Pierwotna hodowla neuronów wyizolowanych z embrionalnego móżdżku myszy

Przeprowadzanie eksperymentów in vitro w celu jak najdokładniejszego odzwierciedlenia warunków in vivo nie jest łatwym zadaniem. Zastosowanie pierwotnych kultur komórkowych jest ważnym krokiem w kierunku zrozumienia biologii komórki w całym organizmie. Dostarczony protokół określa, jak skutecznie hodować i hodować embrionalne neurony móżdżku myszy.

Pierwotna hodowla komórek neuronalnych jest idealnym systemem modelowym do badania zdysocjowanych neuronów w kulturze in vitro. Zaletą stosowania tej metody jest możliwość utrzymania cech komórkowych komórek zdysocjowanych, takich jak mechanizmy, funkcje i morfologia w warunkach in vitro przez kilka tygodni, jak najbardziej zbliżonych do warunków in vivo. Umieść okrągłe szkiełka nakrywkowe na 24-dołkowej płytce pod szafką bezpieczeństwa biologicznego.

Dodaj 90 mikrolitrów poli-L-ornityny na każde szkiełko nakrywkowe. Zamknij nakrętkę i delikatnie umieść płytkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na dwa dni. Przygotuj pożywkę hodowlaną i pożywkę wysiewającą i utrzymuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przygotuj roboczy roztwór trypsyny w DMEM/F12 i utrzymuj go w temperaturze czterech stopni. Umieść pożywkę hodowlaną i pożywkę siewną w inkubatorze pod kątem 37 stopni. Wyjąć 24-dołkową płytkę z inkubatora.

Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie wodą podwójnie destylowaną. Pozostaw szkiełka nakrywkowe na co najmniej dwie godziny do całkowitego wyschnięcia. Przygotuj trzy szalki Petriego wypełnione zimnym PBS, trzy szalki Petriego wypełnione zimnym HBSS i pięć szalek Petriego wypełnionych zimnym podłożem preparacyjnym na lodzie.

Wytnij rogi macicy i umyj je trzy razy na lodzie w zimnym PBS. Stąd wszystkie kroki należy wykonywać na lodzie, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek. Po ostatnim etapie mycia oddziel młode od macicy w HBSS i przenieś je do zimnego podłoża preparacyjnego.

W podłożu preparacyjnym odetnij szczenięta nożyczkami. Otwórz calvarium od otworu wielkiego do dolnej granicy jamy oczodołu. Za pomocą cienkich kleszczy usuń podstawę czaszki i oderwij czaszkę od mózgu.

Ostrożnie usuń opony mózgowe móżdżku, zaczynając od bocznej powierzchni środkowej szypułki móżdżku i mostu. Przetnij obie szypułki móżdżku i oddziel móżdżek od reszty mózgu. Pobraną móżdżek należy natychmiast umieścić w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml wypełnionej DMEM/F12 na lodzie.

Odwirować probówkę o masie 1 000 g w temperaturze czterech stopni przez jedną minutę w DMEM/F12. Powtórzyć tę czynność trzy razy, za każdym razem delikatnie usuwając supernatant pipetą i ponownie zawieszając osad w świeżym DMEM/F12. Dodaj dwa mililitry podgrzanej trypsyny i delikatnie odpipetuj pipetę, aby je ze sobą wymieszać.

Umieść rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni na 12 minut. Po inkubacji przenieś probówkę do szafy bezpieczeństwa i dodaj 10 ml DMEM/F12, aby dezaktywować trypsynę. Odwirować mieszaninę o stężeniu 1 200 g przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w świeżej pożywce, a następnie trzykrotnie odwirować. Wstępnie zwilż sterylną plastikową pipetę za pomocą DMEM/F2. Dodaj 3,5 mililitra roztworu roboczego DNAzy do tej samej probówki.

Kilkakrotnie rozcierać tkankę pipetą, aż płyn uzyska jednorodny mleczny kolor. Dodać 10 ml zimnego DMEM/F12 do mieszaniny i przejść do wirówki. Odwirować próbkę o masie 1,200 g w czterech stopniach przez pięć minut.

Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Wyjmij podłoże wysiewające z inkubatora. Dodaj 500 mikrolitrów podgrzanego podłoża wysiewającego i dobrze wymieszaj za pomocą pipety.

Policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową pożywką wysiewającą do gęstości 500 000 komórek na mililitr. Dodaj 90 mikrolitrów mieszaniny do każdego dołka na środku szkiełka nakrywkowego.

Umieść płytkę w inkubatorze pod kątem 37 stopni na trzy do czterech godzin. Po inkubacji dodaj 500 mikrolitrów podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Włożyć płytkę do inkubatora pod kątem 37 stopni.

Po siedmiu dniach zastąp starą pożywkę świeżą pożywką hodowlaną II. Przygotuj oddzielną 24-dołkową płytkę z odpowiednią organizacją numeryczną i dodaj 100 mikrolitrów PFA 4% do każdej studzienki. Po upływie pożądanych dni w hodowli delikatnie usuń szkiełka przykrywkowe z dołków oryginalnej płytki hodowlanej i umieść je w odpowiednich dołkach płytki PFA opisanych w poprzednim kroku. Dodaj PFA do studzienek, aby całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe.

Trzymaj płytkę PFA w temperaturze czterech stopni przez 30 do 120 minut. Po inkubacji przywróć płytkę do temperatury pokojowej. Delikatnie umyj szkiełka nakrywkowe za pomocą PBS przez pięć minut trzy razy.

Rysunek drugi w tekście przedstawia hodowlę komórek móżdżku zaczynającą się od E18. Immunofluorescencja kalbindyny pokazuje neurony Purkinjego z rozszerzeniami aksonalnymi o trzy dni in vitro. Po siedmiu do 10 dniach in vitro widoczne są procesy dendrytyczne.

Po 21 dniach obecne są złożone gałęzie dendrytyczne. Rysunek trzeci w tekście przedstawia hodowle komórek móżdżku rozpoczynające się w różnych dniach embrionalnych. Immunofluorescencyjna detekcja kalbindyny pokazuje neurony Purkinjego z wczesnymi aksonami dopiero po 18 dniach in vitro.

Hodowle neuronów Purkinjego rozpoczęte w E14 i E15 rozwiną dendryty, ale nigdy nie są tak złożone, jak te, które rozwijają się, gdy punktem wyjścia jest E18. Rysunek czwarty w tekście pokazuje, że różne typy komórek rozwijają się z kultur E18 po 21 dniach in vitro. Zielona immunofluorescencja Calbindin pokazuje neurony Purkinjego.

Czerwona immunofluorescencja parwalbuminy w B i C wykazuje interneurony hamujące. Czerwona immunofluorescencja kanału bramkowanego napięciem sodu w E i F pokazuje neurony ziarniste. Obecny protokół jest opłacalny i łatwy do przeprowadzenia.

Pod koniec tego filmu będziesz mógł zebrać i wyhodować neurony móżdżku i naprawić je w pożądanych DIV.