Name: Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Poznaj metodę augmentacji indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita za pomocą inżynieryjnych komórek dendrytycznych. Ta technika działa w stanach zapalnych i ma zastosowanie terapeutyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Biuro Asystenta Sekretarza Obrony ds. Zdrowia poprzez Recenzowany Program Badań Medycznych pod numerem nagrody W81XWH-15-1-0240 (XT). Opinie, interpretacje, wnioski i zalecenia są opiniami autora i niekoniecznie są zatwierdzone przez Departament Obrony. Prace te były również częściowo wspierane przez granty na innowacje badawcze z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Loma Linda (681207-2967 [XT i GG], 681205-2967 [XT] i 325491 [DJB]).

Wszystkie protokoły badań na zwierzętach in vivo zostały przejrzane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Loma Linda (IACUC) oraz Biuro Przeglądu Opieki i Użytkowania Zwierząt (ACURO) Dowództwa Badań Medycznych i Materiałowych Armii Stanów Zjednoczonych (USAMRMC) Departamentu Obrony.
1. Przygotowanie lentiwirusa, który wyraża zarówno 1α-hydroksylazę, jak i RALDH2 (wirus lenti-CYP-ALDH)
<ol>
	<li>Dzień 0: Wczesnym rankiem przygotuj 5 x 105 komórek/ml komórek 293T w pożywce do hodowli komórkowych CM-10-D.</li>
	<li>Wysiewaj 20 ml / talerz w szalkach hodowlanych 150 mm x 25 mm. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny. Konfluencja osiągnie ~80–90% po 24 godzinach.</li>
	<li>Dzień 1: Wykonaj 2x HBS (50 mM HEPES, 280 mM NaCl i 1,5 mM Na2HPO4, pH 7,1). Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Zrobić 2 M CaCl2 i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dla każdej płytki hodowlanej o wymiarach 150 mm x 25 mm należy przygotować mieszaninę do wytrącania DNA w sterylnej probówce hodowlanej o pojemności 50 ml. Najpierw dodaj 1,620 μl 2x HBS, 9,5 μg PMD2G (VSVG), 17,5 μg pCMVR8,74 (kapsyd), 27 μg plazmidu Lenti-CYP-ALDH (wektor lentiwirusowy, który przenosi zarówno CYP27B1, jak i ALDH1a2). Po drugie, dodajH2Odo końcowej objętości 3 037,5 μL.</li>
	<li>Na koniec dodać kroplami 202,5 μl 2 M CaCl2, mieszając roztwór do końcowych stężeń 1x HBS i 125 mM CaCl2. CaCl2 musi być ostatnim, który ma być dodany. Mieszaniny transfekcji pozostawić w temperaturze pokojowej na 20 minut, od czasu do czasu mieszając. W przypadku wielu naczyń hodowlanych o wymiarach 150 mm x 25 mm należy odpowiednio zwiększyć skalę.</li>
	<li>Dodać kroplami 3,240 μl mieszaniny do wytrącania DNA do jednej szalki hodowlanej o wymiarach 150 mm x 25 mm zawierającej komórki 293T. Delikatnie obracaj szalkę hodowlaną z boku na bok, dodając mieszaninę do wytrącania DNA. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Dzień 2: Usuń roztwór transfekcji fosforanu wapnia, delikatnie przemyj 1x PBS i ponownie nakarm hodowlę komórkową pożywką do hodowli komórkowych CM-4-D. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Dzień 3: Zebrać supernatanty w sterylnych butelkach do przechowywania i przechowywać w temperaturze 4–8 °C. Uzupełnić hodowlę komórkową świeżą pożywką do hodowli komórkowych CM-4-D. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Dzień 4: Zbierz supernatanty do sterylnych butelek do przechowywania. Przefiltrować supernatanty z dnia 3 i dnia 4 przez filtr 0,45 μm. W celu zagęszczenia wirusa pseudotypu VSVG należy przenieść supernatanty do probówek wirówkowych i wirować w temperaturze 4,780 x g przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dzień 5: Odlać supernatanty z granulek (osad jest często widoczny) i pozostawić probówki do spłynięcia na ręczniku papierowym w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przez kilka minut.</li>
	<li>Zawiesić granulki przez pipetowanie sterylnym PBS zawierającym 5% glicerolu. Objętość do ponownego zawieszenia wyniesie 33,3 μl na naczynie hodowlane o wymiarach 150 mm x 25 mm.</li>
	<li>Podwielokrotność 200 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C. Sporządzić oddzielną porcję 50 μl/fiolkę do celów miareczkowania. Miana powinny mieścić się w zakresie 10,8–10,9 jednostek przetwornikowych (TU)/ml.</li>
	<li>Dodaj wybielacz do naczyń hodowlanych i wyrzuć je. 
	UWAGA: Te transfekowane komórki stanowią największy problem dotyczący bezpieczeństwa w protokole, ponieważ wszystkie elementy lentiwirusowe ulegają ekspresji w komórkach.</li>
</ol>
2. Generowanie prądów stałych pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC)
<ol>
	<li>Zbierz piszczele i kości udowe od 4-5 myszy Balb/c do sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml zawierającej pożywkę hodowlaną6.</li>
	<li>Przenieść piszczele i kości udowe do naczynia hodowlanego o wymiarach 100 mm x 20 mm zawierającego pożywkę. Usuń tkanki, takie jak mięśnie, z piszczeli i kości udowych za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy.</li>
	<li>Odetnij oba końce piszczeli i kości udowych, aby odsłonić jamę szpiku kostnego.</li>
	<li>Pobrać 10 ml pożywki hodowlanej do strzykawki o pojemności 10 ml dołączonej do igły 30 G.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić igłę do jamy szpiku kostnego i przepłukać szpik kostny do czystej sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby powtórz tę procedurę, aby upewnić się, że szpik kostny został całkowicie wypłukany.</li>
