Pomiar fagocytozy Aspergillus fumigatus Conidia za pomocą ludzkich leukocytów przy użyciu cytometrii przepływowej

Protokół ten jest istotny, ponieważ ilościowo mierzy fagocytozę znakowanych Aspergillus fumigateurs Conidia za pomocą ludzkich leukocytów, wraz z przyłączaniem konidiów do komórek i brakiem interakcji za pomocą cytometrii przepływowej. Główną zaletą tej metody jest to, że ułatwia szybką analizę dużej liczby komórek. Ponadto znakowanie markerów komórkowych pozwala na oddzielną ocenę neutrofili i monocytów w tej samej próbce.

W każdym z tych technik można wykorzystać do analizy innych istotnych klinicznie grzybów, takich jak Mucorales. Zamiast tego czerwone krwinki mogą być używane jako fagocyty. Aby rozpocząć tę procedurę, zwilż ręcznik papierowy środkiem dezynfekującym i umieść go w szafie bezpieczeństwa biologicznego.

Umieść talerz z wyhodowanymi Aspergillus fumigatus na ręczniku papierowym, aby zapobiec nadmiernemu rozprowadzaniu lotnych konidiów. Dodaj 10 mililitrów PBS zawierającego 0,01% detergentu na wierzch grzyba i za pomocą szpatułki Drigalskiego rozprowadź płyn na talerzu i zetrzyj ciemne Conidia. Przenieś zawiesinę Conidia do 50 mililitrów przez sitko o średnicy 30 mikrometrów, które usunie wszelkie pozostałości grzybni.

Dodaj kolejne 10 mililitrów PBS z detergentem do talerza, rozprowadź szpatułką i przenieś do tej samej probówki przez sitko. Następnie należy przygotować sterylny roztwór 0,1-molowego węglanu sodu, rozpuszczony w PBS. I przygotuj 0,1 milimolowy roztwór proszku FITC w tym roztworze węglanu sodu.

Ponownie zawiesić 100 milionów lub mniej Conidia w pięciu mililitrach tego roztworu FITC, w tubie o pojemności 15 mililitrów. Inkubować w rotatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Aby pęcznieć do Conidia, ponownie wymieszaj Conidia oznaczone przez FITC w pięciu mililitrach pożywki RPMI, uzupełnionej 10% FCS.

I inkubować w rotatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez żądany czas. W komorze bezpieczeństwa biologicznego umieść pięć mililitrów kożucha w tubce o pojemności 50 mililitrów. Napełnij probówkę buforem EL i odwróć trzy razy.

Inkubować poziomo przez pięć do ośmiu minut, aż mleczny wygląd mieszaniny stanie się klarowny. Następnie odwirować w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu EL przez pipetowanie.

Dodaj kolejne 24 mililitry buforu EL i kilkakrotnie odwróć rurkę. Wirować w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki RPMI, uzupełnionej 10% FCS.

Na początek przenieś dwa miliony leukocytów i cztery miliony konidiów znakowanych FITC w 1,5 mililitra RPMI uzupełnionego 10% FCS na 12-dołkową płytkę hodowlaną. Uwzględnij kontrolę tylko komórek bez konidiów i kontrolę komórek z nieoznakowanymi konidiami. Inkubuj płytkę w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez żądany czas.

Po zakończeniu inkubacji użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki i przenieś je do probówki o pojemności 15 mililitrów. Najpierw umieść 100 mikrolitrów każdej próbki i kontroli w jednym dołku 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Dodać 150 mikrolitrów PBS zawierających dwa milimole EDTA do przemycia.

Aby wyrównać kolor, umieść milion komórek bez konidiów dla każdego koloru w innych dołkach płytki. Dołącz studzienkę komórek, które pozostaną nienapięte. Dodać 150 mikrolitrów PBS zawierających dwa milimole EDTA do każdej studzienki w celu przemycia.

Następnie przykryj płytkę folią samoprzylepną i odwiruj w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie usuń folię i wyrzuć supernatant, szybko i mocno odwracając talerz tylko raz nad zlewem lub jednorazowym ręcznikiem papierowym. Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach mieszanki przeciwciał i dobrze wymieszać przez pipetowanie.

