Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Test ten można zastosować do ilościowego określenia cytotoksyczności za pośrednictwem limfocytów T wobec dwóch odrębnych epitopów peptydowych antygenów nowotworowych jednocześnie. Charakter tego testu in vivo pozwala na pomiar cytotoksycznej funkcji limfocytów T w nienaruszonej architekturze wtórnego narządu limfatycznego. Ponadto obserwowane zabijanie jest dokładnym odzwierciedleniem bezwzględnej liczby limfocytów T, a nie tylko ich częstotliwości, co może być mylące.

Test ten umożliwia badanie odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T na immunodominujące i subdominujące antygeny nowotworowe. W związku z tym dostarcza cennych informacji podczas projektowania szczepionki, a także protokołów immunoterapeutycznych w przypadku raka. Nasz protokół został dostosowany do badania odpowiedzi limfocytów T CD8.

Można go jednak zmodyfikować w celu pomiaru cytotoksyczności wywoływanej przez inne typy komórek zabójczych, takie jak komórki NK i wrodzone limfocyty T. Test ten wymaga doświadczenia w technice aseptycznej, obchodzeniu się z tkankami myszy, przygotowywaniu komórek docelowych, a także wiedzy specjalistycznej w zakresie iniekcji do żył ogonowych. Należy nabyć ten zestaw umiejętności przed przystąpieniem do testu zabijania in vivo.

Gdy linia komórek nowotworowych przylegających do antygenu T stanie się w pełni zlewająca się lub nieco nadmiernie zlewająca, delikatnie przepłucz monowarstwę sterylnym, ciepłym PBS i odłącz komórki nowotworowe za pomocą 0,25% trypsyny EDTA w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Postukaj kilkakrotnie w boki kolby hodowlanej, aby uwolnić pozostałe przylegające komórki i zatrzymaj reakcję po około pięciu minutach z dodatkiem pięciu mililitrów pożywki DMEM. Odpipetuj roztwór komórkowy kilka razy przed przefiltrowaniem zawiesiny komórek przez sitko do komórek o porach 70 mikrometrów do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 10 mililitrach sterylnego, zimnego PBS na pierwsze z trzech płukań w tych samych warunkach. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić komórki w tempie cztery razy 10 do siedmiu komórek na mililitr sterylnego stężenia PBS i wstrzyknąć 500 mikrolitrów zawiesiny komórek nowotworowych z dodatnim antygenem T dootrzewnowo każdemu sześcio- do 12-tygodniowemu biorcy myszy C57 Black 6. W celu przygotowania docelowych splenocytów umieść uśpioną mysz dawcy w pozycji leżącej i spryskaj zwierzę 70% etanolem.

Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek podnieś skórę i wykonaj małe brzuszne nacięcie linii środkowej. Przetnij skórę w sposób krzyżowy, aby odsłonić otrzewną, i użyj kleszczy, aby podciągnąć otrzewną w sposób podobny do namiotu, nie łapiąc żadnego z narządów wewnętrznych. Rozetnij otrzewną, aby odsłonić jamę otrzewnej i delikatnie przenieś śledzionę do 15-mililitrowego młynka do tkanek Dounce zawierającego pięć mililitrów sterylnego PBS.

Użyj tłoka, aby zastosować ręczny nacisk, aż tkanka śledziony rozproszy się w czerwoną jednorodną zawiesinę komórek, a następnie przenieś homogenat do 15-mililitrowej probówki. Zebrać zawiesinę przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w czterech mililitrach buforu lizyny potasowej chlorku amonu w celu wyeliminowania erytrocytów. Po czterech minutach zatrzymaj proces z ośmioma mililitrami kompletnego podłoża i przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko do komórek o porach 70 mikrometrów do nowej 50-mililitrowej probówki.

Oddzielić białe krwinki od resztek czerwonych krwinek przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 12 mililitrach kompletnego podłoża. Następnie podziel zawiesinę splenocytów na trzy równe czteromililitrowe podwielokrotności. W celu kodowania peptydów docelowych splenocytów, pulsuj jedną podwielokrotność splenocytu jednym mikromolem nieistotnego peptydu, jedną podwielokrotnością jednym mikromolem peptydu miejsca I i jedną podwielokrotnością jednego mikromola peptydu miejsca IV przez jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Pod koniec inkubacji usunąć nadmiar peptydu przez odwirowanie i przemyć splenocyty pulsacyjne peptydowe dwa razy w 12 mililitrach sterylnego, zimnego PBS na pomycie na probówkę. Po drugim płukaniu ponownie zawieś komórki w czterech mililitrach świeżego, sterylnego PBS na probówkę. Dodaj 025, 0,25 i dwumikromolową CFSE odpowiednio do nieistotnych, pulsacyjnych peptydowych zawiesin splenocytów w miejscu I i IV.