	<li>Komórki szpiku kostnego osadzać przez odwirowanie (400 x g) w temperaturze 2–8 °C przez 5 minut. Odessać supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad z 5 ml 1x buforu do lizy czerwonych krwinek.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 4–5 minut, od czasu do czasu wstrząsając.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 30 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Osadzać komórki przez odwirowanie (400 x g) w temperaturze 2–8 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych CM-10-R. W razie potrzeby ogniwa można przepuścić przez sitko o średnicy 40 μm w celu usunięcia zanieczyszczeń.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek i dostosuj komórki do 1 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki do hodowli komórkowych CM-10-R.</li>
	<li>Dodaj rekombinowany mysi czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów/makrofagów (GM-CSF, stężenie końcowe = 100 U/ml) i mysią interleukinę-4 (IL-4, stężenie końcowe = 10 U/ml). 
	UWAGA: Roztwory podstawowe GM-CSF i IL-4 są przechowywane w temperaturze -80 °C odpowiednio 100 000 U/ml (1 000x) i 10 000 U/ml (1 000x).</li>
	<li>Rozprowadzić komórki na 6-dołkowych płytkach hodowlanych w temperaturze 4 ml/basenik i hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Usunąć nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
	<li>Dodać świeżą pożywkę do hodowli komórkowych CM-10-R zawierającą GM-CSF (100 U/ml) i IL-4 (10 U/ml). Hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.</li>
	<li>Pobranie komórek nieprzylegających (BMDC) w celu transdukcji przez wirusa lenti-CYP-ALDH.</li>
</ol>
3. Transdukcja DC wirusem lenti-CYP-ALDH w celu wytworzenia komórek DC-CYP-ALDH
<ol>
	<li>Przygotować 1 x 106 DCs/basenik w całkowitej objętości 0,5 ml pożywki do hodowli komórkowej CM-10-R zawierającej 50 μl wirusa i 8 μg/ml protaminy na 6-dołkowej płytce hodowlanej.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Zastąp pożywkę świeżą pożywką do hodowli komórkowych CM-10-R i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez kolejne 24 godziny. W tym momencie można ocenić aktywność enzymatyczną 1α-hydroksylazy i RALDH2 (patrz krok 4). W razie potrzeby powtórz kroki 3.1–3.3 dla drugiej transdukcji.</li>
	<li>Dodać lipopolisacharyd (100 ng/ml) i hodować komórki przez 24 godziny.</li>
	<li>Zbierz komórki (komórki DC-CYP-ALDH) do eksperymentów.</li>
</ol>
4. Ocena nadekspresji 1α-hydroksylazy i RALDH2 w komórkach DC-CYP-ALDH
<ol>
	<li>Ocena nadekspresji 1α-hydroksylazy w komórkach DC-CYP-ALDH
	<ol>
		<li>Zasiew 1,0 x 106 komórek DC-CYP-ALDH / basenik w 2 ml pożywki do hodowli komórkowych CM-10-R na 12-dołkowych płytkach hodowlanych.</li>
		<li>Dodać 25(OH)D do końcowego stężenia 2,5 μM. Inkubować komórki DC-CYP-ALDH przez 24 godziny.</li>
		<li>Zebrać supernatanty i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Oznaczenie stężenia 1,25(OH)2D w supernatantach przy użyciu dostępnego w handlu testu radioimmunologicznego (RIA) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Określ ekspresję 1α-hydroksylazy w komórkach DC-CYP-ALDH przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu przeciwciała anty-CYP27B1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena nadekspresji RALDH2 w komórkach DC-CYP-ALDH 
	UWAGA: Ekspresję i aktywność nadekspresji RALDH2 określa się za pomocą dostępnego w handlu zestawu do wykrywania dehydrogenazy aldehydowej (ALDH) (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Zasiew: 1 ml DC-CYP-ALDH lub komórek kontrolnych (1 x 105 komórek/ml w buforze testowym) w każdej z dwóch probówek o pojemności 5 ml (jedna oznaczona jako "Kontrola", a druga oznaczona jako "Test").</li>
		<li>Dodać 10 μl roztworu aldehydu dietyloaminobenzynowego (DEAB) (1,5 mM w 95% etanolu) do każdej z probówek kontrolnych i natychmiast wymieszać. DEAB jest inhibitorem RALDH2.</li>
		<li>Dodać 5 μl aktywowanego substratu fluorescencyjnego RALDH (300 μM) do probówki kontrolnej i testowej i natychmiast wymieszać.</li>
		<li>Inkubować probówki przez 45 minut.</li>
		<li>Osadzać komórki przez odwirowanie w sile 400 x g w temperaturze 2–8 °C przez 5 minut. Odessać supernatanty.</li>
		<li>Rozpuść komórki w 200 μl buforu do oznaczania.</li>
		<li>Trzymaj komórki na lodzie i przystąp do analizy za pomocą FACS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923578">Inflammatory bowel disease.</a> New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li>
<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20192811">Inflammatory bowel disease.</a> Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).</li>
<li>Clifford, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natalizumab-associated+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+patients+with+multiple+sclerosis%3A+lessons+from+28+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases.</a> Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).</li>
<li>Linda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+multifocal+leukoencephalopathy+after+natalizumab+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy.</a> New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).</li>
