+with+improved+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.</a> Science. 351 (6268), 84-88 (2016).</li>
<li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+CRISPR-Cas9+to+increase+its+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of CRISPR-Cas9 to increase its specificity.</a> Nature Communications. 9 (1), 3048(2018).</li>
<li>Vakulskas, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-fidelity+Cas9+mutant+delivered+as+a+ribonucleoprotein+complex+enables+efficient+gene+editing+in+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1216-1224 (2018).</li>
<li>Anderson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+off-target+analysis+in+genetically+engineered+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice.</a> Nature Methods. 15, 512-514 (2018).</li>
<li>Kim, S., Bae, T., Hwang, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+high-specificity+Cas9+variants+using+sgRNAs+with+matched+5%27+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Rescue of high-specificity Cas9 variants using sgRNAs with matched 5' nucleotides.</a> Genome Biology. 18 (1), 218(2017).</li>
<li>Kulcsar, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+enhanced+and+high+fidelity+SpCas9+nucleases+to+optimize+specificity+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Crossing enhanced and high fidelity SpCas9 nucleases to optimize specificity and cleavage.</a> Genome Biology. 18 (1), 190(2017).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfectly+matched+20-nucleotide+guide+RNA+sequences+enable+robust+genome+editing+using+high-fidelity+SpCas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Perfectly matched 20-nucleotide guide RNA sequences enable robust genome editing using high-fidelity SpCas9 nucleases.</a> Genome Biology. 18 (1), 191(2017).</li>
<li>McKenzie, G. J., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+easy+and+efficient%3A+site-specific+insertion+of+transgenes+into+enterobacterial+chromosomes+using+Tn7+without+need+for+selection+of+the+insertion+event%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event.</a> BMC Microbiology. 6, 39(2006).</li>
<li>Geissmann, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenCFU%2C+a+new+free+and+open-source+software+to+count+cell+colonies+and+other+circular+objects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OpenCFU, a new free and open-source software to count cell colonies and other circular objects.</a> PLoS One. 8 (2), e54072(2013).</li>
<li>Chen, Z., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+selection+method+for+directed+evolution+of+homing+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive selection method for directed evolution of homing endonucleases.</a> Nucleic Acids Research. 33 (18), e154(2005).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+RNAs+trigger+innate+immune+responses+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR RNAs trigger innate immune responses in human cells.</a> Genome Research. 28 (3), 367-373 (2018).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-Analyzer%3A+an+online+tool+for+assessing+genome+editing+results+using+NGS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-Analyzer: an online tool for assessing genome editing results using NGS data.</a> Bioinformatics. 33, 286-288 (2017).</li>
<li>Studier, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+Polymerase+to+Direct+Expression+of+Cloned+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes.</a> Methods in Enzymology. 185, 60-89 (1990).</li>
</ol>

Firma ToolGen złożyła wniosek patentowy (PCT/KR2017/006212) obejmujący ekran Sniper-screen (status: w toku, wynalazca: Jungjoon K. Lee). Jungjoon K. Lee, Joonsun Lee, Minhee Jung i Euihwan Jeong są pracownikami ToolGen, Inc.

