Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed ^{(TB / TB)} i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Nasz protokół pozwala nam zwizualizować, jak fluorescencyjnie znakowane komórki reagują na impuls zapalny obwodowy u żywego zwierzęcia w czasie rzeczywistym. Obrazowanie 2-fotonowe umożliwia wizualizację w głąb tkanki żywej próbki, zachowując integralność ich komórek i mikrośrodowiska oraz zapewniając dokładne odwzorowanie systemu biologicznego. Oddychanie porusza łapą w czasie, powodując rozmycie i utratę płaszczyzny ogniskowej.

Pamiętaj, aby mocno przymocować łapę taśmą do stabilnej powierzchni przed obrazowaniem. W tym celu musisz być w stanie znaleźć odpowiednią płaszczyznę zainteresowania, upewnić się, że obiektyw znajduje się blisko łapy bez dotykania i znajduje się bezpośrednio nad miejscem wstrzyknięcia. Przed rozpoczęciem procedury włącz system wielofotonowy i wybierz subiektywny 25X.

Umieść aparat stereotaktyczny na stoliku mikroskopu wielofotonowego i podłącz aparat do maszyny do podawania znieczulenia. Umieść kawałek matowego czarnego papieru na powierzchni aparatu jako punkt połączenia łapki myszy. Ustaw skaner rezonansowy ze stałym obszarem skanowania 512 na 512 mikrometrów.

Dostosuj lasery wzbudzające do długości fal wzbudzenia 930 i 1, 100 nanometrów odpowiednio dla sygnałów białek fluorescencyjnych zielonych i czerwonych. Użyj zwierciadła dichroicznego o długości od 690 do 1 050 nanometrów, aby skierować ścieżkę światła obu laserów wzbudzających na pojedynczy obiektyw, umożliwiając odbicie lasera wzbudzającego o długości 930 nanometrów do głównego skanera, a laser dostrojony o długości 1 100 nanometrów przechodzi bezpośrednio do głównego skanera. Następnie ustaw moc lasera FITC na 5%, a zielone białko fluorescencyjne na 20% i wyłącz górne światła.

W przypadku obrazowania in vivo znieczulij mysz i opisz w protokole tekstowym. Potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca u znieczulonej myszy i umieść mysz w aparacie stereotaktycznym z dostępem do stożka nosowego. Użyj czarnej taśmy, aby mocno przymocować tylną łapę do kawałka czarnego papieru na obszarach zarówno proksymalnych, jak i dystalnych w stosunku do obszaru zainteresowania, upewniając się, że podeszwowa powierzchnia łapy jest drożna i skierowana w stronę celu.

Umieść dużą ilość lubrykantu na bazie wody na podeszwowej powierzchni łapy. Przyłóż obiektyw do smaru, aby utworzyć kolumnę płynu między łapą a obiektywem. Użyj światła wzbudzającego FITC, aby skupić się na warstwie skórnej łapy, potwierdzając, że można uwidocznić fibroblasty oznaczone tandemowymi dimerami pomidorów.

Zobrazuj obszar komórek znajdujących się tuż pod podeszwową powierzchnią tylnej łapy za pomocą obu laserów. Uzyskaj 15-minutowy upływ czasu składający się z około pięciu do 10 plasterków Z przy około jednym mikrometrze na wycinek, aby ustalić podstawową reprezentację środowiska. Po uzyskaniu obrazowania wyjściowego załaduj szklaną strzykawkę Hamiltona o pojemności 25 mikrolitrów z pięcioma mikrogramami sprzężonego lipopolisacharydu FITC lub LPS na 20 mikrolitrów PBS.

Roztwór należy podawać we wstrzyknięciu doroślinnym do doświadczalnej tylnej łapy, nie naruszając pozycji łapy. Następnie zobrazuj obszar komórek znajdujący się tuż pod podeszwową powierzchnią tylnej łapy za pomocą obu laserów. Uzyskaj 60 do 120 minut upływ czasu około pięciu do 10 warstw Z przy około jednym mikrometrze na plasterek, aby zidentyfikować wewnątrzpodeszwowy wychwyt LPS FITC za pośrednictwem komórki.

Ponieważ nie ma naturalnej fluorescencji komórek w warstwie skórnej, można zaobserwować niezliczoną ilość komórek w warstwie skórnej tylnej łapy przyjmujących fluorescencyjnie oznakowany LPS po wstrzyknięciu dopodeszwowym u myszy typu dzikiego. Po wstrzyknięciu LPS FITC tylko fibroblasty specyficzne dla białka pierwszego dodatniego fibroblastów wyrażające receptor toll podobny do czwartego wiążą i wychwytują wstrzyknięte białko o wysokim poziomie kolokalizacji z tandemowym dimerem pomidorowym wyrażanym przez te komórki. W przeciwieństwie do tego, myszy, które mają receptor podobny do obciążenia czwartego wyjęty z całego ciała, nie wiążą się i nie wychwytują LPS po wstrzyknięciu.

Rzeczywiście, sylwetki komórek są widoczne po wstrzyknięciu LPS FITC, co wskazuje, że lek rozprasza się w płynie śródmiąższowym wokół komórek, ale w rzeczywistości nie jest wiązany przez receptor. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać w tym protokole, jest upewnienie się, że łapa jest unieruchomiona, aby nie było zniekształceń w filmie spowodowanych ruchem lub oddychaniem. Za pomocą tej procedury można śledzić rekrutację fluorescencyjnie znakowanych komórek do obszaru po urazie oraz zmiany morfologiczne w odpowiedzi komórki na bodziec w czasie.

Tak więc obrazowanie 2-fotonowe pozwala naukowcom połączyć genetyczne myszy reporterowe i fluorescencyjnie znakowane związki, aby ocenić, co dzieje się u żywego zwierzęcia po wstrzyknięciu.