<li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Generation+of+Gut-Homing+Regulatory+T+Cells+for+the+Suppression+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis.</a> Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cell+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cell memory.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).</li>
<li>Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+of+tolerance+and+induction+of+regulatory+T+cells+by+erythrocyte-targeted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens.</a> Science Report. 5, 15907(2015).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+inhibitory+activity+of+regulatory+T+cells+requires+the+transcription+factor+Helios%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios.</a> Science. 350 (6258), 334-339 (2015).</li>
<li>Bhela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plasticity+and+Stability+of+Regulatory+T+Cells+during+Viral-Induced+Inflammatory+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions.</a> Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).</li>
<li>Marek-Trzonkowska, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+of+type+1+diabetes+with+CD4%28%2B%29CD25%28high%29CD127-regulatory+T+cells+prolongs+survival+of+pancreatic+islets+-+results+of+one+year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up.</a> Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).</li>
<li>Desreumaux, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+antigen-specific+regulatory+T-cell+therapy+for+patients+with+refractory+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).</li>
<li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).</li>
<li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood%3A+safety+profile+and+detection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).</li>
<li>Kang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C25-Dihyroxyvitamin+D3+promotes+FOXP3+expression+via+binding+to+vitamin+D+response+elements+in+its+conserved+noncoding+sequence+region%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).</li>
<li>Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+Vitamin+D+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis.</a> Brain. 132, Pt 5 1146-1160 (2009).</li>
<li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li>
<li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+dendritic+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li>
<li>Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR5+ligation+by+flagellin+converts+tolerogenic+dendritic+cells+into+activating+antigen-presenting+cells+that+preferentially+induce+T-helper+1+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses.</a> Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).</li>
<li>Danova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%2C+p38+MAPK%2C+ERK1%2F2%2C+mTOR%2C+STAT3+and+increased+glycolysis+regulate+stability+of+paricalcitol%2Fdexamethasone-generated+tolerogenic+dendritic+cells+in+the+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment.</a> Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).</li>
<li>Liu, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+triggering+of+a+vitamin+D-mediated+human+antimicrobial+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response.</a> Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).</li>
<li>Cao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+vitamin+D+and+vitamin+D+analogs+in+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia.</a> Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).</li>
<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lasting+Impact+of+Clostridium+difficile+Infection+in+Inflammatory+Bowel+Disease%3A+A+Propensity+Score+Matched+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Disease%22%5BJournal%5D)">Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis.</a> Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).</li>
<li>Tsai, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Aneuploidy+and+Flat+Dysplasia+With+Development+of+High-Grade+Dysplasia+or+Colorectal+Cancer+in+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+molecular+imaging+with+sodium+iodide+symporter+and+enhanced+firefly+luciferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes.</a> Science Reports. 5, 9865(2015).</li>
<li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li>
<li>Okada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+route-dependent+vaccine+efficiency+of+murine+dendritic+cells+pulsed+with+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens.</a> British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).</li>
<li>Li, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen%2C+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li>
<li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn%27s+Disease+in+Remission%3A+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Disease+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li>
<li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers%2C+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li>
<li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li>
<li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li>
<li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing%2C+IL-10-producing+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li>
</ol>

