Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Protokół ten pozwala na identyfikację i izolację nowotworowych komórek macierzystych w solidny sposób przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej. Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbki guza może stanowić platformę do kierowania klinicznym zastosowaniem określonych terapii do poszczególnych nowotworów, przewidywania oporności i w konsekwencji nawrotu. Aby przygotować nieprzylegające kultury zawiesinowe, należy najpierw pokryć pojemniki do kultur komórkowych 50 mikrolitrami na centymetr kwadratowy w proporcji 15 miligramów na mililitr poliHEMA i umieścić pojemniki w piecu suszącym o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej dwa dni.

Gdy pojemniki są całkowicie suche, umyj 80 do 90 procent zlewającej się hodowli komórek rakowych z PBS i odłącz komórki od jednego do dwóch mililitrów trypsyny EDTA. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zatrzymaj reakcję za pomocą dwóch do czterech mililitrów świeżej pożywki do hodowli komórkowych i umyj zdysocjowane komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce hodowlanej w celu policzenia i rozcieńczyć komórki w pożywce do hodowli w świeżej kuli zawierającej dwa procent metylocelulozy przy stężeniu od 500 do 2000 komórek na centymetr kwadratowy na szalkę hodowlaną.

Aby zapewnić monokonoliniowość sfery, wysiewaj każdą linię komórkową o niskiej gęstości w środowisku wolnym od zakotwiczenia. Następnie wysiewaj komórki na płytkach pokrytych poliHEMA na pięciodniową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla, dodając dziesięć nanogramów na mililitr naskórkowego czynnika wzrostu i dziesięć nanogramów na mililitr podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów do pożywki do hodowli komórkowej co dwa dni. Trzy do dwunastu dni po posiewie trójwymiarowe kolonie komórek w kształcie kuli należy obserwować pod mikroskopem świetlnym.

Aby uzyskać uzyskane populacje przylegające, przenieś kulki do nowej płytki hodowlanej w odpowiednich warunkach hodowli dla oryginalnej linii komórek rakowych. Po jednym do dwóch dni hodowli należy zaobserwować wzrost monowarstwy komórek wokół przylegających kulek o morfologii podobnej do linii komórkowej, z której pochodzi. Aby określić zdolność do formowania kul interesującej nas linii komórek rakowych, po zakończeniu protokołu formowania kuli, zbierz kulki przez wirowanie.

Delikatnie zawiesić kulkę w świeżym podłożu i użyć hemocytometru, aby policzyć liczbę kulek o średnicy większej niż 40 mikrometrów. Następnie oblicz procentowy stosunek uzyskanej kuli do liczby początkowo platerowanych komórek. Aby określić zdolność do samoodnawiania się interesującej nas linii komórkowej, zbierz kulki przez wirowanie i delikatnie ponownie zawieś osad kuli w trypsynę EDTA na pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji dodać enzym i pożywkę aktywacyjną do probówki, a następnie pipetować roztwór, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Używając hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanowego, policz żywe komórki w zawiesinie i umieść je na płytkach pokrytych poliHEMA w celu przeprowadzenia testu formowania kuli, jak pokazano powyżej. Po ośmiu dniach użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę kulek o średnicy większej niż 40 mikrometrów i obliczyć procentowy stosunek uzyskanych kulek do liczby początkowo platerowanych komórek.

Aby ocenić obszar zajmowany przez kulki, umieść szalkę hodowlaną na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w moduł akwizycji obrazu i wybierz powiększenie od 100X do 400X. Uzyskaj obrazy z co najmniej dziesięcioma losowymi polami na warunek i użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu, aby narysować obszary zainteresowania wokół sfer. Następnie zmierz obszar każdego obszaru zainteresowania w pikselach i oblicz obszar projekcji sferycznej jako średni obszar mierzonych pikseli.

Funkcjonalna charakterystyka zdolności do tworzenia kuli, samoodnawiania się i obszaru projekcji nowotworowych komórek macierzystych pozwala na porównanie ich odległego rodowodu i tkanki pochodzenia. Protokół formowania kuli pozwala na uzyskanie kulistych kolonii w zawiesinie z kilku linii komórkowych endometrium i raka piersi lub po delikatnym trawieniu enzymatycznym tkanek z próbek ludzkiego guza. Zarówno sfery endometrium, jak i raka piersi powodują powstanie monowarstwy komórek o morfologii podobnej do ich linii komórkowej pochodzenia jeden do dwóch dni po posiewie.

W tych reprezentatywnych eksperymentach komórki MCF-7 raka piersi z dodatnim receptorem hormonalnym wykazały wyższą zdolność tworzenia kul, zdolność do samoodnawiania się i obszar projekcji niż potrójnie ujemne komórki raka piersi HCC1806. Oprócz wzbogacania nowotworowych komórek macierzystych za pomocą protokołu formowania kuli, zalecamy dalszą ocenę ich macierzystej przy użyciu metod uzupełniających, takich jak cytometria przepływowa. W tej reprezentatywnej analizie kulek uzyskanych z linii komórek endometrium, cztery populacje komórek wyrażających markery rakowych komórek macierzystych zostały zidentyfikowane w każdej linii komórkowej za pomocą cytometrii przepływowej.

Ocena sfer nowotworowych za pomocą innych technik biologii molekularnej może potwierdzić macierzystość i plastyczność nowotworowych komórek macierzystych oraz ułatwić opracowanie terapii celowanych. Analiza Western blot po delikatnym pobraniu kulek ujawniła również fenotyp komórek macierzystych raka dla kulek wygenerowanych in vitro. Ten protokół izolacji przyczynia się do naszego zrozumienia znaczenia nowotworowych komórek macierzystych, co klinicznie przekłada się na zrozumienie nawrotów, przerzutów i oporności na leczenie.