Umieść probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut z ręcznym odwróceniem raz na pięć minut. Pod koniec inkubacji dodać trzy mililitry inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej do każdej probówki, aby zatrzymać reakcję CFSE i doprowadzić końcową objętość w każdej probówce do 15 mililitrów za pomocą PBS. Następnie zbierz komórki znakowane barwnikiem przez odwirowanie przez dwa płukania w 12 mililitrach świeżego, sterylnego PBS na pranie.

Aby potwierdzić odpowiednie oznakowanie CFSE docelowych splenocytów, ponownie zawieś osad w trzech mililitrach PBS i wymieszaj z delikatnym wirowaniem. Przenieś 10 mikrolitrów z każdej zawiesiny komórek znakowanej CFSE do pojedynczej pięciomililitrowej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją fluorescencji polistyrenu o okrągłym dnie lub probówki FACS zawierającej PBS i załaduj probówkę do cytometru przepływowego wyposażonego w laser o długości fali 488 nm. W oprogramowaniu cytometru przepływowego utwórz bramkę limfocytów w oparciu o właściwości rozpraszania do przodu i rozpraszania bocznego komórek przed uzyskaniem 5 000 zdarzeń mieszczących się w bramce limfocytów w kanale fluorescencji 1.

W populacji rodzicielskiej CFSE dodatniej narysuj dodatkowe bramki histogramu, aby zidentyfikować subpopulacje CFSE niskie, pośrednie CFSE i wysokie CFSE. Następnie potwierdź równą lub prawie równą liczbę zdarzeń w trzech bramkach dla pozostałych dwóch probówek oznaczonych komórek. W celu wstrzyknięcia komórek docelowych należy najpierw delikatnie zwirować probówki źródłowe i połączyć trzy zawiesiny komórek znakowane CFSE w nowej probówce w równych proporcjach.

Uzupełnij zawartość probówki sterylnym PBS i zbierz komórki przez odwirowanie w celu zliczenia. Następnie dostosuj objętość do jeden razy 10 do siedmiu zmieszanych komórek docelowych na 200 mikrolitrów PBS na stężenie biorcy i wstrzyknij 200 mikrolitrów objętości zawiesiny komórkowej do żyły ogonowej każdej myszy C57 Black 6 biorcy. Dwie lub cztery godziny po wstrzyknięciu należy usunąć i przetworzyć śledzionę każdego biorcy, jak pokazano, a następnie ponownie zawiesić wyizolowane białe krwinki w trzech mililitrach PBS na śledzionę.

Przenieś około 10 razy do siedmiu komórek z każdej przetworzonej śledziony do czystej probówki FACS i natychmiast uruchom komórki na cytometrze przepływowym, jak wykazano, aby zabramkować populacje komórek docelowych o niskim, średnim i wysokim CFSE. Następnie zbierz w sumie 2 000 zdarzeń o niskim poziomie CFSE w kanale Fluorescencji 1 i oblicz specyficzną lizę każdej pokrewnej populacji komórek docelowych zgodnie ze wzorem szczegółowo opisanym w tekście. W tym reprezentatywnym eksperymencie sukces wyczerpania naturalnie występujących regulatorowych limfocytów T u myszy, którym wstrzyknięto przeciwciało monoklonalne anty-CD25, potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej.

Zgodnie z oczekiwaniami, u naiwnych myszy można było wykryć prawie równe piki odpowiadające kontrolnym i pokrewnym komórkom docelowym. W przeciwieństwie do tego, komórki docelowe wyświetlające Ośrodek IV były prawie całkowicie nieobecne u myszy z antygenem T, niezależnie od ich wcześniejszego leczenia przeciwciałem monoklonalnym anty-CD25 lub PBS. Co ciekawe, naturalnie występujące zubożenie limfocytów T reg przez przeciwciało monoklonalne anty-CD25 wzmacniało in vivo cytotoksyczną lizę komórek docelowych impulsowych komórek docelowych za pośrednictwem limfocytów T.

W tym drugim reprezentatywnym badaniu blokada programowanej śmierci 1 wzmocniła subdominujące komórki T CD8-dodatnie odpowiedzi specyficzne dla komórek T z jednym i dwoma ukośnikami, co sugeruje, że zakłócanie interakcji liganda programowanej śmierci 1 / programowanej śmierci 1 może indukować rozprzestrzenianie się epitopów w przeciwnowotworowych odpowiedziach limfocytów T CD8-dodatnich. Podczas oznaczania komórek dawcy za pomocą CFSE bardzo ważne jest, aby upewnić się, że stężenia są precyzyjne. W przeciwnym razie może to spowodować nakładanie się pików histogramu, co utrudni, jeśli nie uniemożliwi, wymagane obliczenia i interpretację danych.

Istotna będzie optymalizacja testów cytotoksyczności in vivo w celu ilościowego określenia funkcji efektorowych wywoływanych przez różne typy komórek zabójczych, które rozpoznają antygeny peptydowe i niepeptydowe u tego samego gospodarza.