Doktorzy Xiaolei Tang i David J. Baylink są wynalazcami oczekującego patentu związanego z tym badaniem.

W tym artykule opisujemy zastosowanie komórek DC-CYP-ALDH do zwiększania indukcji komórek Treg naprowadzających się na jelita w obwodowych tkankach limfatycznych. Nasze dane wykazały, że komórki DC-CYP-ALDH mogą syntetyzować lokalnie wysokie stężenia de novo zarówno 1,25(OH)2D, jak i RA in vitro w obecności odpowiednich substratów (tj. odpowiednio 25[OH]D i retinolu). Ponieważ wystarczające stężenie 25(OH)D i retinolu we krwi można łatwo osiągnąć poprzez suplementację witaminą D i A odpowiednio u pacjentów z n...

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) jest przewlekłą chorobą zapalną przewodu pokarmowego (GUT). W Stanach Zjednoczonych jest około 1,4 miliona pacjentów z IBD. Ogólnie przyjmuje się, że rozregulowana odpowiedź immunologiczna na bakterie jelitowe inicjuje chorobę i narusza barierę nabłonkową błony śluzowej1,2. Z tego powodu obecnie dostępne leki zatwierdzone przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) hamują funkcje mediatorów stanu zapalnego lub blokują naprowadzanie komórek odpornościowych do jelit. Jednak mediatory stanu zapalnego i komórki odpornościowe, które są celem ataku, są również niezbędne do obrony immunologicznej. W rezultacie, inhibitory mediatorów stanu zapalnego osłabiają ogólnoustrojową obronę immunologiczną, a blokery naprowadzania komórek odpornościowych osłabiają obronę immunologiczną jelit, co może prowadzić do poważnych konsekwencji3,4. Ponadto blokery naprowadzania komórek odpornościowych mogą również blokować naprowadzanie regulatorowych komórek T (Treg) do jelita, a tym samym mogą pogorszyć i tak już upośledzoną tolerancję immunologiczną jelit u pacjentów z IBD. Co więcej, blokowanie naprowadzania komórek Treg do jelit może również prowadzić do ogólnoustrojowej supresji immunologicznej z powodu akumulacji komórek Treg w klasie krew<sup="xref">5. Wreszcie, inhibitory i blokery działają przejściowo i dlatego wymagają częstego podawania. Częste podawanie tych inhibitorów i blokerów może dodatkowo nasilić niepożądane działania niepożądane.
Niedawno zaproponowaliśmy nową strategię, która może potencjalnie złagodzić lub nawet wyeliminować skutki uboczne związane z obecnymi lekami do leczenia IBD6. Strategia ta zwiększa indukcję komórek Treg naprowadzających się na jelita w obwodowych tkankach limfatycznych6. Uzasadnieniem tej strategii jest to, że komórki Treg naprowadzające się na jelita są specyficznie domem dla jelit, a zatem nie zagrażają ogólnoustrojowej obronie immunologicznej. Ponadto, ponieważ komórki Treg mogą potencjalnie tworzyć memory7,8, komórki Treg naprowadzające się na jelita mogą potencjalnie zapewnić stabilną kontrolę przewlekłego zapalenia jelit u pacjentów z IBD, a zatem leczenie nie powinno być konieczne tak często. Ponadto, ponieważ strategia ta zwiększa indukcję komórek Treg naprowadzających się na jelita in vivo, nie ma obaw o niestabilność in vivo w wysoce prozapalnym środowisku, które jest związane z adoptywnym transferem komórek Treg generowanych in vitro9,10. W związku z tym komórki Treg generowane in vitro są jedną z proponowanych strategii leczenia chorób autoimmunologicznych11,12,13 i odrzucenie przeszczepu14,15. Wreszcie, w tej strategii, komórki dendrytyczne (DC) są modyfikowane tak, aby wytwarzały lokalnie wysokie stężenia dwóch cząsteczek de novo: aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA). Wybraliśmy 1,25(OH)2D i RA, ponieważ 1,25(OH)2D może indukować ekspresję cząsteczek regulatorowych (np. skrzynka widłowa P3 [foxp3] i interleukina-10 [IL-10])16,17 i że RA może stymulować ekspresję receptorów naprowadzających się na jelita w komórkach T18. Ponieważ zarówno 1,25(OH)2D, jak i RA mogą również tolerować DCs28,29, uważamy, że zmodyfikowane DC będą stabilnie utrzymywane w stanie tolerancji in vivo, a tym samym omijają problemy związane z niestabilnością in vivo, które są związane z tolerogennymi DC generowanymi in vitro (TolDCs)19,20,21. Pod tym względem TolDC są również jedną z proponowanych strategii zwiększania in vivo funkcji komórek Treg19,20,21. Aby poprzeć nasze rozumowanie, wykazaliśmy, że zmodyfikowane DC, po dostarczeniu in vivo, mogą zwiększyć indukcję komórek Treg naprowadzających się na jelita w obwodowych tkankach limfoidalnych6.
Dodatkowym atutem proponowanej przez nas strategii jest to, że 1,25(OH)2D ma również inne funkcje, które mogą potencjalnie przynieść korzyści pacjentom z IBD. Te inne funkcje obejmują zdolność 1,25(OH)2D do stymulowania wydzielania środków przeciwdrobnoustrojowych22 oraz do hamowania rakotwórczości23. Infekcje i nowotwory są często związane z IBD24,25.
Aby wygenerować DC, które mogą wytwarzać lokalnie wysokie stężenia zarówno 1,25(OH)2D, jak i RA de novo, używamy wektora lentiwirusowego do inżynierii DC w celu nadekspresji dwóch genów. Jednym z nich jest cytochrom P450 z rodziny 27 podrodziny B 1 (CYP27B1), który koduje 25-hydroksywitaminę D 1α-hydroksylazę (1α-hydroksylazę), która fizjologicznie katalizuje syntezę 1,25(OH)2D. Drugim genem jest dehydrogenaza aldehydowa 1 należąca do rodziny A2 (ALDH1a2), która koduje dehydrogenazę retinaldehydu 2 (RALDH2), która fizjologicznie katalizuje syntezę RA6.
Ponieważ in vivo augmentacja indukcji komórek Treg naprowadzających jelita jest potencjalnie ważna w leczeniu IBD, w poniższym protokole szczegółowo opiszemy procedury generowania 1α-hydroksylazy-RALDH2-nadekspresji komórek DC (DC-CYP-ALDH), które mogą być wykorzystane do przyszłego badania komórek Treg naprowadzających się w jelitach in vivo.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 03-377-23</td><td></td></tr><tr><td>Szalki hodowlane 100 mm x 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki hodowlane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane 150 mm x 25 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430559</td><td></td></tr><tr><td>25-hydroksycholekalcyferol (25[OH]D)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# H4014</td><td></td></tr><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ALDEFLUOR</td><td>Stemcell Technologies</td><td>Cat# 01700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CYP27B1</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab95047</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1016</td><td></td></tr><tr><td>CM-10-D Pożywka</td><td></td><td></td> do hodowli komórkowych <td>DMEM zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 mU/ml penicyliny/streptomycyny, 0,055 mM 2-merkaptoetanolu (2-ME), 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasów endogennych i 2 mM L-glutaminy.</td></tr><tr>Pożywka <td></td><td></td><td>do hodowli komórkowych CM-10-R</td><td>Pożywka RPMI 1640 (bez glutaminy) zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 0,055 mM 2-merkaptoetanolu (2-ME), 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasu endogennego i 2 mM L-glutaminy.</td></tr><tr>Pożywka <td></td><td></td><td>do hodowli komórkowych CM-4-D</td><td>Pożywka DMEM zawierająca 4% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 0,055 mM 2-merkaptoetanolu (2-ME), 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasu endogennego i 2 mM L-glutaminy.