Dla tych, którzy chcą uniknąć kłopotliwych procedur przesiewowych w celu uzyskania Sniper-Cas9, dostępne jest białko Sniper-Cas9 i plazmid kodujący. Za pomocą tych materiałów należy określić optymalną długość sgRNA, zapewniającą najwyższy współczynnik swoistości. Ponadto zaleca się dostarczanie Sniper-Cas9 i sgRNA w formacie RNP, ponieważ zwykle skutkuje to wyższym współczynnikiem swoistości niż dostarczanie w formacie plazmidu. W przeciwieństwie do Sniper-Cas9, inne zmodyfikowane warianty Cas9 nie są kompatybilne ze skróconymi sgRNA 6,7 lub dostarczaniem w formie RNP8 (z wyjątkiem HiFi-Cas9).
W przypadku ekranu snajperskiego wybór niedopasowanej sekwencji jest najważniejszym krokiem. Należy unikać wyboru niedopasowanego sgRNA, który jest związany z niską aktywnością rozszczepienia w kierunku sekwencji GOI . Jeśli nie, warianty Cas9 o poziomie swoistości WT nie rozszczepią genomowego DNA E. coli z niedopasowanym miejscem docelowym. Efekt ten spowoduje powstanie dużej liczby kolonii tła, co zagrozi całej procedurze przesiewowej.
Ponieważ E. coli ma szybki czas podwajania i wysoką wydajność przemiany w porównaniu z drożdżami, Sniper-screen jest korzystny w porównaniu z metodami przesiewowymi opartymi na drożdżach. Dodatkowo, Sniper-screen powinien być bardziej czuły niż inne systemy oparte na E. coli, w których niedopasowane miejsce jest przenoszone na plazmidzie: w naszym systemie jest jedna kopia genomowego DNA, a zatem tylko jedna kopia niedopasowanego miejsca, ale duża liczba plazmidów w jednej komórce E. coli .
Specyfika innych endonukleaz DNA, które indukują DSB, takich jak SaCas9 lub Cpf1s, można również poprawić, stosując Sniper-screen. Niestety, Sniper-screen nie może być używany do bezpośredniego zwiększania specyficzności edytorów bazowych, ponieważ edytory bazowe nie indukują DSB w genomowym DNA E. coli. Jako, że edytorzy bazowi używają nickase lub martwej wersji Cas9 w rdzeniu swojego systemu, specyfika edytorów bazowych może zostać zwiększona poprzez wykorzystanie trafień uzyskanych z Sniper-screen.

W tym artykule staramy się poprawić specyfikę Cas9 poprzez połączenie różnych strategii. Opracowano różne metody unikania niezamierzonych skutków CRISPR-Cas9. Na przykład, skrócone sgRNA mogą być użyte do osiągnięcia wyższej swoistości1. Dodatkowo, metoda dostarczania Cas9 może zostać zmieniona z formatu plazmidu na format RNP w celu uzyskania wyższej specyficzności2. Specyficzne reszty aminokwasowe białka Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) zostały zmodyfikowane zgodnie z racjonalnym projektem opisanym wcześniej3,4,5. Alternatywnie, reszty aminokwasowe zostały zmienione w sposób losowy, a warianty Cas9 o najwyższej specyficzności zostały zidentyfikowane za pomocą systemu badań przesiewowych drożdży6 lub E. coli7,8 system przesiewowy.
Jednak wiele grup zgłosiło, że warianty Cas9 zaprojektowane przy użyciu projektu w celu osłabienia niespecyficznej interakcji między Cas9 a substratem wykazują niską aktywność na celu7,8,9,10,11,12. Opracowaliśmy oparty na E. coli system ukierunkowanej ewolucji, Sniper-screen, do badania losowo zmutagenizowanych wariantów Cas9. System badań przesiewowych E. coli ma przewagę nad systemem drożdżowym ze względu na szybszy czas podwajania i wyższą wydajność przemiany E. coli.
Zarówno selekcja negatywna, jak i pozytywna, oparta na trzech różnych plazmidach i genie zainteresowania (GOI) zintegrowanym z genomem E. coli, jest używana w Sniper-screen. Warianty Cas9 ulegają ekspresji w systemie podwójnego promotora plazmidu o niskiej liczbie kopii CMV-PltetO1, dzięki czemu kandydaci zidentyfikowani w E. coli mogą być testowani w komórkach ssaków bez konieczności subklonowania. Rząd Indii wprowadza się do genomu E. coli za pomocą systemu transpozonów Tn7. Plazmid sgRNA, który zawiera wrażliwy na temperaturę początek replikacji, wyraża sgRNA ukierunkowany na GOI; jednak sekwencje sgRNA i GOI nie są idealnie dopasowane. Idealnie dopasowane miejsce docelowe sgRNA znajduje się na trzecim plazmidzie zawierającym gen ccdB, który koduje śmiertelny produkt zatruwający gyrazę. W tym systemie komórki wyrażające warianty Cas9 o wysokiej aktywności poza celem są usuwane, ponieważ pęknięcia dwuniciowe (DSB) są wprowadzane do niedopasowanego miejsca znajdującego się w genomowym DNA. Z drugiej strony, komórki wykazujące ekspresję wariantów Cas9 o niskiej aktywności docelowej są również usuwane z powodu śmiertelnej ekspresji genu ccdB. Poziom ekspresji wariantów Cas9 można zmienić poprzez zmianę stężenia anhydrotetracykliny (ATC), która dostosowuje siłę selekcyjną.
Doszliśmy do wniosku, że zlokalizowanie niedopasowanego miejsca docelowego sgRNA w genomowym DNA, a nie na plazmidzie, zwiększy czułość systemu. Zaletą tego podejścia jest to, że istnieje tylko jedno miejsce genomowe, podczas gdy w jednej komórce E. coli znajduje się wiele plazmidów, z których każdy zawiera miejsce docelowe.
Korzystając z tego systemu, zidentyfikowaliśmy wariant Cas9, Sniper-Cas9, który pokazuje działania na poziomie WT na celu i zmniejsza aktywność poza celem w porównaniu do WT Cas9. Sniper-Cas9 może osiągnąć jeszcze wyższe współczynniki specyficzności dzięki zastosowaniu skróconych sgRNA lub dostarczania opartego na RNP, a nie dostarczania opartego na plazmidzie.

