Zastosowanie komórek Drosophila S2 do obrazowania podziału komórek na żywo

Nasz protokół może być używany do określania przestrzennych i czasowych zdarzeń dynamicznych podczas mitozy, a także może być używany do wizualizacji efektów regulatorów mitotycznych w czasie rzeczywistym. Obrazowanie dwukolorowe umożliwia jednoczesną analizę dwóch markerów molekularnych. Na przykład możemy zwizualizować mikrotubule wrzeciona mitotycznego i kinetyczną strukturę rdzenia replikowanych chromosomów.

Aby indukować ekspresję białek fluorescencyjnych, cztery dni po leczeniu interferencyjnym RNA, należy wystawić indukowalne komórki transfekowane promotorem metalo-tymaniny na końcowe stężenie 500 mikromolowego siarczanu miedzi przez 24 do 36 godzin. Aby przygotować komórki wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego do obrazowania, przenieś komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów, a po zliczeniu osadnij komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w świeżej, podgrzanej w temperaturze 25 stopni Celsjusza karcie SIM, uzupełnionej 10% FBS, w stężeniu dwa razy 10 do 6 komórek na mililitr i potraktować komórki dodatkowym 500 mikromolowym siarczanem miedzi.

Następnie dodaj od 200 do 500 mikrolitrów komórek do jednego dołka wielodołkowej komory żywych komórek i umieść komorę na odwróconym stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Podczas gdy komórki osiadają w komorze, otwórz oprogramowanie do obrazowania żywych komórek i kliknij nowy i eksperymentuj. Aby wstawić pętlę poklatkową, na której zostaną zrobione zdjęcia, kliknij ikonę pętli poklatkowej.

Ustaw interwał na sekundy i podziel żądaną całkowitą długość eksperymentu w sekundach przez interwał, aby ustawić liczbę cykli. Pozwól, aby pętla powtarzała się przez żądany całkowity okres czasu. Aby wstawić test ostrości w podczerwieni w celu utrzymania ostrości obiektywu, kliknij ikonę ruchu XY i wybierz opcję Kompensacja dryfu Z, aby dodać krok kompensacji dryfu Z w warstwie pętli poklatkowej.

Aby zezwolić na pobranie obrazu wielokanałowego, kliknij ikonę grupy wielokanałowej, aby dodać warstwę grupy wielokanałowej, a następnie kliknij ikonę dodawania pętli stosu Z, aby dodać warstwę pętli stosu Z. Następnie ustaw żądany rozmiar kroku i liczbę plasterków, a także ustaw ekspozycję każdego kanału na jak najniższe, aby zminimalizować wybielanie zdjęć. Aby zobrazować podział komórki, wybierz obiektyw 40 lub 60-krotny zanurzenie w oleju oraz kanał florescencji mCherry, a następnie ustaw obiektyw wzdłuż górnej lub dolnej części studzienki.

Następnie odsuń się od pionowej przegrody studzienki, aby uniknąć zakłóceń w kroku kompensacji dryftu Z. Zlokalizuj komórkę lub komórki w późnej fazie G2 lub wczesnej fazie M i kliknij przycisk podglądu na żywo, aby rozpocząć przeglądanie komórek na ekranie oprogramowania. Znalezienie odpowiednich komórek na przejściu G2 do M jest kluczem do obrazowania podziału komórki.

Zlokalizuj komórkę z nienaruszonym jądrem i dokładnie dwoma centrosomami, aby uzyskać najlepsze wyniki. Za pomocą pokrętła precyzyjnej ostrości mikroskopu ustaw ostrość na interesujących Cię komórkach i kliknij znajdź przesunięcie, aby ustawić kontrolę ostrości w podczerwieni. Kliknij start, aby uruchomić program do obrazowania poklatkowego, a następnie wybierz żądany kanał i dostosuj średnie intensywności pikseli, aby w razie potrzeby dostosować histogramy, aby wyraźnie zwizualizować interesujące komórki.

Sprawdź komórki po 15 do 20 minutach, aby potwierdzić, że doszło do rozpadu otoczki jądrowej, co zostało stwierdzone przez zniknięcie okrągłej, ciemnej załamanej plamki w pobliżu środka komórki. Po kolejnych 15 do 20 minutach sprawdź, czy nastąpił początek anafazy. Następnie zatrzymaj program i zapisz plik.

Aby określić czas rozpadu otoczki jądrowej do początku anafazy, kliknij przycisk ramki w górę, aby określić czas rozpadu otoczki jądrowej i czas początkowej separacji chromosomów w minutach, a następnie odejmij czas rozpadu od czasu rozpoczęcia, aby uzyskać rozpad otoczki jądrowej do czasu początku anafazy dla danej komórki. Następnie kontynuuj skanowanie w poszukiwaniu wstępnie dzielących się komórek, aby uzyskać wiele końców dla danego stanu przez okres do 12 godzin od początkowego osiadania. Komórki, które mają się podzielić, mogą być celem przez obecność dwóch centrosomów i nienaruszonego jądra, na co wskazuje załamane światło i ciemniejsza plamka w komórce, gdy patrzy się na nią w kanale alfa tubuliny.

Rozpad otoczki jądrowej można uwidocznić poprzez zanik tej ciemnej plamy, co skutkuje jednolitym zabarwieniem cytoplazmy. Po rozpadzie otoczki jądrowej czas potrzebny każdej komórce na uformowanie wrzeciona oraz na zebranie i segregację chromosomów można zmierzyć, odnotowując punkty czasowe tych zdarzeń w stosunku do rozpadu otoczki jądrowej. Leczenie dwuniciowym RNA ukierunkowanym na shortstop, białko sieciujące mikrotubule aktyny, co do którego podejrzewa się, że wpływa na dynamikę cyklu komórkowego, powoduje znaczne opóźnienie mitotyczne.

Leczenie to powoduje znaczne opóźnienie, w wyniku którego wiele komórek zatrzymuje się w metafazie i nigdy nie przechodzi w anafazę podczas całego dwu- lub trzygodzinnego eksperymentu obrazowania. Jednoczesne traktowanie dwuniciowym RNA przeciwko strzałowi i szorstkiemu, ważnemu składnikowi tego punktu kontrolnego, prowadzi do tłumienia fenotypu zatrzymania, co skutkuje rozpadem otoczki jądrowej do czasów anafazy, podobnie jak w kontrolowanych, nieleczonych komórkach. Upewnij się, że wybrałeś odpowiednie komórki i nie trać czasu na obrazowanie komórek, które nie rozpoczynają podziału.

Jeśli komórka nie zacznie się dzielić w ciągu 20 minut, znajdź inną komórkę. Naukowcy mogą postępować zgodnie z tą procedurą, aby pomóc w identyfikacji nowych regulatorów mitotycznych lub być może nowych suchych związków, które wpływają na określone zdarzenia w podziale komórek.