</td></tr><tr><td>Butelkowe filtry próżniowe Corning, 0,22 mM, 500 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430513</td><td></td></tr><tr><td>Filtry próżniowe butelkowe Corning, 0,45 mM, 500 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# CLS430514</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 08-940</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>Cat# 11960044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica</td> <td>bydlęcaKleszcze do</td><td>16000044</td><td></td>ThermoFisher Scientific Cat#</tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący Gibco ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G5516</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore</td><td>Cat# 391340</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-CYP-ALDH</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>cDNA myszy CYP27B1 1,6 kb i ALDH1a2 amplifikowano metodą PCR przy użyciu plazmidu zawierającego odpowiednio CYP27B1 cDNA i plazmidu zawierającego cDNA ALDH1a2 (GeneCopoeia). Amplifikowany fragment cDNA CYP27B1 z sekwencją wejściową rybosomu 5' KOZAK sklonowano do wektora lentiwirusowego pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE (Addgene). Otrzymany w ten sposób konstrukt został oznaczony jako lenti-CYP-GFP. Amplifikowany fragment cDNA ALDH1a2 został sklonowany do lenti-CYP-GFP w celu zastąpienia GFP i został oznaczony jako lenti-CYP-ALDH. Ten plazmid dwulicowy ulega ekspresji CYP27B1 kontrolowany przez promotor SFFV i ALDH1a2 kontrolowany przez promotor PGK.</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L3755</td><td></td></tr><tr><td>Murine GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 315-03</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-4</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 214-14</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# NIST2186II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S9888</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 14-841-02</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>pCMVR8.74</td><td></td><td>Addgene Plasmid# 22036</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#15140148</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór fosfatu ( PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 20012027</td><td></td></tr><tr><td>PMD2G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid# 12259</td><td></td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa, 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12500</td><td></td></tr><tr><td>Probówka polipropylenowa, 50 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# AM12502</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P3369</td><td></td></tr><tr><td>Królik poliklonalna kontrola izotypu IgG</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab171870</td><td></td></tr><tr><td>Test radioimmunologiczny do pomiaru 1,25(OH)2D</td><td>Testy</td><td></td><td></td>Heartland</tr><tr><td>Pożywka RPMI 1640, bez glutaminy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 21870076</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#:</td> Wirówka 11360070 <td></td>Sorvall</tr><tr><td>Legend XTR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 75004521</td><td></td></tr><tr><td>Sitka sterylne komórkowe, 40 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 07-201-430</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne butelki do przechowywania, 500 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# CLS431432</td><td></td></tr></tbody></table>

augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów t naprowadzających się na jelita

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) jest przewlekłą chorobą zapalną przewodu pokarmowego (GUT). W Stanach Zjednoczonych jest około 1,4 miliona pacjentów z IBD. Ogólnie przyjmuje się, że rozregulowana odpowiedź immunologiczna na bakterie jelitowe inicjuje chorobę i narusza barierę nabłonkową błony śluzowej. Niedawno wykazaliśmy, że limfocyty T regulatorowe (Treg) naprowadzające się w jelitach są obiecującą terapią IBD. W związku z tym w artykule przedstawiono protokół augmentacji in vivo indukcji komórek Treg naprowadzających się na jelita. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby wytwarzały lokalnie wysokie stężenia dwóch cząsteczek de novo, aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA). Wybraliśmy 1,25(OH)2D i RA na podstawie wcześniejszych ustaleń pokazujących, że 1,25(OH)2D może indukować ekspresję cząsteczek regulatorowych (np. P3 i interleukiny-10) i że RA może stymulować ekspresję receptorów naprowadzających się na jelita w komórkach T. Aby wygenerować takie zmodyfikowane komórki dendrytyczne, używamy wektora lentiwirusowego do transdukcji komórek dendrytycznych w celu nadekspresji dwóch genów. Jednym z nich jest cytochrom P450 z rodziny 27 podrodzina B 1, który koduje 25-hydroksywitaminę D 1α-hydroksylazę, która fizjologicznie katalizuje syntezę 1,25(OH)2D. Drugim genem jest dehydrogenaza aldehydowa 1 z rodziny A2, która koduje dehydrogenazę retinaldehydu 2, która fizjologicznie katalizuje syntezę RZS. Protokół ten może być wykorzystany do przyszłych badań komórek Treg naprowadzających jelita in vivo.

Komórki DC-CYP-ALDH wykazywały znacząco zwiększoną ilość 1α-hydroksylazy. Aby ustalić, czy komórki DC-CYP-ALDH wygenerowane z BMDC wykazują znacząco zwiększoną ilość 1α-hydroksylazy, BMDC poddano transdukcji wirusem lenti-CYP-ALDH w celu otrzymania komórek DC-CYP-ALDH pochodzących z szpiku kostnego (komórki BMDC-CYP-ALDH). Następnie ekspresję 1α-hydroksylazy w komórkach BMDC-CYP-ALDH zbadano za pomocą FACS. Nasze dane wykazały, że komórki BMDC-CYP-ALDH w porównaniu do rodzicielskich BMDC wykazywały zwięk...

Tutaj prezentujemy protokół do indukcji indukcji regulatorowych limfocytów T in vivo. W tym protokole komórki dendrytyczne są modyfikowane tak, aby lokalnie wytwarzały wysokie stężenia aktywnej witaminy D (1,25-dihydroksywitaminy D lub 1,25[OH]2D) i aktywnej witaminy A (kwas retinowy lub RA) de novo.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Protokół ten opisuje potencjalnie nowatorską strategię terapeutyczną, którą można łatwo zmodyfikować do zastosowań u ludzi. Technika ta bezpośrednio zwiększa indukcję regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita w obwodowych tkankach limfatycznych i może być stabilnie wdrażana nawet w wysoce prozapalnych środowiskach. Techniki te mogą być również wykorzystane do zbadania roli aktywnej witaminy D i witaminy A w obwodowym układzie odpornościowym.Ta wizualna demonstracja dostarczy instrukcji krok po kroku dotyczących generowania wysokiej jakości inżynieryjnych komórek dendrytycznych, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia tej techniki. Zacznij od wysiewu jednego razy 10 do siedmiu komórek 293T w 20 mililitrach pożywki do hodowli komórkowych CM-10-D na płytkach hodowlanych o wymiarach 150 na 25 milimetrów na 24-godzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia dodaj 1,62 mililitra świeżo przygotowanego dwukrotnie stężonego roztworu HBS, 9,5 mikrograma plazmidu otoczkowego, 17,5 mikrograma plazmidu opakowaniowego i 27 mikrogramów plazmidu LENTI-CYP-ALDH do 50-mililitrowej probówki stożkowej.Doprowadzić końcową objętość zawart

in-vivo-augmentation-of-gut-homing-regulatory-t-cell-induction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Eksperymenty z konkurencyjnym homingiem pozwalają na bezpośrednią ocenę właściwości migracyjnych dwóch różnych populacji komórek u jednej myszy. W niniejszym materiale ilustrujemy tę procedurę, porównując migrację limfocytów T o tropizmie jelitowym i nietropowym generowanych ex vivo.

Konkurencyjne testy homingu w celu badania migracji limfocytów T tropujących do jelit

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Poznaj metodę augmentacji indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita za pomocą inżynieryjnych komórek dendrytycznych. Ta technika działa w stanach zapalnych i ma zastosowanie terapeutyczne.

Augmentacja in vivo indukcji regulatorowych limfocytów T naprowadzających się na jelita

Przeglądaj więcej filmów