Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Niewydolność serca jest główną przyczyną zgonów zarówno mężczyzn, jak i kobiet na świecie. Nowe dowody sugerują, że zmiany w metabolizmie serca i ogólnoustrojowym przyczyniają się do patologii niewydolności serca. Szybkie określenie, które metabolity wpływają na sprzężenie wzbudzenia-skurczu, nadal stanowi wyzwanie.

Tradycyjne podejście polegające na izolowaniu miocytów serca od dorosłej myszy jest procesem czasochłonnym i wymagającym. Innowacyjna metoda opisana w tym artykule sprawia, że rygorystyczny proces jest bardziej wydajny i łatwiejszy do wykonania. Ponadto, korzystając z sondy fluorescencyjnej, możemy przeprowadzić wiele ocen fenotypowych, w jaki sposób substancje chemiczne mogą indukować toksyczność lub dysfunkcję serca na poziomie komórkowym.

Identyfikując, które cząsteczki zmieniają funkcję miocytów, można zidentyfikować nowe terapie do leczenia niewydolności serca. Korzystając z myszy transgenicznych, możemy badać różne geny, aby określić, które mogą zapobiegać i przyczyniać się do niewydolności serca. Informacje te będą niezbędne w przyszłym leczeniu niewydolności serca.

Procedurę zademonstrują Matthew Klos i uczeń Shreyas Suresh. Na początek rozmrozić działający roztwór lamininy na lodzie. Za pomocą pipety P1000 odessać 200 mikrolitrów lamininy i delikatnie przeciągnąć końcówkę pipety wzdłuż jednej krawędzi wysterylizowanego szkiełka nakrywkowego, aby umożliwić działanie kapilarne w celu wyciągnięcia niewielkiej ilości lamininy w celu ułatwienia mocowania szkiełka nakrywkowego do płytki sześciodołkowej.

Następnie okrężnymi ruchami wyrzuć pozostałą lamininę ze środka szkiełka nakrywkowego. Rozprowadź kroplę lamininy na szkiełku nakrywkowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę i do 24 godzin przed izolacją.

Aby wyizolować miocyty z przygotowanego serca w zimnym KHB-HB, umieść próbkę pod mikroskopem stereoskopowym. Aby zapobiec zatorowości, zagruntuj kaniulę aorty, zanurzając ją w roztworze KHB-HB i używając 20-mililitrowej strzykawki, aby przecisnąć roztwór. Upewnij się, że serce jest zanurzone, a kaniula jest zagruntowana przed wycięciem serca.

Za pomocą 5 kleszczy kaniuluj serce. Potwierdź prawidłowe ułożenie kaniuli, wizualizując końcówkę kaniuli około jednego milimetra powyżej wprowadzenia aorty do komory. Następnie uruchomić przepływ KHB-HB, obracając kran na Langendorfie.

Podłącz kaniulę do Langendorfa, aby perfuzjonować serce przez pięć minut. Następnie obróć kurek, aby przełączyć perfuzję ze zbiornika KHB-HB na zbiornik buforowy wytrawiania. Gdy bufor trawienny dotrze do serca, ustaw timer.

Zebrać perfuzat w sterylnej zlewce o pojemności 100 mililitrów. W razie potrzeby napełnić zbiornik buforowy mineralizacji perfugatem aż do upływu czasu mineralizacji. Po strawieniu, w sterylnej 100-mililitrowej zlewce, oddziel komory serca kleszczami i nożyczkami do tęczówki.

Umieść każdą komorę w osobnym dołku na sześciodołkowej płytce. Wlej pięć mililitrów roztworu kolagenazy do każdej studzienki. Natychmiast użyj nożyczek, aby zmielić tkankę serca na kawałki o objętości około jednego metra sześciennego.

Za pomocą sterylnej pipety transferowej delikatnie rozdrobnić zmieloną tkankę serca za pomocą buforu do wytrawiania. Gdy kawałki tkanki staną się białe i pierzaste, umieść płytkę pod odwróconym mikroskopem, aby zbadać komórki. Jeśli liczba żywotnych komórek jest większa niż 80%, przystąp do przecedzania komórek do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów za pomocą sitka do komórek o średnicy 100 mikronów.

Jeśli liczba żywotnych komórek jest mniejsza niż 80%sprawdź czas potrzebny na kaniulację. Jeśli czas kaniulacji przekracza pięć minut, wypróbuj inne serce. Jeśli nie, przetestuj nowe miejsca kolagenazy w programie pobierania próbek kolagenazy.

Następnie granuluj komórki, odwirowując 215 razy g przez dwie minuty. Pellet powinien być zwarty i nie luźny. Jeśli osad jest luźny, preparat zawiera wiele martwych komórek.

W kapturze do hodowli tkankowej ponownie zawieś kompaktowy osad w 10 mililitrach buforu zatrzymującego. Ponownie zagnieździć komórki, odwirowując 215 razy g przez dwie minuty. Ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach buforu galwanicznego.

Wykonaj liczenie komórek na liczniku cyto i dostosuj objętość buforu do posiewu, aby osiągnąć końcowe stężenie miocytów dwa razy 10 do czterech komórek na mililitr. Teraz wyjmij szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą z inkubatora. Odessać kroplę lamininy, jeśli jest dostępna.

Umieść 200 mikrolitrów zawiesiny miocytów na każdym szkiełku nakrywkowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 21% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla na dwie godziny, aby umożliwić przymocowanie. Po dwóch godzinach wyjmij szkiełka nakrywkowe i odessaj nieprzyłączone komórki.