<table><tbody><tr><td>Fosfataza alkaliczna, jelito cielęcia ()</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina Sól sodowa</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek anhydrotetracykliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37919 lub 94664</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk Roztwór przeciwgrzybiczy</td><td>Welgene</td><td>LS203-01</td><td>Składnik medialny</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Enzynomics</td><td>R003L</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4408</td><td></td></tr><tr><td>Diversify PCR Losowa mutageneza</td><td>Clontech</td><td>630703</td><td>Podatny na błędy zestaw do</td></tr><tr><td>PCR Zestaw do tasowania DNA Jena</td><td>Bioscience</td><td>PP-103</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Welgene</td><td>LM001-17</td><td>Pożywka hodowlana</td></tr><tr><td>Endura Elektrokompetentne komórki (DUO)</td><td>Lucigen</td><td>60242-2</td><td>E. coli elektrokompetentne komórki do przygotowania biblioteki</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Welgene</td><td>S101-01</td><td>Składnik pożywki</td></tr><tr><td>Gene Pulser II</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>E. Sprzęt do elektroporacji coli</td></tr><tr><td>GeneMorph II Zestaw do mutagenezy losowej</td><td>Agilent</td><td>200550</td><td>Podatny na błędy zestaw do PCR</td></tr><tr><td>Przygotowanie genomowego DNA zestaw</td><td>GenAll</td><td>106-152</td><td>gDNA-prep</td></tr> kit <tr><td>Glycerol</td><td>BioShop</td><td>GLY001.1</td><td></td></tr><tr><td>GP/MP Kuweta, 0,1 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>BR165-2089</td><td>E. sprzęt do elektroporacji</td></tr><tr><td>HEK293T komórka</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>Ludzka linia</td></tr><tr><td>komórkowa Siarczan kanamycyny</td><td>Acros Organics</td><td>450810500</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)- Arabinoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania LaboPass PCR</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>LaboPass Plasmid Mini</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>Zestaw do mini-przygotowania</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Formedium</td><td>LMM0202</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion Miller</td><td>Formedium</td><td>LMM0102</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td>Mieszanina montażowa Gibsona (izotermiczna in vitro rekombinacja)</td></tr><tr><td>System transfekcji Neon</td><td>Thermo</td><td>MPK5000</td><td>RNP Sprzęt do elektroporacji</td></tr><tr><td>System transfekcji Neon 10 &micro; L Kit</td><td>Thermo</td><td>MPK1096</td><td>RNP Sprzęt do elektroporacji</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740420.50</td><td>Zestaw do przygotowania środka</td></tr><tr><td>Oligo Clean & Koncentrator</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>Zestaw do oczyszczania DNA, który umożliwia elucję o małej objętości</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>LS31985070</td><td>Media transfekcyjne</td></tr><tr><td>p11-lacY-wtx1</td><td>Addgene</td><td>#123945</td><td></td></tr><tr><td>pgrg36</td><td>Addgene</td><td>#16666</td><td>E. Szczep mutatora coli</td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Pirofofataza</td><td>NEB</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw roztworów rybonukleotydów NEB</td><td></td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA</td><td>NEB</td><td>M0251L</td><td></td></tr><tr><td>Turbo Dnase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Enzynomics</td><td>R013L</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Red Kompetentny Komórki</td><td>Agilent</td><td>200129</td><td></td></tr></tbody></table>

użycie sniper-cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków crispr-cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