W celu kompensacji koloru ponownie zawieś odpowiednie komórki w 100 mikrolitrach PBS zawierających dwa milimole EDTA i dodaj pojedynczy typ przeciwciała do każdej studzienki, w takiej samej ilości, jaką zastosowano w mieszaninie przeciwciał. Przykryj folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut. Następnie usuń folię i dodaj 150 mikrolitrów PBS zawierających dwa milimolowe EDTA do każdej studzienki w celu umycia.

Ponownie przykryj płytkę folią samoprzylepną. Wirować w temperaturze 300 razy G i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie usuń folię i wyrzuć supernatant, szybko i mocno odwracając płytkę nad zlewem lub jednorazowym ręcznikiem papierowym.

Ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach PBS zawierających 2 milimolowe EDTA i przenieść zawiesinę komórek z każdej studzienki do oddzielnej probówki z okrągłym dnem. Uruchom cytometr przepływowy i pozwól mu się rozgrzać. W oprogramowaniu do akwizycji utwórz nowy eksperyment, a następnie skonfiguruj i oznacz nowe próbki.

Ustaw parametry i detektory dla odpowiednich fluoroforów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tym oprogramowaniu wyświetl odpowiednie wykresy punktowe, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Używając tylko próbki komórek, pozyskaj kilka komórek i ustaw bramę wokół leukocytów.

Na podstawie bramki leukocytów, bramki dla komórek CD45 dodatnich, w celu oddzielenia się od konidiów na poletku SSC CD45. Na wykresie kropkowym CD14, CD66b, bramki neutrofili i monocytów oddzielnie. Następnie zmień próbkę z samych komórek na nieoznakowane konidia.

Na wykresie kropkowym anty-FITC, APC FITC, wyświetlają neutrofile w ustalonych kwadrantach dla sygnałów anty-FITC i FITC. Otwórz widok statystyk i dostosuj ćwiartki, dopuszczając maksymalnie 1% komórek w kwadrantach Q1, Q2 i Q4. Powtórz ten proces dla bramki monocytów. W bramce leukocytów zapisz wszystkie próbki z co najmniej 20 000 zdarzeń.

Fagocytozę konidiów znakowanych FITC przez ludzkie neutrofile można odczytać z widoków statystycznych. W tym badaniu zastosowano metodę cytometrii szybkiego przepływu do pomiaru interakcji Aspergillus fumigateurs Conidia z dużą liczbą pierwotnych leukocytów ludzkich. Stosując odpowiednie przeciwciała i przedstawioną tutaj strategię bramkowania, po ogólnym bramkowaniu ludzkich leukocytów według cech FSC i SSC, następuje oddzielenie leukocytów w wolnych konidiach za pomocą markera panleukocytów, CD45.

Konidia mogą osiągnąć prawie wielkość komórki w czasie cytometrii przepływowej, zwłaszcza przy użyciu spuchniętych konidiów i/lub długich czasów inkubacji, a tym samym mogą kupić nam analizę. Ponieważ ludzkie pierwotne monocyty i neutrofile w różny sposób przyjmują konidia, protokół ten pozwala na oddzielną analizę tej populacji komórek w oparciu o barwienie dobrze znanymi markerami linii komórkowej, CD14 dla monocytów i CD66b dla neutrofili. Odsetek ludzkich pierwotnych fagocytów internalizujących konidia może być bardzo zmienny wśród dawców krwi, ale zależy również od czynników eksperymentalnych, takich jak czas inkubacji i stan pęcznienia konidiów.

Internalizacja zarodników może być wykryta po 0,5 godziny wspólnej inkubacji i zwiększa się z czasem. Wstępnie spuchnięte konidia są łatwiej pobierane niż zarodniki spoczynkowe, nawet w krótkim czasie inkubacji. Jeśli konidia są utrwalane formaldehydem, fagocytoza jest zmniejszona w porównaniu z natywnymi konidiami.

Po tej procedurze supernatanty współinkubowanych komórek odpornościowych i konidiów mogą być zbierane i analizowane przez Elizę w celu sprawdzenia, czy interakcja wywołuje uwalnianie cytokin przez komórki odpornościowe. Należy pamiętać, że ludzka krew może potencjalnie przenosić choroby zakaźne. Praca ta wymaga szczepień przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, korzystania z szafki bezpieczeństwa biologicznego, a także noszenia rękawiczek przy fartuchu laboratoryjnym.