Dodaj dwa mililitry pożywki hodowlanej i kultury do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez okres do czterech dni. Najpierw usuń składnik A i składnik B z zestawu potencjału membranowego. W stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów połącz 50 mikrolitrów składnika B i pięć mikrolitrów składnika A, aby utworzyć mieszaninę barwników napięciowych.

Wirować do mieszania. Dodaj 10 mililitrów pożywki galwanicznej do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej mieszaninę barwników napięciowych, aby utworzyć mieszaninę barwników o potencjale membranowym. Ponownie, wir do wymieszania.

Następnie wyjmij jedną sześciodołkową płytkę miocytów z inkubatora. Zassać media. Dodaj 800 mikrolitrów mieszaniny barwników o potencjale membranowym do każdego dołka.

Przykryj talerz folią i pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 15 minut. Następnie odessać mieszaninę pożywki barwiącej z każdej studzienki i dodać jeden mililitr zmodyfikowanego roztworu Tyrode'a do każdej studzienki. Przykryj folią.

Włącz sprzęt w kolejności mikroskopu, lampy łukowej, HyperSwitcha, systemu interfejsu fluorescencji, zasilacza MyoCam, stymulatora pola i komputera. Upewnij się, że zestawy filtrów emisji wzbudzenia są odpowiednie dla barwnika obrazowania. Na przykład fura-2 jest wzbudzana przy 340 nanometrach i 380 nanometrach światła.

Emituje światło o długości 510 nanometrów. Fluo-4 i barwnik membranowy napięcia są wzbudzane przy 485 nanometrach światła i emitują przy 520 nanometrach światła. Zalać system nagrywający, włączając podciśnienie, całkowicie otwierając zacisk węża i delikatnie zanurzając każdą 60-mililitrową strzykawkę z roztworem Tyrode'a w kolektorze.

Do zapisów wapnia należy użyć standardowego roztworu Tyrode. Do nagrań napięciowych należy użyć zmodyfikowanego roztworu Tyrode'a. Włącz grzałkę liniową.

Utrzymuj temperaturę tak, aby perfuzat w komorze wynosił 36 plus minus jeden stopień Celsjusza przez co najmniej 15 minut. Następnie otwórz oprogramowanie do akwizycji. Upewnij się, że parametry są ustawione dla właściwego barwnika obrazowego.

Wyłącz stymulator. W ciemności zdjąć folię z płytki sześciodołkowej i umieścić szkiełko nakrywkowe w komorze stymulacji. Umieść płytkę pod mikroskopem i skup się na miocytach za pomocą obiektywu 10X.

Po ustawieniu ostrości rozpocznij stymulację pola od stymulacji pola przy jednym hercu i 0,2 wolta. Stopniowo zwiększaj napięcie, aż do uzyskania stymulacji jeden do jednego. Następnie zwiększaj napięcie, aż zostanie osiągnięty 1,5-krotność progu.

Przełącz się z obiektywu 10X na obiektyw 40X. Skoncentruj się na komórce, która jest zgodna z tempem jeden do jednego. Dostosuj plastikowe rolety tak, aby tylko jedna komórka znajdowała się w polu view.

Korzystając z oprogramowania, umieść pole obszaru zainteresowania na dobrze zdefiniowanych sarkomerach. Uruchom oprogramowanie akwizycyjne, aby zainicjować światło wzbudzenia. Korzystając z filtrów o neutralnej gęstości, odpowiednio dostosuj ustawienie intensywności, aby uzyskać odpowiedni stosunek sygnału do szumu.

W tym miejscu przedstawiono reprezentatywne ślady skracania wapnia i sarkomeru zarejestrowane z miocytów myszy C57BL/6 przy użyciu fury-2. Kwantyfikacja uśrednionych danych zespołowych uzyskanych od myszy C57BL / 6 i ich transgenicznych rodzeństwa z miotu nie wykazuje różnic między grupami, z wyjątkiem czasu relaksacji w tempie 10 Hz. Śledzenie napięcia zarejestrowane z mysiego miocytu C57BL/6 o częstotliwości 10 Hz zostało przetworzone w celu uzyskania użytecznego sygnału.

Uśredniony potencjał czynnościowy zespołu po zastosowaniu dolnoprzepustowego filtra Butterwortha lub filtra cyfrowego Savitzky'ego-Golaya wykazuje subtelne różnice w kształcie potencjałów czynnościowych. Ślady zarejestrowane z miocytów szczurów w tempie jednego herca pokazują, że oprócz tego, że sygnał napięciowy jest niższy niż sygnał wapniowy, kinetyka skurczu jest również inna. Dzieje się tak, ponieważ barwniki wapniowe buforują wapń, podczas gdy barwniki napięciowe nie.

Podobnie jak w przypadku stanu przejściowego wapnia, miocyty wykazywały zależne od stymulacji zmiany w czasie trwania ich optycznego potencjału czynnościowego. Wykazano również infekcjonowane lekami wydłużenie potencjału czynnościowego. Ostatnie 11 sekund z 20-sekundowego nagrania wskazało, że długotrwała ekspozycja miocytów na niebieskie światło prowadzi do wyzwolonej aktywności.

Próbując wykonać tę procedurę, najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest użycie światła o najniższym możliwym natężeniu, aby nie uszkodzić miocytów. Myocyty wyizolowane przy użyciu naszego podejścia mogą być również wykorzystane do immunohistochemii lub przeprowadzone do analizy Western blot. Piękno tej techniki polega na tym, że pozwala ona naukowcom szybko ocenić, w jaki sposób różnorodność cząsteczek i genów pomaga w sprzężeniu wzbudzenia-skurczu przy użyciu jednego systemu.