Rozwój zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego białka 9 (Cas9) związanego z krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) w modalności terapeutyczne wymaga unikania jego potencjalnie szkodliwych skutków poza celem. Opracowano kilka metod mających na celu zmniejszenie takich efektów. W tym miejscu przedstawiamy metodę ukierunkowanej ewolucji opartą na Escherichia coli o nazwie Sniper-screen w celu uzyskania wariantu Cas9 o zoptymalizowanej specyficzności i zachowanej aktywności na celu, o nazwie Sniper-Cas9. Korzystając z ekranu snajpera, można jednocześnie dokonać selekcji pozytywnej i negatywnej. Badanie przesiewowe można również powtórzyć z innymi sekwencjami RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA) w celu wzbogacenia o prawdziwie dodatnie trafienia. Dzięki zastosowaniu podwójnego promotora CMV-PltetO1 do ekspresji wariantów Cas9, można szybko sprawdzić wydajność biblioteki pulowej w komórkach ssaków. Opisano również metody zwiększające specyficzność Sniper-Cas9. Po pierwsze, wcześniej wykazano, że stosowanie skróconych sgRNA zwiększa swoistość Cas9. W przeciwieństwie do innych zaprojektowanych Cas9, Sniper-Cas9 zachowuje poziom aktywności typu dzikiego (WT) na celu w połączeniu z obciętymi sgRNA. Po drugie, dostarczenie Sniper-Cas9 w formacie rybonukleoproteiny (RNP) zamiast w formacie plazmidu jest możliwe bez wpływu na jego aktywność na miejscu.

Po przeprowadzeniu badania Sniper-screen procent przeżywalności kolonii oblicza się poprzez podzielenie liczby kolonii na płytce LB zawierającej chloramfenikol, kanamycynę, arabinozę i ATC (CKAA) przez liczbę kolonii na płytce LB zawierającej jedynie chloramfenikol i kanamycynę (CK). Procent ten był zazwyczaj bardzo niski, gdy badanie Sniper-screen przeprowadzano z bibliotekami SpCas9. Można wzbogacić wyniki prawdziwie dodatnie, powtarzając badanie z pulą kolonii, które przeżyły. W tym reprezentatywnym badaniu Sniper-screen uzyskano np. 100% przeżywalności po trzecim przesiewie (Rysunek 1). Transfekcje z użyciem RNP lub plazmidowo kodowanego Sniper-Cas9 można przeprowadzić dla różnych celów, a wynikającą z tego aktywność on-target i off-target zmierzyć za pomocą ukierunkowanego sekwencjonowania amplikonów (Rysunek 2). W większości celów Sniper-Cas9 wykazuje ten sam poziom aktywności on-target i wyższe współczynniki specyficzności w porównaniu z WT. W celu dalszej poprawy specyficzności można również zastosować skrócone sgRNA (Rysunek 3). Jednakże ich zastosowanie jest ograniczone do zaledwie kilku celów, ponieważ w większości przypadków skutkują one niską aktywnością on-target w porównaniu ze sgRNA o pełnej długości. Dlatego należy przetestować sgRNA o różnej długości (od 17- do 20-merów) i zmierzyć aktywność zarówno on-target, jak i off-target, aby zoptymalizować specyficzność.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Reprezentatywne przesiewania Sniper przeprowadzone z użyciem różnych bibliotek losowych wariantów Cas9. Biblioteka Mutator, biblioteka EP I i biblioteka EP II oznaczają biblioteki stworzone przy użyciu różnych zestawów komercyjnych. Pierwsze, drugie i końcowe oznaczają liczbę wykonanych przesiewań wzbogacających7. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Aktywność docelowa (on-target) i pozadocelowa (off-target) WT-Cas9 lub Sniper-Cas9 w połączeniu z 20-merową sekwencją naprowadzającą dostarczoną za pomocą plazmidu lub RNP. Wskaźniki specyficzności określono poprzez podzielenie aktywności docelowej przez aktywność pozadocelową. Słupki błędów wskazują SEM (n = 3)7. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Lee i wsp.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59202/59202fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Aktywności on-target i off-target Sniper-Cas9 w porównaniu do WT-Cas9 uzyskane przy użyciu sgRNA o różnych długościach celujących w miejsca FANCF01 i AAVS. Wskaźniki specyficzności wyznaczono poprzez podzielenie częstotliwości indeli w miejscach on-target przez częstotliwość w odpowiednich miejscach off-target. Wskazano sgRNA z dopasowaną guaniną na końcu 5' (GX18 lub GX19) oraz te z niedopasowaną guaniną (gX17, gX18, gX19 lub gX20). Wskaźników specyficzności nie obliczano, gdy znormalizowane aktywności on-target były &#60;70%7. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Lee et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59202/59202fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół optymalizujący CRISPR-Cas9 w celu osiągnięcia wyższej specyficzności bez utraty aktywności na miejscu. Używamy podejścia ukierunkowanej ewolucji zwanego Sniper-screen, aby znaleźć zmutowanego Cas9 o pożądanych cechach. Sniper-Cas9 jest kompatybilny ze skróconymi pojedynczymi przewodnikami RNA i dostarczaniem w formacie rybonukleoproteiny, dobrze znanymi strategiami osiągania wyższej specyficzności.

Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

W naturze Cas9 jest białkiem odpornościowym przeciwko atakującym wirusom, które ewolucja preferuje Cas9 o rozwiązłej specyficzności, która może rozszczepiać DNA wirusa spontanicznymi mutacjami. Zbudowaliśmy sztucznie ukierunkowany system ewolucji, który preferuje zoptymalizowany wariant Cas9 o wysokiej specyficzności. Zarówno negatywne, jak i pozytywne wybory działają jednocześnie w systemie selekcji snajperów.Warianty Cas9 ze zmniejszoną aktywnością poza celem, a także utrzymujące aktywność na celu, mogą być natychmiast badane. Mutacje zostały wprowadzone losowo w całej sekwencji Cas9, aby stworzyć bibliotekę do przesiewu. A to umożliwiło znalezienie mutacji w nieoczekiwanych pozycjach.Obecnie wielu badaczy ze środowisk akademickich i przemysłowych używa Cas9 typu Y do opracowywania środków terapeutycznych. Jednak specyfika Cas9 typu Y nie jest zoptymalizowana, co może skutkować ciasnym upakowaniem. U ludzi oznacza to nieoczekiwane mutacje w losowych genach, które mogą prowadzić do poważnych skutków ubocznych.Istnieje wiele enzymów podobnych do Cas9, które są opracowywane w terapiach. Nasza technika może być wykorzystana do poprawy specyficzności innych DNA i nukleidów, takich jak Jipinger, Tajlandia i Cas9, takich jak CPF1. Sprawienie, aby biblioteka była wystarczająco duża, jest kluczem do zwiększenia możliwości uzyskania wariantu z ważną funkcją.Upewnij się, że uzyskasz wysoką wydajność na etapie chłodzenia i użyj wysoce wydajnych kompetentnych ogniw. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj jeden nanogram zarówno plazmidu CCDB, jak i plazmidu SGRNA z podwójnymi niezgodnościami do pięćdziesięciu mikrolitrów rozmrożonych komórek BW25141 GOI. Delikatnie wymieszaj ogniwa za pomocą pipetowania i przenieś je do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji o średnicy 0,1 centymetra.Przekształć E-coli za pomocą dwóch plazmidów za pomocą elektroporacji. Natychmiast po zakończeniu elektroporacji dodać 250 mikrolitrów pożywki SOC. Delikatnie odpipetuj roztwór, aby wymieszać komórki i pożywkę, a następnie przenieś mieszaninę do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej.Odzyskaj przekształcone komórki i inkubuj je w temperaturze 32 stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając przez godzinę. Kontynuuj przygotowywanie komórek przesiewowych Snypera zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Gdy będziesz gotowy do przeprowadzenia badań przesiewowych Snypera, przekształć komórki przesiewowe Snypera za pomocą 100 nanogramów przygotowanych plazmidów wariantu Cas9 z każdej biblioteki, korzystając z procesu elktroporacji, który został wcześniej opisany.Następnie przenieś 250 mikrolitrów komórek do świeżej 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Dodaj 250 pikogramów ATC do końcowego stężenia 10 nanogramów na mililitr. Odzyskaj zarówno komórki zawierające ATC, jak i wolne od ATC, inkubując je w temperaturze 32 stopni Celsjusza przez godzinę z delikatnym wstrząsaniem.Umieść 25 mikrolitrów odzyskanych komórek wolnych od ATC na płytce agarowej LB, zawierającej chloramfenikol i kanamycynę. Dodać ATC do odzyskanych komórek zawierających ATC do końcowego stężenia 100 nanogramów na mililitr na płytce agarowej LB o średnicy 245 milimetrów. Natychmiast umieść komórki zawierające ATC na płytce zawierającej agar LB zawierającej chloramfenikol, kanamycynę i arabinozę.Inkubuj wszystkie płytki przez noc w temperaturze 32 stopni Celsjusza. Następnego dnia sfotografuj talerze. Korzystając z otwartego oprogramowania CFU, policz liczbę żywotnych kolonii, upewniając się, że liczba kolonii na nieselektywnej płytce jest co najmniej dziesięć razy większa niż różnorodność biblioteki, aby objąć wszystkie warianty.Wyciągnij kolonie, które przetrwały na wybranych płytach ze wszystkich trzech bibliotek. Przenieś te połączone kolonie do 250 mililitrów pożywki LB, uzupełnionej chloramfenikolem i inkubuj przez noc w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Najpierw załaduj oprogramowanie do wyszukiwania CAS OF, aby wybrać witryny docelowe.Wybierz typ PAM odpowiedni dla określonego typu Cas9 i genomu docelowego. Wypełnij kartę sekwencji zapytań. Wybierz numer niezgodności i kliknij przycisk Prześlij.Po kilku sekundach pojawią się witryny docelowe i niedocelowe. Ogólnie rzecz biorąc, wybieraj witryny niedocelowe z jedną lub trzema niezgodnościami. Następnie uporządkuj oligonukleotydy CRRNA i Track RRNA za pomocą sekwencji szablonów i amplifikuj szablon zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Przeanalizuj dwa mikrolitry amplifikowanego DNA matrycy na 2% żelu agarozowym, a następnie oczyść matrycę. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 0,5 mikrolitra DNAzy i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 30 minut, a następnie oczyść SGRNA.Następnie potraktuj 10 mikrogramów transkrybowanego RNA in vitro 250 jednostkami fosfatazy alkalicznej jelita cielęcia przez trzy godziny w temperaturze 3 stopni Celsjusza, w obecności 100 jednostek inhibitora RNAzy, a następnie oczyść poddane działaniu SGRNA. Po pierwsze, utrzymuj limfocyty T HEK293 w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie wymieszaj dwa mikrogramy białka typu dzikiego lub Snyper Cas9 z dwoma mikrogramami SGRNA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, aby uzyskać kompleksy RNP.Trypsynizuj i policz komórki, a następnie umyj je i przygotuj w buforze do elektroporacji, jak opisano w protokole tekstowym. Elektroportować kompleksy RNP do komórek za pomocą jednego impulsu o napięciu 1300 woltów przez 30 milisekund. Bezpośrednio po elektroporacji umieść komórki na 48-dołkowej płytce wypełnionej 500 mikrolitrami DMEM, uzupełnionymi 10% FBS i 1% antybiotykami.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Utrzymuj limfocyty T HEK293 w DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% antybiotykami w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Dzień przed transfekcją trypsynizuj i policz komórki.Jeśli pracujesz w skali 48-dołkowej, płytka 10 000 komórek na dołek i 250 mikrolitrów kompletnej pożywki wzrostowej. Używając odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, przygotuj 250 nanogramów plazmidu P3S Cas9 i 250 nanogramów SGRNA do transfekcji. Następnie wymieszaj plazmidy w 25 mikrolitrach MEM bez surowicy.Rozcieńczyć jeden mikrolitr odczynnika do transfekcji 25 mikrolitrami MEM bez surowicy. Inkubuj tę mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Połączyć mieszaninę plazmidów z mieszaniną odczynników do transfekcji i inkubować w pomieszczeniu przez 20 minut, aby utworzyć kompleksy lipofektamin plazmidowych.Następnie dodaj 50 mikrolitrów tej mieszaniny bezpośrednio do każdej studzienki zawierającej komórki. Delikatnie kołysz talerzem w przód iw tył, aby wymieszać. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze dwutlenku węgla przez 48 do 72 godzin po transfekcji, przed oznaczeniem ekspresji transgenu.Po wyizolowaniu wcześniej przygotowanego genomowego DNA, wygeneruj biblioteki głębokiego sekwencjonowania poprzez amplifikację PCR GDNA ze starterami ukierunkowanymi na cel i poza nim. Następnie użyj starterów indeksowych, aby oznaczyć każdą próbkę. Użyj maszyny sekwencjonowania nowej generacji, aby poddać biblioteki puli sekwencjonowaniu sparowanym na końcu.Po wykonaniu badania przesiewowego Snypera można obliczyć procent rodzin rodzinnych, które przeżyły, dzieląc liczbę kolonii na selektywnej płytce LB przez liczbę kolonii na nieselektywnej płytce LB. Chociaż ten procent jest zwykle bardzo niski, gdy jest wykonywany z bibliotekami SP Cas9, prawdziwie dodatnie trafienia można wzbogacić, powtarzając ekran z pulą ocalałych. Reprezentatywny ekran Snypera pokazuje, że po trzecim ekranie uzyskuje się 100% wskaźnik przeżycia.Transfekcje za pomocą RNP lub kodowanego plazmidem Snypera Cas9 mogą być wykonywane dla różnych celów, a wynikające z nich działania na miejscu i poza celem mierzone za pomocą sekwencjonowania amplikonów celów. W przypadku większości celów Snyper Cas9 wykazuje ten sam poziom aktywności na celu i wyższe współczynniki swoistości w porównaniu z typem dzikim. Skrócone SGRNA mogą być również używane w celu dalszej poprawy specyficzności.Wyższa wydajność transformacji w pierwszym etapie czyszczenia jest bardzo ważna, aby nie stracić klonów o wysokiej specyficzności. Późniejsze etapy badań przesiewowych powtarzają się z mniejszą wydajnością transformacji, ponieważ klony są już wzbogacone na pierwszym etapie badania przesiewowego i istnieje mniejsze prawdopodobieństwo ich utraty. Będzie więcej niż jeden klon, który znaleźliśmy na ekranie Snypera.Działania tych klonów w celach i poza nimi powinny być scharakteryzowane w jak największej liczbie różnych celów, aby wybrać klony o najlepszych wynikach. Dzięki tej metodzie naukowcy mogą poprawić specyficzność enzymów podobnych do Cas9 bez utraty docelowej aktywności. Ponadto naukowcy nie potrzebują żadnej wcześniejszej wiedzy na temat struktury białka, aby dokonać ulepszeń.

using-sniper-cas9-to-minimize-off-target-effects-crispr-cas9-without

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Ukierunkowana edycja genomu w systemie modelowym Danio rerio (danio pręgowany) została znacznie ułatwiona dzięki pojawieniu się metod opartych na CRISPR. W niniejszym artykule opisujemy uproszczony, solidny protokół generowania i identyfikacji nonsensownych alleli pochodzących z CRISPR, który obejmuje test mobilności heterodupleksowej i identyfikację mutacji przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Wydajna produkcja i identyfikacja nokautów genów generowanych przez CRISPR/Cas9 w systemie modelowym Danio rerio

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Skrupulatne i ustrukturyzowane podejście jest stosowane do selekcji odpornych i wrażliwych genów promieniowania poprzez zastosowanie metody przesiewowej CRISPR/Cas9 obejmującej cały genom. Protokół ten ma również potencjał, aby służyć jako wszechstronne ramy dla innych przedsięwzięć badawczych badających mechanizmy oporności na klinicznie podawane leki chemiczne.

Badanie przesiewowe CRISPR obejmujące cały genom do odkrywania genów radiowrażliwych i odpornych na promieniowanie

Poznaj metodę Sniper-screen do optymalizacji specyficzności Cas9 poprzez ukierunkowaną ewolucję. Technika ta pozwala zidentyfikować warianty białka z zachowaną aktywnością na celu i zmniejszonymi efektami niecelnymi.

Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję (Wideo) | JoVE Journal

Użycie Sniper-Cas9 w celu zminimalizowania niecelnych skutków CRISPR-Cas9 bez utraty aktywności na celu poprzez ukierunkowaną ewolucję

Przeglądaj więcej filmów